CN113277979B - 一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法 - Google Patents

一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天然产物化学对照品的制备技术领域，具体涉及一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法。具体制备工艺为：提取、大孔树脂富集、分离纯化及结构鉴定。本发明方法的建立基于高速逆流色谱结合制备液相色谱的组合分离模式，实现了两者的优势互补，引入了重复进样分离模式，避免了一次引入固定相时间、系统平衡建立时间和系统清理时间，提高了分离效率，从铁棒锤地上部分首次分离得到了8种酚类化学对照品。重复性和稳定性好，操作简单、方便、易于实现自动化控制，非常适合铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备，对其它中藏药化学对照品的制备方法的建立具有较好的示范作用。

Description

一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法
技术领域
本发明涉及天然产物化学对照品的制备技术领域，具体涉及一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法。
背景技术
铁棒锤(Aconitum pendulum Busch)为毛茛科乌头属多年生草本植物。主要分布于我国西藏、青海、四川西部、云南西北部、河南西部、陕西南部及甘肃南部。铁棒锤作为一种药用资源，已被广泛用于治疗损伤疼痛，风湿性关节炎疼痛，外伤，外出血等症状。国内外对铁棒锤化学成分和生物活性的研究主要集中于其根中所含的极性二萜生物碱，而对其地上部分以及非二萜生物碱和其它类型化合物的研究报道很少。调查研究表明，当铁棒锤地下部分植物量最大时，其植物量也只有地上部分植物量的一半。然而，在研究开发利用过程中地上部分通常被丢弃，导致严重资源浪费。因此，开展地上部分的植物化学研究对于铁棒锤药材的全面开发和利用具有重要意义。
植物化学研究的关键在于建立高效的分离方法。高速逆流色谱(HSCCC)是一种基于液液分配机理的新型色谱分离纯化技术。它避免了传统色谱柱中样品在固体载体上的不可逆吸附，回收率高，易于大规模制备，另外，粗提物可直接上样，已被广泛用于天然产物的分离制备。然而，HSCCC分离往往需要较长时间，包括引入固定相时间，系统平衡建立时间，分离时间，系统清理时间等。另外，受限于理论塔板数低的问题，一次HSCCC分离往往不能实现有效分离。制备液相色谱理论塔板数高，分离模式多样，适合多种天然产物的分离，但对样品要求就高。
发明内容
基于上述技术问题，本发明基于高速逆流色谱结合制备液相色谱的组合分离模式，实现了两者的优势互补，从铁棒锤地上部分首次分离得到了8种酚类化学对照品。目的是提供一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法。
本发明保护一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材粉碎，在第一预定温度下用乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材采用10～30mL的乙醇溶液进行回流提取1～4次，每次1～4h，即可得到提取物浓缩液；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液进行上大孔树脂富集，先用去离子水或体积分数为0～10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，除去非目标组分；再用体积分数为20～70％乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离，将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；上述8种酚类化学对照品的化学结构式依次如下：
Figure BDA0003100515320000031
Figure BDA0003100515320000041
Figure BDA0003100515320000051
进一步的，步骤1中所述的铁棒锤药材为铁棒锤药材的地上部分。
进一步的，步骤1中乙醇溶液中乙醇的体积分数为30～95％，所述第一预定温度为50～90℃。
进一步的，步骤2所述大孔树脂富集步骤中大孔树脂为D101、D3520、AB-8、S-8、X-5、HPD100、HPD400、DM130中的任意一种。
进一步的，步骤3中高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前0～50min时进行重复进样，在第二预定温度下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝1～9：1～9：10；第二预定温度为20～40℃。
进一步的，步骤3中在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为30～50％。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明选取了在开发利用过程中被废弃的铁棒锤药材的地上部分作为研究对象，对于铁棒锤药材的综合开发利用具有重要意义，对于中藏药非药用部位的综合开发利用具有较好的示范作用。
(2)本发明方法的建立基于高速逆流色谱结合制备液相色谱的组合分离模式，实现了两者的优势互补；另外，本发明在高速逆流色谱分离时引入了重复进样分离模式，避免了一次引入固定相时间、系统平衡建立时间和系统清理时间，提高了分离效率，两次分离过程可节约120min。
(3)基于本发明方法，从铁棒锤药材地上部分首次分离得到了8种酚类化学对照品。
(4)本发明方法重复性和稳定性好，操作简单、方便、易于实现自动化控制，非常适合铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备，对其它中藏药化学对照品的制备方法的建立具有较好的示范作用。
附图说明
图1为本发明方法制得的8种酚类化学对照品HSCCC分离图；
图2为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的制备液相色谱纯化图；
图3为本发明方法制得的奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的制备液相色谱纯化图；
图4为本发明方法制得的羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰基-(4”→1”)-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷的制备液相色谱纯化图；
图5为本发明方法制得的木兰花碱的纯度检测图；
图6为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图7为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图8为本发明方法制得的山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图9为本发明方法制得的山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图10为本发明方法制得的羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰基-(4”→1”)-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图11为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图12为本发明方法制得的山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的纯度检测图；
图13为本发明方法制得的木兰花碱的化学结构式；
图14为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式；
图15为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式；
图16为本发明方法制得的山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式；
图17为本发明方法制得的山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式；
图18为本发明方法制得的羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式；
图19为本发明方法制得的槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式；
