SK282836B6

SK282836B6 - Spôsob chromatografického získavania veľmi čistého cyklosporínu A a príbuzných cyklosporínov

Info

Publication number: SK282836B6
Application number: SK1222-98A
Authority: SK
Inventors: Ullrich Voigt; Roland Hempel; Joachim Kinkel; Roger-Marc Nicoud
Original assignee: Arzneimittelwerk Dresden Gmbh
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2002-12-03
Also published as: HUP9901801A2; PL187763B1; KR100467127B1; NO321570B1; HUP9901801A3; RU2163607C2; ES2169384T3; HK1015382A1; HU222200B1; DK0888382T3; JP2000507237A; CZ293243B6; CZ299998A3; US6306306B1; DE19611094C2; PT888382E; CN1212703A; CN1196711C; EP0888382B1; EP0888382A1

Abstract

Je opísaný spôsob čistenia cyklosporínu A a príbuzných cyklosporínov z cyklosporín A obsahujúceho surového extraktu, ktorý využíva chromatografický postup so silikagélom ako adsorbentom, v ktorom sa a) v prvom stupni chromatografie pomocou preparatívnej HPLC alebo techniky "simulated moving bed" (SMB) surový extrakt frakčných krokov v oddelených koncentračných profiloch rozdelí na nepolárne sprievodné látky obsahujúce hodnotnú frakciu 1 a polárnejšie látky obsahujúce hodnotnú frakciu 2 a b) hodnotná frakcia 1 (rafinát) a hodnotná frakcia 2 (extrakt) v nasledujúcom druhom stupni chromatografie podrobí ďalšiemu čisteniu pomocou SMB techniky.ŕ

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka nového spôsobu chromatografického čistenia cyklosporínu A (Cy A) a príbuzných cyklosporínov, ktorý je vhodný na použitie vo farmaceutickom priemysle.

Pritom sú účinné látky získavané za ekonomicky výhodných podmienok v dostatočnej čistote na farmaceutické potreby, to znamená, že napríklad v prípade cyklosporínu A sú dodržané požiadavky na čistotu podľa európskeho liekopisu (PHARMEUROPA zväzok 4, číslo 4, strana 270, december 1992).

Doterajší stav techniky

S úspešnou izoláciou cyklosporínu A z Trichoderma polysporum (LINK EX PERS.) Rafai A. Rúeggerom a spolupracovníkmi [Helv. Chim. Acta 59, 112 (1976)] bol prvýkrát otvorený prístup k novej skupine silne imunosupresívnych látok. Vďaka intenzívnemu výskumu bolo zatiaľ objavené viac než 25 príbuzných cyklosporínov s imunosupresívnym a antifungálnym účinkom [R.Traber a kolektív, Helv. Chim. Acta 70,13 (1987)].

Dnes je kľúčový význam cyklosporínu A ako prostriedku voľby pri potlačovaní imunitnej odpovedi po orgánových transplantáciách nesporný. V dôsledku toho nechýbala v minulosti snaha o to, so zlepšením výrobného postupu vyrovnať sa stále stúpajúcim nárokom na množstvo a kvalitu tohto život zachraňujúceho lieku.

Doteraz známe technické riešenie čistenia cyklosporín A obsahujúcich surových extraktov zahrnujú väčšinou niekoľko stupňov chromatografie s použitím organických rozpúšťadiel ako elučných prostriedkov.

V zmienenej práci A. RUeggera bola najskôr uskutočnená chromatografia na silikagéli Kieselgel 60 Merck (0,063 až 0,2 mm) ako absorbentu s chloroformom pri stúpajúcom množstve metanolu. Nasledovne bol získaný produkt podrobený gólovej chromatografii na Sephadex LH 20 v metanole a potom chromatografii na oxide hlinitom (Brockmann, Akt. I) v toluéne so stúpajúcim podielom etylacetátu.

