CN109096385A - 一种生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物活性肽及其制备方法和应用，该生物活性肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；该生物活性肽分子量小，溶解度高，能够消除人体内产生的氧化应激因子，而且能够抑制肿瘤细胞增值，加快肿瘤细胞的凋亡速度。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，具体而言，涉及一种生物活性肽及其制备方法 和应用。
背景技术
氧化反应对于人体来说是至关重要的，自由基和活性氧引起了一系列 的氧化反应。当过量的自由基形成，它们会超过保护性酶如超氧化物歧化 酶、过氧化氢酶的保护作用，从而导致脂质氧化、细胞凋亡等一系列的副 作用产生。这一类的氧化反应对人体的健康造成了一定的危害，如风湿性 关节炎、糖尿病、动脉硬化等。此外，Collins等人2005年研究发现癌症的 发生也与DNA的氧化损伤有关。
目前，人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基 -4-甲基苯酚(BHT)被运用到食品中，作为脂质的抗氧化剂，但这些人工合 成的添加剂对于人体都有潜在的风险。在天然抗氧化剂的研究过程中，来 源于食物蛋白的抗氧化肽成为了热门研究，其不仅安全性高，比蛋白质等 大分子营养物质更容易被吸收利用。
生物活性肽是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化 合物，是一类相对分子质量小于6000Da，具有多种生物学功能的多肽。
目前，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的生物活性，食 物中的蛋白质在被动物消化吸收利用过程中，会变为多肽或者游离的氨基 酸，通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入动物的血液循环。在这些多肽 中，有一部分具有特殊的生理功能，例如促进免疫、激素调节、抗菌、抗 病毒、降血压、降血脂等功能，被称为“生物活性肽”。如玉米短肽、大 豆肽、牛乳多肽等。生物活性肽的大量发现逐渐被人们所认识，加之已开 发或潜在的应用前景，大大激发了人们对天然活性肽的研究热情及对新种 类认识的渴望。而天然活性肽由于其存在部位、存在条件的特殊性，加之 含量极其少，分离提纯的难度大。随着蛋白组学的发展，除了从食品中提 取活性肽以外，乳源性生物活性肽研究成为热点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种生物活性肽，所述的生物活性肽分子 量小，溶解度高，能够消除人体内产生的氧化应激因子，而且能够抑制肿 瘤细胞增值，加快肿瘤细胞的凋亡速度。
本发明的第二目的在于提供一种所述的生物活性肽的制备方法，该制 备方法制备的生物活性肽含量高，具有抗氧化和抑制肿瘤生长的作用，而 且该制备方法操作简单，成本低。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种生物活性肽，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
本发明提供的所述生物活性肽分子量小，溶解度高，易于吸收，而且 能够消除人体内产生的氧化应激因子，抑制肿瘤细胞的增值，加快肿瘤细 胞的凋亡。
本发明对上述生物活性肽的制备方法不作严格限制，可以人工合成， 还可以通过采用胰蛋白酶对乳清蛋白进行酶解得到。
本发明还提供如上所述的生物活性肽的制备方法，包括：
采用胰蛋白酶对乳清蛋白进行酶解；
对酶解产物进行分离纯化，得到所述的生物活性肽。
本发明还提供一种发酵制品，所述发酵制品包括如上所述的生物活性 肽。
进一步地，所述发酵制品中的生物活性肽的质量含量为 1.2399-1.6102mg/ml。
本发明还提供上述发酵制品的制备方法，包括：采用胰蛋白酶对乳清 蛋白进行酶解；优选地，所述胰蛋白酶活力＞250.N.F.u/mg。
在本发明中对胰蛋白酶的来源不作严格限制，例如，可以是从牛、羊、 猪的胰脏中提取的一种丝氨酸蛋白水解酶；