图20为本发明方法制得的山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷的化学结构式。
其中，图中，1、木兰花碱；2、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；3、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；3’、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；4、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；4’、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰基-(4”→1”)-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷；5、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；6、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明方法参数优化试验过程
1、提取参数优化
将铁棒锤药材地上部分粉碎，在第一预定温度80℃下用体积分数为30～95％乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材采用10～30mL的乙醇溶液进行回流提取1～4次，每次1～4h，即可得到提取物浓缩液；所述提取物浓缩液经高效液相色谱分析时，8种酚类化合物的峰面积比例达到(详见表1)。
表1不乙醇体积分数对8种酚类化合物提取效果的影响
Figure BDA0003100515320000092
2、大孔树脂富集参数优化
首先通过小试试验将上述提取优化后得到的提取物浓缩液上大孔树脂AB-8富集，依次用去离子水、体积分数为10％、20％、30％、40％、70％乙醇溶液洗脱至流出液无色，经高效液相色谱分析，所述8种酚类化合物90％集中在30％乙醇洗脱液，10％集中在20％乙醇洗脱液中(详见表2)。
表2不同乙醇体积分数对AB-8富集8种酚类化合物的影响
Figure BDA0003100515320000091
Figure BDA0003100515320000101
3、分离纯化参数优化
(1)高速逆流色谱和制备液相色谱组合分离模式对分离纯化的影响
将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离；将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前0～50min进行重复进样；在第二预定温度40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝7：3：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为35％。
结果发现，在前次分离结束前50min进行重复进样，两次分离过程可节约120min(详见表3)。
表3高速逆流色谱不同时间间隔对分离时间的节约情况
Figure BDA0003100515320000102
(2)不同预定温度对分离纯化的影响
将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离；将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前50min进行重复进样，在第二预定温度20～40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝7：3：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为35％。
结果发现，在第二预定温度40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，固定相保留率由比20℃下的40％提高59％，分离时间节约15min(详见表4)。
表4不同预定温度对高速逆流色谱固定相保留率和分离时间的节约情况的影响
Figure BDA0003100515320000111
(3)不同乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比对分离纯化的影响
将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离；将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前50min进行重复进样，在第二预定温度40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝1～9：1～9：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为35％。
结果发现，在乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝7：3：10，采用此系统最多得到6个组分(详见表5)。
表5不同乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比高速逆流色谱得到组分数的影响
Figure BDA0003100515320000121
(4)不同甲醇溶液中甲醇的体积分数对分离纯化的影响
将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离；将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前50min进行重复进样，在第二预定温度40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝7：3：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为30～50％。
结果发现，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液中甲醇的体积分数为35％进行洗脱时，化合物纯度达到98％(详见表6)。
表6不同甲醇体积分数对制备液相色谱纯化效果的影响
Figure BDA0003100515320000131
一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材的地上部分粉碎，在第一预定温度80℃下用体积分数为70％的乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材的地上部分采用20mL的乙醇溶液进行回流提取3次，每次2h，即可得到提取物浓缩液；所述提取物浓缩液经高效液相色谱分析时，8种酚类化合物的峰面积比例达到50％；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液上大孔树脂AB-8富集，依次用去离子水、体积分数为10％、20％、30％、40％、70％乙醇溶液洗脱至流出液无色，经高效液相色谱分析，所述8种酚类化合物90％集中在30％乙醇洗脱液，10％集中在20％乙醇洗脱液中；所述富集过程，先用体积分数为10％乙醇溶液洗脱除去非目标组分，再用体积分数为30％乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含8种酚类化合物的洗脱液；所述得到的洗脱液中经高效液相色谱分析时，8种酚类化合物的峰面积比例可以由提取物浓缩液中的50％提升到95％；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离；将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前50min进行重复进样，可节约120min；在第二预定温度40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，固定相保留率由比20℃下的40％提高59％，分离时间节约20min；乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝7：3：10，采用此系统最多得到6个组分；所述高速逆流色谱分离得到的组分在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为35％；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
实施例2