Podobné postupy používajú i neskoršie práce (tabuľka 1). Dosť našli využitie adsorbenty Sephadex LH 20, Kieselgel 60 Merck (0,063 až 0,2 mm) a oxid hlinitý. Ako tekuté fázy boli väčšinou použité zmesi organických rozpúšťadiel.

Z dôvodu vysokej toxicity, vzhľadom na zvyšné stopy rozpúšťadiel v účinnej látke, a tiež, ako z toho vyplýva, kvôli bezpečnostné technickým problémom pri spracovaní väčšieho množstva týchto látok (destilácia, odstraňovanie), sú chloroform a metylénchlorid nevhodné.

Ďalej pri použití gradientov alebo zložitejších, napríklad ternámych izokratických zmesí, je nové nastavenie tekutej fázy po destilácii eluátov zdĺhavé a drahé.

Podobne možno hodnotiť i metódu opísanú firmou BIOGAL v kanadskom patente CA 2 096 892, pri ktorej je surový extrakt pred chromatografiou podrobený tepelnému spracovaniu. Polotovar je tu zahrievaný asi 1 hodinu na približne 110 °C a následne viac než 5 hodín chladený na teplotu miestnosti. Pri nasadení vysokého podielu chlórovaných uhľovodíkov je vo dvoch po sebe idúcich jednostupňových chromatografických postupoch na silikagéli Kieselgel 60 ako absorbente izolované asi 15 % podaného množstva cyklosporínu A s čistotou asi 97,6 %. Tento výsledok však vzhľadom na veľkosť výťažku a čistotu získanej účinnej látky nie je s ohľadom na priemyselné využitie uspokojivý. Okrem toho by tieto zložité prírodné látky nemali byť vystavované teplotným zmenám kvôli svojej teplotnej nestabilite a možnej izomerizácii.

Podľa doterajšieho stavu znalostí sa zdajú ako vhodné iba prihlásené postupy firiem FUJISAWA (WO 9 213094) a BIOGAL (CA 2 096 892) s jednostupňovým chromatografickým čistením. Na to je však nutná nákladná kombinácia tekutých fáz prípadne gradient, čo regeneráciu tekutej fázy sťažuje.

Na presnejšie posúdenie týchto postupov však často chýbajú údaje o ich vyťaženosti a dosahovanej čistote produktov.

Príklady niektorých dosiaľ známych metód chromatografického čistenia cyklosporínu A

Patent	Firma	Stupne čistenia
US 4 117 118	SANDOZ	1 .Sephadex LH 20,metanol 2. neutrálny oxid hlinitý, toluén/etylacetát, gradient 3. Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2
US4 215 199	SANDOZ	1. Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2 2. Sephadex LH 20, metanol 3. Kieselgel 60, chloroform/metanol 98:2
BE 879 402	SANDOZ	1. Sephadex LH 20, metanol 2. Kieselgel 60, hexán/acetón 66:33 3. Kryštalizácia, acetón, -15 °C
WO 9 213 094	FUJISAWA	1 .Kieselgel, hexán hexán/etylacetát, gradient acetón
GB 2 227 489	BIOGAL	1. Kieselgel 60, chloroform/metanol/ acetón 92:4:4 2. Kieselgel 60, hexán/acetón, gradient
CA 2 096 892	BIOGAL	1. Kieselgel 60, chloroform/dichlórmetán/etanol 48:50:2 chloroform /etylacetát/etanol 48:50:2

Krátky popis SMB - techniky možno nájsť napríklad v R.M.Nicoud, LC-GC INTL sv. 5, č. 5, str. 43 až 47. a K.K.Unger (red.), Handbuch der HPLC, diel 2, GIT Verlag, Darmstadt, 1994 (pozri tiež obr. 1).

SK 282836 Β6

Podstata vynálezu

Ak vychádzame z tu načrtnutého stavu techniky, vyplývajú pre riešenie chromatografického čistenia cyklosporínu A s vysokými nárokmi na čistotu produktu a výťažnosť nasledujúce požiadavky:

- Nový postup by mal produkovať viac než 70 % vloženého množstva cyklosporínu A v kvalite zodpovedajúcej európskemu liekopisu (PHARMEUROPA) (vzťahujúceho sa na stupne chromatografického čistenia).