本发明中胰蛋白酶能够将多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切 断，进而得到了上述具有抗氧化和抑制肿瘤细胞增殖的生物活性肽。
在本发明中对乳清蛋白的来源不作严格限制，所述乳清蛋白可以来自 动物的鲜乳中，具体地，动物可以是牛、马、羊、猪中的任意一种，优选 地，所述乳清蛋白来自鲜马乳；进一步地，所述鲜马乳的蛋白含量为 1.045-1.278g/L。
在本发明中对乳清蛋白的制备方法不作严格限制，优选地，所述乳清 蛋白的制备方法包括：
在动物鲜乳中分离得到乳清蛋白溶液；
将乳清蛋白溶液干燥得到乳清蛋白；
优选地，所述干燥为冷冻干燥。
在本发明中对酶解的条件不作严格限制，优选地，所述酶解在PH为 7.5-8.5，优选PH为8.0，温度为45-55℃，优选为50℃的条件下进行，酶 解时间为2.5-3.5h，优选为3h。
进一步地，乳清蛋白与胰蛋白酶的质量比为(50-70)∶1，优选为60∶ 1。
通过采用上述酶解条件，提高了胰蛋白酶的活性，促进了胰蛋白酶对 乳清蛋白的剪切效率，进而提高了酶解液中生物活性肽的含量。
此外，在本发明中，可以采用本领域常规方法对酶解产物进行分离纯 化，包括但不限于超滤、凝胶色谱和RP-HPLC等方式中的一种或两种以上 组合。
具体地，分离纯化可以包括：将上述酶解液采用10KD的超滤离心管， 离心得到分子量>10KD的肽段，冷冻干燥；
称取冷冻干燥后的分子量>10KD的肽段，采用蒸馏水配制成 15-25mg/ml的溶液，取上清液3-5ml，并采用0.45um的微孔滤膜过滤，得 到滤液；
将滤液上样于Sephadex G-75凝胶柱进行洗脱，洗脱液为蒸馏水，控制 洗脱速度为0.4-0.6mL/min，按照每管3ml收集洗脱液，将各管洗脱液在 280nm测定OD值，并分离出洗脱峰处的洗脱液，对分离出的洗脱液分别 进行冷冻干燥，并进行抗氧化活性检测，得到抗氧化活性最强的组分；
称取10mg上述得到的抗氧化活性最强的组分，溶于1ml的去离子水中， 在10000-15000r/min条件下，离心12-18min，再经过0.45um的微孔滤膜过 滤，得到滤液；
将滤液采用高效液相色谱仪进行梯度洗脱，流动相A为5％乙腈+1‰ TFA；流动相B为90％乙腈+1‰TFA，控制洗脱梯度为0-90(B％)，检测 波长为280nm，流速为0.8-1.2mL/min，进样量为50ul；全梯度收集，按照 每管3ml收集一管，将收集的各管组分进行冷冻干燥，并分别进行抗氧化 活性检测，得出抗氧化活性最强的组分，即得所述的生物活性肽。
本发明中对抗氧化活性检测方法不作严格限制，优选地，所述抗氧化 检测方法具体为：
还原能力的测定：精密量取洗脱液0.5ml，加入0.2mol/L磷酸盐缓冲 液(PH6.8)1.0ml、铁氰化钾溶液1.0ml，混合均匀，在50℃水浴条件下 保温20min，再加入10％三氯乙酸；混合均匀后精密量取1.0ml，加入蒸 馏水1.0ml和三氯化铁0.5ml，在700nm处测定OD值；
DPPH清除能力的测定：取洗脱液2ml，加入2ml 0.1mmol/LDPPH乙 醇溶液混匀，避光放置30min，517nm处测定OD值，记为At；同法取2.0 ml蒸馏水加入2.0ml 0.1mmol/LDPPH乙醇溶液测定OD值，记为A0；取 2.0ml酶解液加入2.0ml乙醇混匀测定OD值，记做Ab；按照计算DPPH清除能力。
羟自由基清除能力的测定：反应体系中加入9mmol/l硫酸铁0.5ml、9 mmol/l水杨酸-乙醇溶液2.0ml、洗脱液2.0ml、8.89mmol/l的双氧水启动 反应，在37℃水浴孵育0.5h，以蒸馏水为参比，在510nm处测定OD值， 记为As；对照组加入2.0ml蒸馏水代替洗脱液，在510nm处测定OD值， 记为A0；按照计算羟自由基清 除能力。
本发明还提供了如上所述生物活性肽或所述发酵产品在制备抗癌药物 中的应用；具体地，所述抗癌药物为抗肺癌药物；更具体地，所述肺癌选 自小细胞癌、大细胞癌、腺癌和鳞癌中的任意一种。
本发明提供的所述生物活性肽，为天然活性肽，在人体中使用安全， 分子量小，易于吸收；。
本发明还提供一种抗癌药物，包含治疗有效量的所述的生物活性肽。