一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材的地上部分粉碎，在第一预定温度50℃下用体积分数为30％的乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材的地上部分采用10mL的乙醇溶液进行回流提取4次，每次1h，即可得到提取物浓缩液；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液进行上大孔树脂D101富集，先用去离子水洗脱至流出液无色，除去非目标组分；再用体积分数为20％的乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离，将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前0min，即第一次分离结束时马上时进行重复进样，在第二预定温度20℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝1：1：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为30％；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
实施例3
一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材的地上部分粉碎，在第一预定温度90℃下用体积分数为95％的乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材的地上部分采用30mL的乙醇溶液进行回流提取1次，每次4h，即可得到提取物浓缩液；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液进行上大孔树脂D3520富集，先用体积分数为10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，除去非目标组分；再用体积分数为70％乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离，将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前50min时进行重复进样，在第二预定温度40℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝9：9：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为50％；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
实施例4
一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材的地上部分粉碎，在第一预定温度60℃下用体积分数为70％的乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材的地上部分采用20mL的乙醇溶液进行回流提取2次，每次3h，即可得到提取物浓缩液；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液进行上大孔树脂AB-8富集，先用体积分数为5％乙醇溶液洗脱至流出液无色，除去非目标组分；再用体积分数为40％乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离，将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前30min时进行重复进样，在第二预定温度30℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝6：5：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为40％；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
实施例5
一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材的地上部分粉碎，在第一预定温度80℃下用体积分数为85％的乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材的地上部分采用15mL的乙醇溶液进行回流提取3次，每次2h，即可得到提取物浓缩液；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液进行上大孔树脂HPD100富集，先用体积分数为8％乙醇溶液洗脱至流出液无色，除去非目标组分；再用体积分数为55％乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离，将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；其中，高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前25min时进行重复进样，在第二预定温度35℃下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝8：7：10；在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为35％；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，其特征在于，具体步骤包括如下：
步骤1，提取：将铁棒锤药材粉碎，在第一预定温度下用乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩至无醇味，得到提取物浓缩液；其中，每1g铁棒锤药材采用10～30mL的乙醇溶液进行回流提取1～4次，每次1～4h，即得到提取物浓缩液；所述的铁棒锤药材为铁棒锤药材的地上部分；
步骤2，大孔树脂富集：将上述提取物浓缩液进行大孔树脂富集，先用去离子水或体积分数为0～10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，除去非目标组分；再用体积分数为20～70％乙醇溶液洗脱至流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；最后将洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；
步骤3，分离纯化：将步骤2所得富含目标化合物的提取物粉末先用高速逆流色谱分离，将高速逆流色谱分离得到的组分采用制备液相色谱进行纯化，得到8种化合物；所述高速逆流色谱分离时，采用重复进样洗脱模式，具体操作为在前次分离结束前0～50min时进行重复进样，在第二预定温度下采用乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统进行洗脱，其中，乙酸乙酯-正丁醇-水溶剂系统中溶剂的体积比为V乙酸乙酯：V正丁醇：V水＝1～9：1～9：10；第二预定温度为20～40℃；
步骤4，结构鉴定：将步骤3得到的化合物通过1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，鉴定结果为8种酚类化学对照品：木兰花碱、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式咖啡酰)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、羟基酪醇-1-O-(6'-反式阿魏酰-(4”→1”')-O-β-D-葡萄糖基)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖基-3-O-(6””-反式对香豆酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷；上述8种酚类化学对照品的化学结构式依次如下：
Figure FDA0004028440340000021
Figure FDA0004028440340000031
2.根据权利要求1所述的一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，其特征在于，步骤1中乙醇溶液中乙醇的体积分数为30～95％，所述第一预定温度为50～90℃。
3.根据权利要求1所述的一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，其特征在于，步骤2所述大孔树脂富集步骤中大孔树脂为D101、D3520、AB-8、S-8、X-5、HPD100、HPD400、DM130中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种铁棒锤药材中8种酚类化学对照品的制备方法，步骤3中在通过制备液相色谱纯化时，采用的色谱柱为C18色谱柱，采用甲醇溶液进行洗脱，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为30～50％。
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