Postup by mal dostačovať najvyšším nárokom na ročný výkon a zároveň drasticky znížiť potrebu rozpúšťadiel a materiálu na stacionárne fázy.

- Technické riešenie by malo byť jednoduché, rýchle a robustné, to znamená, že rozpúšťadlá a adsorbenty musia byť pokiaľ možno po dlhý čas opätovne použiteľné. Tým odpadá tiež nasadenie ťažko nastaviteľných, prípadne ťažko regenerovateľných, izokraticky používaných zmesí rozpúšťadiel a gradientov.

- Nemali by byť používané chlórované uhľovodíky.

Postup by mal mať možnosť automatizácie, to znamená poskytovať možnosť kontinuálnej prevádzky a zároveň vyhovovať požiadavkám GMP produkcie.

Ako východiskový bod na chromatografícké čistenie slúži napríklad surový' extrakt, získaný pomocou známych metód (napr. DD 295 872 A5) z cyklosporín A obsahujúceho suchého mycélia extrakciou (etylacetát) a odstránením tukov (petrolbenzén/metanol/voda), ktorý okrem radu väčšinou neznámych žlto a červeno zafarbených substancií a olcjovitých produktov má napríklad i nasledujúce zloženie cyklosporínov:

Cyklosporíny	Neštandardizovaná relácia
C	14,9
B	13,7
L	0,2
A	65,1
G	1,2
D	1,2
ostatné	3,7

^ľl HPLC-analytické stanovenie podľa európskeho liekopisu (PHARMEUROPA, sv. 4, Č.4, str. 270 a ďalej)

V prvom stupni chromatografie sú poláme cyklosporíny (C, B, L, U) oddelené od nepolámych (G, D), takže vzniknú dve hodnotné frakcie, ktoré okrem cyklosporínu A obsahujú buď iba poláme alebo iba nepoláme znečistenie. Preto môže byť v druhom stupni chromatografie cyklosporín A tohto znečistenia výhodne zbavený.

Podľa vynálezu je ultračistenie cyklosporínu A pomocou chromatografickej metódy čistenia s použitím konvenčnej HPLC v kombinácii s technikou simulovanej pohyblivej vrstvy (Simulated Moving Bed - SMB) uskutočňované nasledovne:

1. Chromatografia HPLC alebo SMB-technikou

2. Chromatografia SMB-technika

Pozri schéma 1 až 4.

Presnejšie povedané, vynález predstavuje spôsob čistenia cyklosporínu A a príbuzných cyklosporínov zo surového extraktu obsahujúceho cyklosporín s použitím chromatografického postupu so silikagélom ako adsobentom, vyznačujúci sa tým, že sa cyklosporín A a príbuzné cyklosporíny separujú zo surového extraktu obsahujúceho cyklosporín s použitím chromatografického postupu so silikagélom ako adsorbentom:

a) v prvom stupni chromatografie pomocou prcparatívnej HPLC alebo SMB-techniky surový extrakt frakčnými krokmi v oddelených koncentračných profiloch rozdelí na hodnotnú frakciu 1 obsahujúcu nepoláme sprievodné látky a hodnotnú frakciu 2 obsahujúcu sprievodné látky viac poláme a

b) hodnotná frakcia 1 (rafinát) a hodnotná frakcia 2 (extrakt) podrobí následnému druhému stupňu chromatografie pomocou SMB-techniky.

Pritom možno prvý aj druhý stupeň chromatografie uskutočňovať v systéme normálnej fázy/etylacetát alebo obrátená fáza, acetonitril/voda.

Najmä nasadením SMB-techniky sú dosiahnuté nasledujúce výhody:

Možno realizovať úplne kontinuálny pracovný proces, to znamená, že s novým spôsobom chromatografie odpadnú diskrétne injekcie substancií. Takáto kontinuálne pracujúca chromatografia je výhodná predovšetkým na priemyselné využitie.