本发明还提供了如上所述生物活性肽或所述发酵产品在制备具有抗氧 化功能的食品、药品、化妆品或保健品中的应用。
本发明将所述生物活性肽或所述发酵产品应用到食品、药品、化妆品 或保健品中，能够消除人体内的氧化应激因子，避免人体内脂质氧化、细 胞凋亡等一系列的副作用产生，对身体造成损伤。
本发明还提供一种生物活性肽保健品，该保健品含有如上所述的生物 活性肽或所述的发酵产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
(1)本发明的生物活性肽分子量小，溶解度高，能够消除人体内产生 的氧化应激因子，而且能够偶抑制肿瘤癌细胞增值，加快肿瘤癌细胞的凋 亡速度。
(2)本发明生物活性肽的制备方法操作简单、成本低，而且制备的生 物活性肽含量高。
(3)本发明通过采用特定的胰蛋白酶和酶解条件，提高了胰蛋白酶的 活性，得到了具有抗氧化和抑制肿瘤细胞增值的生物活性肽，并且提高了 酶解液中生物活性肽的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1为本发明所述生物活性肽质谱分析的质谱图；
图2为本发明实施例1中的凝胶层析图谱；
图3为本发明实施例1中的半制备型RP-HPLC图谱；
图4为本发明实施例3中流式细胞仪检测细胞周期中的对照组的细胞 周期分布图；
图5为本发明实施例3中流式细胞仪检测细胞周期中的低剂量组的细 胞周期分布图；
图6为本发明实施例3中流式细胞仪检测细胞周期中的中剂量组的细 胞周期分布图；
图7为本发明实施例3中流式细胞仪检测细胞周期中的高剂量组的细 胞周期分布图；
图8为本发明实施例3中流式细胞术检测细胞凋亡中的对照组的细胞 凋亡分布图；
图9为本发明实施例3中流式细胞术检测细胞凋亡中的低剂量组的细 胞凋亡分布图；
图10为本发明实施例3中流式细胞术检测细胞凋亡中的中剂量组的细 胞凋亡分布图；
图11为本发明实施例3中流式细胞术检测细胞凋亡中的高剂量组的细 胞凋亡分布图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技 术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明 的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规 产品。
各实施例中采用的试剂和仪器如下：
胰蛋白酶，酶活力＞250.N.F.u/mg，来源Biosharp生物科技公司；
SephadexG-75，来源Sigma公司；
高效液相色谱仪为Waters600高效液相色谱系统，来源美国Waters公 司；
质谱仪为5800型MALDI-TOF/TOF质谱仪。
实施例1
一、生物活性肽
本实施例的生物活性肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
二、生物活性肽的制备方法
上述具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的生物活性肽的制备方法， 包括如下步骤：
步骤一、乳清蛋白粉的制备：
1)选取鲜马乳，在10000r/min的条件下，离心15min，得到脱脂乳；
2)将脱脂乳与2mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液等体积混合，再用10％乙 酸调节PH值至4.6，在40℃水浴20min，在8000r/min的条件下，离心15min， 收集上清液，冷冻干燥，得到乳清蛋白粉；
步骤二、乳清蛋白粉的酶解以及富集>10KD的肽段：
1)称取乳清蛋白粉100mg，采用蒸馏水配制成30mg/ml的乳清蛋白粉 溶液，按照乳清蛋白粉与胰蛋白酶的质量比为60∶1，向乳清蛋白粉溶液中 加入胰蛋白酶，在PH为8.0、温度为50℃条件下，酶解3h，将酶解液在 7000r/min的条件下，离心30min，去除不溶性物质；
2)将上述去除不溶性物质的酶解液采用10KD的超滤离心管，离心得 到分子量>10KD的肽段，冷冻干燥；
步骤三、采用凝胶色谱法进行分离纯化
1)称取冷冻干燥后的分子量>10KD的肽段，采用蒸馏水配制成20mg/ml 的溶液，取上清液3ml，并采用0.45um的微孔滤膜过滤，得到滤液；
2)将滤液上样于Sephadex G-75凝胶柱进行洗脱，洗脱液为蒸馏水， 控制洗脱速度为0.5mL/min，按照每管3ml收集洗脱液，将各管洗脱液在 280nm测定OD值，得到凝胶层析图谱(如图3所示)，并分离出两洗脱峰 处的洗脱液A、B，对分离出的洗脱液分别进行冷冻干燥，并进行抗氧化活 性检测，检测结果如表1所示，得到抗氧化活性最强的B组分；
其中，抗氧化活性检测方法为：
还原能力的测定：精密量取洗脱液0.5ml，加入0.2mol/L磷酸盐缓冲 液(PH6.8)1.0ml、铁氰化钾溶液1.0ml，混合均匀，在50℃水浴条件下 保温20min，再加入10％三氯乙酸；混合均匀后精密量取1.0ml，加入蒸 馏水1.0ml和三氯化铁0.5ml，在700nm处测定OD值；
DPPH清除能力的测定：取洗脱液2ml，加入2ml 0.1mmol/LDPPH乙 醇溶液混匀，避光放置30min，517nm处测定OD值，记为At；同法取2.0 ml蒸馏水加入2.0ml 0.1mmol/LDPPH乙醇溶液测定OD值，记为A0；取 2.0ml酶解液加入2.0ml乙醇混匀测定OD值，记做Ab；按照计算DPPH清除能力。
羟自由基清除能力的测定：反应体系中加入9mmol/l硫酸铁0.5ml、9 mmol/l水杨酸-乙醇溶液2.0ml、洗脱液2.0ml、8.89mmol/l的双氧水启动 反应，在37℃水浴孵育0.5h，以蒸馏水为参比，在510nm处测定OD值， 记为As；对照组加入2.0ml蒸馏水代替洗脱液，在510nm处测定OD值， 记为A0；按照计算羟自由基 清除能力。
步骤四、采用半制备型反相高效液相色潽法进行分离纯化
1)称取10mg上述得到的抗氧化活性最强的B组分，溶于1ml的去离 子水中，在12000r/min条件下，离心15min，再经过0.45um的微孔滤膜过 滤，得到滤液；
2)将滤液采用高效液相色谱仪进行梯度洗脱，流动相A为5％乙腈+1‰ TFA；流动相B为90％乙腈+1‰TFA，控制洗脱梯度为0-90(B％)，检测 波长为280nm，流速为1mL/min，进样量为50ul；全梯度收集，按照每管 3ml收集一管，并根据得到的半制备型RP-HPLC图谱(如图4所示)，得 到色谱峰1和2处的收集液；将收集的1和2处各管收集液分别进行冷冻 干燥，并进行抗氧化活性检测，检测结果如表2所示，得到色谱峰2处的 出抗氧化活性最强的组分，即得所述的生物活性肽。
三、生物活性肽的确认
采用质谱仪分析：
1)采用myoglobin酶解肽段对质谱仪进行外标校正；
2)将上述制备的生物活性肽与去离子水配制成浓度为5.0mg/ml的溶液 样品；
3)先点0.5μL的样品于MALDI靶板上，自然干燥后，再点上0.5uL 4mg/ml的CHCA溶液(50％乙腈水溶液含有0.1％TFA)，在室温下自然 干燥。
4)样品用质谱仪进行质谱分析，激光源为355nm波长的Nd:YAG激 光器，加速电压为20kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据； 样品的一级质谱扫描范围为300-3600Da；一级质谱采用Reflector Positive 模式，参数如下：CID(OFF)，mass rang(700－5000Da)，Focus Mass (1600Da)，Fixed laser intensity(4500)Digitizer：BinSize(0.5ns)；串联 质谱采用2KV Positive模式，参数如下：CID(ON)，Precursor MassWindows (Relative 100resolution，FWHM)，Fixed laser intensity(5000)Digitizer：Bin Size(1ns)；
5)通过质谱分析得到质谱图，如图1所示，采用MASCOT(V 2.3) 软件进行检索，搜索参数如下：NCBI蛋白库、胰酶酶切，一个漏切位点， 一级质谱的容差为100ppm，二级质谱的容差为0.8Da，没有固定修饰，可 变修饰设置为甲硫氨酸氧化；
6)将得到的质谱图与氨基酸组成进行分析得到，所述生物活性肽的相 对分子质量为1594.89KD，所述生物活性肽为SEQ ID NO：1所示的氨基酸 序列。