SMB technika umožňuje prácu s koncentrovanejšími roztokmi než dosiaľ. Tým klesnú náklady na rozpúšťadlá a zároveň sa skráti čas nutný na ich spätné získavanie.

Na základe týchto priaznivých ekonomických parametrov sa SMB-technika vo vzrastajúcom meradle nasadzuje tiež na chromatografícké delenie proteinov produkovaných biotechnologický (Ňadier T.K., Sch. Sci., Purdue Univ. East Lafayette, IN 479907, USA) a aminokyselín (Adachi S. so spolupracovníkmi, Agric. Biol. Chem. 55, 925-932 (1991)).

Tiež v predloženom prípade čistenia produktov obsahujúcich cyklosporín A by mohla byť zistená prevaha SMB v porovnaní s konvenčnými chromatografickými spôsobmi.

- Porovnanie SMB techniky s technikou HPLC

Fázový systém	Parameter	Pomer (SMB:HPLC)
normálny fázový systém	spotreba etylacetátu	0,7
spotreba materiálu Si 60	0,25
produktivita (g vložené/deň/kg adsorbens)	2,5
obrátený fázový systém	spotreba acetonitril/voda	0,15
spotreba materiálu RP-18	0,15
produktivita (g vložené/deň/kg adsorbens)	10

Najdôležitejším technickým predpokladom na realizáciu SMB-delenia je presné nastavenie rôznych čiastočných tokov (pozri príklady), aby bolo možné zaistiť takmer stacionárny stav elučných front v závislosti od spínacích časov.

Ďalej je na optimálne nastavenie SMB-delenia nutná presná znalosť adsorpčnej izotermy žiadaného produktu rovnako ako znečisťujúcich látok v používanom chromatografickom systéme. Toto musí byť vopred analyticky stanovené.

Tiež sa vďaka zavedeniu takzvanej piatej zóny podarilo vypustiť obvyklé dvojkomponentné delenie klasickej štvorzónovej SMB. Pomocou premývacieho systému inštalovaného v prídavnej zóne je umožnená súbežná eliminácia znečistenia, ktorá vo vzťahu k cyklosporínu A má vysoké hodnoty k'. Tým je dosiahnuté diaľšie zvýšenie kvality produktu.

Obvykle môžu byť štandardnou SMB-technikou dobre rozdelené zmesi s hodnotami k' medzi 0,6 a 2,0 (k- 1 zodpovedá žiadanému produktu). Ale bežne sú komponenty, ktoré ležia mimo toto rozmedzie, odstránené iba neúplne, takže dôjde k obohateniu v rafmáte oproti vloženému materiálu („feed“) (obr.l).

Pri prepínaní medzi štvrtou a prvou zónou sa podľa novo vynájdeného postupu kolóny dostanú do definovaného stavu premývaním rozpúšťadlom so silnou elučnou silou (napr. metanol). Príslušné kolóny aparatúry, ktoré sa nachádzajú v tejto piatej zóne, sú tak počas jedného taktu úplne vyradené z uzavretého kruhu ostatných štyroch zón (obr. 1).

Táto piata zóna je rozdelená do dvoch čiastkových krokov:

1. Počas trvania prvého čiastkového kroku sa kolóny piatej zóny prepláchnu vhodným rozpúšťadlom s vysokou elučnou silou, aby sa stacionárna fáza očistila od zvyšných nečistôt.

Ako premývací prostriedok je prednostne využívaný metanol. V prípade premývania RP-materiálu môže byť nasadený čistý acetonitril, čím sa vďaka odpadnutiu jedného prídavného rozpúšťadla zjednoduší problém spätného získavania rozpúšťacích prostriedkov.

2. V druhom čiastkovom kroku sa premývacím prostriedkom oplachuje elučný prostriedok nutný na oddeľovanie.

Ak sú kolóny rozdelené do zón tak, že sa ich v piatej zóne nachádza viac, môže byť premývací proces zintenzívnený, keď sa tieto kolóny počas premývania zapoja paralelne.