实施例2
本实施例为所述生物活性肽的抗氧化活性实验
实验方法
1)细胞缺氧复氧模型建立；
采用物理性缺氧模型(混合气体培养法)，将预先培养好的细胞培养皿置 于无菌密闭容器，进气口通人95％N2+5％CO2混合气体，经出气口流出， 使容器内保持无氧状态6h，再将细胞放回37℃、5％CO2培养箱复氧，继续 培养3h。
2)GSH检测：
在60mm培养皿内接种生长状态良好的肺癌细胞2×105个，待细胞贴 壁生长达到80％，随机分成5组，分别为空白对照组、模型组、低剂量组、 中剂量组和高剂量组，分别向低剂量组、中剂量组和高剂量组中对应添加 500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml浓度的抗氧化活性肽100μl，空白对 照组和模型组不作处理，继续培养48h，将模型组、低剂量肽组、中剂量肽 组和高剂量肽组缺氧6h，再复氧3h，空白对照组正常培养，然后分别采用 0.25％胰酶消化孔内细胞，并收集细胞，向收集好的细胞中添加PBS，低速 离心收集沉淀细胞，向沉淀细胞中加入0.3-0.5ml 0.1M pH7.4的等渗PBS缓 冲液以悬浮细胞，采用超声破碎细胞，取破碎后的细胞悬液0.1ml，加0.1ml 沉淀剂混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清液待测，按照微量还原型 谷胱甘肽(GSH)试剂盒说明书操作，取上清液1mL进行显色反应，用酶 标仪在420nm下检测吸光度；实验重复3次，检测结果参见表3：
根据公式计算GSH含量，公式为：
3)SOD检测：
在60mm培养皿内接种生长状态良好的肺癌细胞2×105个，待细胞贴 壁生长达到80％，随机分成5组，分别为空白对照组、模型组、低剂量组、 中剂量组和高剂量组，分别向低剂量组、中剂量组和高剂量组中对应添加 500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml浓度的抗氧化活性肽100μl，空白对 照组和模型组不作处理，继续培养48h，将模型组、低剂量肽组、中剂量肽 组和高剂量肽组缺氧6h，再复氧3h，空白对照组正常培养，然后分别采用 0.25％胰酶消化孔内细胞，并收集细胞，向收集好的细胞中添加PBS，低速 离心收集沉淀细胞，向沉淀细胞中加入0.3-0.5ml 0.1M pH7.4的等渗PBS缓 冲液以悬浮细胞，采用超声破碎细胞，取破碎后的细胞悬液0.1ml，加0.1ml 沉淀剂混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清液待测；按照SOD试剂盒 说明书操作，采用WST-1法，用酶标仪在450nm下检测吸光度，检测结果 参见表3；
根据公式计算SOD活力，公式为：
4)MDA检测：
在60mm培养皿内接种生长状态良好的肺癌细胞2×105个，待细胞贴 壁生长达到80％，随机分成5组，分别为空白对照组、模型组、低剂量组、 中剂量组和高剂量组，分别向低剂量组、中剂量组和高剂量组中对应添加 500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml浓度的抗氧化活性肽100μl，空白对 照组和模型组不作处理，继续培养48h，将模型组、低剂量肽组、中剂量肽 组和高剂量肽组缺氧6h，再复氧3h，空白对照组正常培养，然后分别采用 0.25％胰酶消化孔内细胞，并收集细胞，向收集好的细胞中添加PBS，低速 离心收集沉淀细胞，向沉淀细胞中加入0.3-0.5ml 0.1M pH7.4的等渗PBS缓 冲液以悬浮细胞，采用超声破碎细胞，取破碎后的细胞悬液0.1ml，加0.1ml 沉淀剂混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清液待测；按照MDA试剂盒 说明书操作，用酶标仪在532nm下检测吸光度，检测结果参见表3；
根据公式计算MDA，公式为：
实施例3
本实施例为所述生物活性肽抑制人肺癌细胞(A549)增值和加快人肺 癌细胞凋亡的实验
实验方法
1)细胞培养和传代
将A549细胞株培养在含10％胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/mL 的高糖DMEM培养液中，在37℃、饱和湿度、5％的CO2浓度条件下培养， 每2天换一次液，待细胞贴壁生长达到80％，对细胞进行消化用于传代培 养或实验；
2)MTT法检测细胞增殖以及计算抑制率
取对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化后，加入96孔细胞培养 板中，并以6个孔为一组，共设置15组，每孔200ul(每孔含细胞约5×104个)，将培养板置于37℃，5％CO2浓度的恒温恒湿培养箱中培养，肿瘤细 胞为贴壁生长，弃上清液，在每组孔内分别加入5ug/mL、50ug/mL、 500ug/mL、1000ug/mL、2000ug/mL的生物活性肽100ul，不加生物活性肽的培养孔作为对照组，第1-5组培养12h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶 液20ul，培养4h，弃上清液，每孔加入100ul的DMSO，轻轻震荡10min， 在490nm波长处用酶标仪测定各孔的吸收值；并取平均值计算培养12h的 细胞抑制率；第6-10组培养48h，按照上述方法计算培养48h的细胞抑制 率；第11-15组培养72h，按照上述方法计算培养72h的细胞抑制率；计算 结果参见表4，细胞抑制率的计算公式为：
3)流式细胞仪检测细胞周期
将A549细胞接种于6孔板中(每孔含细胞约1×106个)，待细胞生长至 对数期，弃培养基，PBS冲洗1遍，将5ug/mL、50ug/mL、500ug/mL的生 物活性肽100ul分别加入到三个培养孔中，并分别作为低剂量组、中剂量组 和高剂量组，选取未添加生物活性肽的1个培养孔作为对照组，继续培养 48h后，分别向培养孔中添加胰蛋白酶0.5ml进行消化，消化1-2min，再分 别加入培养液2ml，将单细胞悬液加入离心管中，以1000rpm离心5min， 弃上清液，加入PBS 1ml离心洗涤2次，弃上清液，加1mlPBS重悬，混 匀，加入2ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜，离心，弃上清液，用PBS 1ml 离心，弃上清，加入500ulPI溶液在避光、室温情况下，染色30min，细胞 悬浮液通过流式细胞仪进行检测；测定细胞周期，其检测结果参见附图5-8； 观察G1期、S期、G2期各期细胞所占的百分比得到细胞周期分布情况如 表5所示。
4)流式细胞术检测细胞凋亡
将A549细胞接种于6孔细胞培养板中(每孔含细胞约1×105个)，待细 胞铁壁生长达到80％，将5ug/mL、50ug/mL、500ug/mL的生物活性肽100ul 分别加入到三个培养孔中，并分别作为低剂量组、中剂量组和高剂量组， 选取未添加生物活性肽的培养孔作为对照组，继续培养48h，分别向低剂量 组、中剂量组、高剂量组和对照组中添加不含EDTA的胰蛋白酶0.5ml进行 细胞消化，消化1-2min，再分别加入培养液2ml，将单细胞悬液加入离心 管中，以1000rpm离心5min，弃上清液，加入PBS 1ml离心洗涤2次，用 100μL1×binding buffer缓冲溶液重悬细胞，在细胞悬液中加入5μL 7-AAD染液和5μLAnnexinV混匀；在室温、避光条件下，孵育15min，再 加入400μL1×binding buffer缓冲溶液，混匀，采用流式细胞仪检测细胞凋 亡，其检测结果参见附图9-11；观察细胞凋亡检测结果得到细胞凋亡的百 分含量如表6所示。
实施例4
本实施例为一种生物活性肽保健品，所述生物活性肽保健品含有实施 例1分离得到的生物活性肽。
实施例5
本实施例为一种抗癌药物，所述抗癌药物含有实施例1分离得到的生 物活性肽以及可药用的载体。
表1凝胶层析分离得到洗脱峰处A、B组分的抗氧化活性(n＝3)
| 组分 | A | B |
| 还原能力 | 0.3808±0.0045 | 0.8738±0.0012 |
| 自由基的清除率(％) | 23.18±0.1322 | 39.50±0.1123 |
| 羟自由基清除能力(％) | 56.94±0.5214 | 75.57±0.4531 |
表2半制备RP-HPLC分离得到1、2组分的抗氧化活性(n＝3)