Ďalšia optimalizácia postupu bola dosiahnutá pri ultračistení takzvanej hodnotnej frakcie 2 prvého stupňa chromatografie. Táto frakcia obsahuje okrem cyklosporínu A predovšetkým poláme nečistoty ako cyklosporin U a L. Tu bolo prekvapivo zistené, že táto hodnotná frakcia 2 môže byť veľmi dobre oddelená po zámene miesta odberu na extrakt a rafinát na SMB-zariadení. Pritom sú poláme nečistoty eluované pred hodnotným produktom, cyklosporínom A, to znamená, že majú kratšie retenčné časy. Toto znamená, že pri použití tohto špeciálneho SMB-režimu v druhom stupni chromatografic potom možno v tomto stupni pracovať so systémom RP-18, čím sa veľmi zjednoduší spätné získavanie rozpúšťacích prostriedkov (schéma 1).

Východiskové substancie použité v nasledujúcich troch príkladoch, ktoré dokladajú vhodnosť SMB-techniky pre druhý stupeň chromatografie, zodpovedajú svojím profilom znečisteniu typickým hodnotným frakciám vzniknutým z prvého stupňa chromatografie pri použití konvenčnej preparatívnej HPLC.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V príklade 1 sa demonštruje ultračistenie medziproduktu prvého stupňa chromatografie pomocou SMB-techniky v bežnom fázovom systéme Si 60/etylacetát. Použitá látka obsahuje okrem cyklosporínu A prevažne polámejšie nečistoty.

Ako výsledok možno pozorovať zreteľné ochudobnenie polárnych cyklosporínov (najmä U a L rovnako ako B a C), tým sa zdôrazní principiálna vhodnosť deliaceho systému v spojení s SMB-technikou.

Príklad 2 opisuje ultračistenie medziproduktu, ktorý ako hodnotnú frakciu 1 obsahuje prevažne nepoláme nečis toty, pomocou SMB-techniky v systéme obrátenej fázy RP18/acetonitril, voda (60 : 40, objemovo). Po delení SMB možno pozorovať zreteľné ochudobnenie nepolámych cyklosporínov (predovšetkým G a D).

V príklade 3 sa opisuje ultračistenie medziproduktu, ktorý obsahuje hodnotnú frakciu 1 s nepolámym znečistením, pomocou dSMB-techniky v systéme normálnej fáze/ etylacetát.

V porovnaní s príkladom 1 sa pri zámene miest odberu na extrakt/rafinát dosiahne výraznejšieho ochudobnenia nepolámych nečistôt, a tiež úspory rozpúšťacích prostriedkov.

Možnosť takto jemného delenia je do tej miery prekvapivá, pretože v minulých rokoch nebolo ani pomocou analytickej HPCL možné tieto chromatograficky výnimočne podobné sprievodné substancie od cyklosporínu A oddeliť.

Získaný cylosporín A zodpovedá po rekryštalizácii požiadavkám na kvalitu ako USP XXIII, tak európskeho liekopisu (EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 2. vydanie, 1995).

Prehľad obrázku na výkrese

Schéma princípu päťzónovej SMB je uvedená na obr.l.

Opis obrázku 1

Tekutý prostriedok je vedený v kruhu medzi zónami 1 a

4. Pridanie vzorky sa deje medzi zónami 2 a 3. Čerstvý eluent sa pridáva medzi zónami 4 a 1. Rafinát (cyklosporin A) sa odoberá medzi zónami 3 a 4 a extrakt (cyklosporin A + nečistoty) medzi zónou 1 a 2. Každá kolóna je vybavená štyrmi ventilmi na pridanie substancie („feed“), eluentu, extraktu (hodnotný produkt + nečistoty) a rafinátu (hodnotný produkt). „Pohyb“ nosného materiálu je simulovaný posunom zberných a vstupných bodov proti smeru elúcie. Tým sa docieli kontinuálne rozloženie substancie medzi fázami v systéme kolón a koncentrácie eluátu sa na zberných bodoch zdajú konštantné.