| 组分 | 1 | 2 |
| 还原能力 | 62.22±0.0012 | 88.75±0.0026 |
| 自由基的清除率(％) | 27.34±0.1321 | 49.41±0.1452 |
| 羟自由基清除能力(％) | 62.01±0.4538 | 76.16±0.4936 |
表3生物活性肽对A549细胞GSH含量、SOD和MDA活力影响(n＝6)
| 组别 | GSH(umol/gprot) | SOD/(U/mg) | MDA/(nmol/mg) |
| 空白组 | 13.6555±1.2448 | 81.3314±0.3387 | 1.8491±0.7925△ |
| 模型组 | 7.69±0.6935 | 76.7768±0.1608 | 9.2456±1.0998* |
| 低剂量组 | 12.9367±1.1561 | 78.0782±0.1897 | 5.2853±0.2643 |
| 中剂量组 | 22.2258±1.4505*△ | 90.4405±0.1629*△ | 5.2874±0.6653 |
| 高剂量组 | 28.7713±1.2458**△ | 95.4826±0.1629**△ | 2.3784±0.6650△ |
注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05。
由表3可知
本申请通过检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD) 和丙二醛(MDA)发现，肺癌细胞在生物活性肽诱导下48h后，各给药组细 胞培养上清中GSH含量明显升高，SOD的活力也明显升高，MDA含量明 显降低；可见生物活性肽对细胞氧化应激损伤具有保护作用，能够调节细 胞内的抗氧化系统，抑制氧化应激过程中产生的自由基，使细胞氧化损伤 得到恢复。
表4不同浓度浓度抗氧化肽对A549增殖的影响(n＝6)
| 组别 | 24小时抑制率/％ | 48小时抑制率/％ | 72小时抑制率/％ |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 |
| 5ug/mL | 10.91±2.7431 | 13.89±1.7810 | 18.54±1.7523 |
| 50ug/mL | 18.23±1.1610 | 26.25±1.7463 | 28.68±1.6352 |
| 500ug/mL | 27.44±1.5241 | 38.44±1.6541** | 41.77±1.2582** |
| 1000ug/mL | 33.22±1.7421* | 47.24±1.3546** | 50.67±1.8643**△ |
| 2000ug/mL | 38.27±1.6245** | 57.19±1.8521**△ | 64.84±1.9124**△ |
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与24h比较，△P<0.05。
表5细胞周期分布情况(n＝3)
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
表6抗氧化肽对细胞凋亡的影响(n＝6)
| 组别 | 早期凋亡细胞/％ |
| 对照组 | 5.9667±0.5033 |
| 低剂量组 | 11.1333±0.4509 |
| 中剂量组 | 19.1333±0.7024* |
| 高剂量组 | 24.3333±0.9237* |
注：与对照组比较，*P<0.01。
由表4-6可知
本申请对肺癌细胞抑制率随生物活性肽的浓度增加和处理时间延长 而增加，各剂量组与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05)；并且生物 活性肽能够阻滞细胞周期停留在G1期，而且细胞数量随着抗氧化肽浓度增 加而降低，随着给药时间延长，抗氧化肽诱导A549细胞凋亡，与对照组相 比，低剂量和高剂量组凋亡率分别达到19.13％和24.33％，效果明显 (P<0.01)，差异具有统计学意义；可见，本申请生物活性肽对肺癌细胞具有 一定的杀伤力，并对肺癌细胞生长具有一定的抑制作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非 对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域 的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案 进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范 围。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆医科大学
<120> 一种生物活性肽及其制备方法和应用
<130> 2010
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 1
Val Ala Pro Phe Pro Gln Pro Val Val Pro Tyr Pro Gln Arg
1 5 10
Claims (10)
1.一种生物活性肽，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
2.一种发酵制品，其特征在于，包括权利要求1所述的生物活性肽。
3.根据权利要求2所述的发酵制品，其特征在于，所述发酵制品中的生物活性肽的质量含量为1.2399-1.6102mg/ml。
4.权利要求1所述的生物活性肽或权利要求2或3所述的发酵制品的制备方法，其特征在于，包括：采用胰蛋白酶对乳清蛋白进行酶解。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乳清蛋白提取自鲜马乳；
优选地，所述鲜马乳的蛋白含量为1.045-1.278g/L。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酶解在PH为7.5-8.5，温度为45-55℃的条件下进行，酶解时间为2.5-3.5h；
优选地，控制乳清蛋白与胰蛋白酶的质量比为(50-70)∶1。
7.权利要求1所述的生物活性肽或权利要求2或3所述的发酵产品在制备抗癌药物中的应用；
优选地，所述抗癌药物为抗肺癌药物。
8.一种抗癌药物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1所述的生物活性肽。
9.权利要求1所述的生物活性肽或权利要求2或3所述的发酵制品在制备具有抗氧化功能的食品、药品、化妆品或保健品中的应用。
10.一种生物活性肽保健品，其特征在于，含有权利要求1所述的生物活性肽或权利要求2或3所述的发酵制品。
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|---|---|---|---|---|
| CN112111456A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-12-22 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种循环肿瘤细胞分离富集试剂盒 |
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2018
- 2018-08-31 CN CN201811009421.5A patent/CN109096385A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN112111456A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-12-22 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种循环肿瘤细胞分离富集试剂盒 |
| CN112111456B (zh) * | 2020-08-28 | 2022-05-27 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种循环肿瘤细胞分离富集试剂盒 |
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