Ďalej bolo v pokusnom teste prekvapivo zistené, že oddelenie vedľajších cyklosporínov U a L na jednej strane a G a D na druhej strane sa darí lepšie SMB technikou než konvenčnou chromatografiou a zároveň sú v jednotlivých stupňoch dosiahnuteľné vyššie výťažky. Z toho vyplýva, že je pri porovnateľnej produktivite možné využiť menšie zariadenia, ktoré majú tiež menšiu spotrebu náplne kolón a elučných prostriedkov.

Principiálne je možné využiť SMB techniky tiež v prvom stupni chromatografie (schéma 3). Pritom môže byť v podstate s použitím vhodných surových extraktov (s malým obsahom balastných látok predovšetkým lipofilného charakteru) uskutočnené SMB delenie tiež v prvom stupni v systéme obrátená fáza/acetonitril, voda (schéma 4). Ako bolo ďalej zistené, môžu byť po zámene pozícií rafinátu a extraktu v systéme obrátená fáza/acetonitril, voda od cyklosporínu A oddelené tiež poláme nečistoty. Preto jc tiež možné uskutočniť čistenie cyklosporínu A s použitím systému obrátená fáza/acetonitril, voda dvojstupňovo pomocou SMB techniky alebo môžu byť tiež nepoláme nečistoty oddelené od cyklosporínu A systémom normálnej fázy/etylacetát po zámene pozícií rafinátu a extraktu; je tiež potom možné uskutočniť čistenie cyklosporínu A s použitím systému normálnej fázy/etylacetát dvojstupňovo pomocou SMB techniky.

Schéma 1

Cyklosporín A - surový extrakt

Schéma 3

Cyklosporín A - surový extrakt

V

1. chromatograf. stupeň	Kieselge	lSi 60
Konvenčný preparatívny HPLC	etylacetát

	Hodnotná frakcia 1	Hodnotná frakcia 2
	nepoláma	polárna
	Cy A + Cy G, Cy D atď.	Cy A + Cy L, Cy U atď.

v v

2. chromatograf. stupeň	Si 60
SMB	etylacetát \| etylacetát

Schéma 2

Cyklosporín A - surový extrakt

V

1. chromatograf. stupeň SMB	Si 60 etylacetát
	Rafinát	Extrakt
	Cy A + nepolárne nečistoty	obohatenie polárnych nečistôt (príklad 1)

V

2. chromatograf. stupeň SMB	RP-18 acetonitril, voda
	Rafinát	Extrakt
	CyA	obohatenie nepolárnych nečistôt (príklad 2)

Schéma 4

Cyklosporín A - surový extrakt

V

1. chromatografický stupeň	Kieselgel Si 60
konv. ρτερ. HPLC	etylacetát


	Hodnotná frakcia 1	Hodnotná frakcia 2
	nepoláma	polárna
	Cy A + Cy G, Cy D atď.	Cy A + Cy L,Cy U atď.

V

chromatograf. stupeň SMB	RP-18 Acetonitril / voda
	Rafinát	Extrakt
	Cy A + poláme nečistoty	obohatenie nepolárnych nečistôt (príklad 2)

V

2. chromatograf. stupeň SMB	RP-18 acetonitril, voda
	Rafinát	Extrakt
	obohatenia polárnych nečistôt	CyA

Príklad 1

V v

2. chromatografický stupeň SMB	RP-18	Si 60
	acetonitril, voda	etylacetát

		alebo
		po zámene pozícií extrakt/rafinát:
		RP-18, acetonitril / voda

Oddelenie prevažne polárnych cyklosporínov (cyklosporiny C, B, L, U) od cyklosporínu A v druhej chromatografii pomocou SMB techniky v systéme normálnej fáze/etylacetát.

Zariadenie Kolóna

Stacionárna fáza

Mobilná fáza Surová substancia

LiChrosep^(R) 8-50, pilotné zariadenie 8 kolón, dĺžka 100 mm x 50 mm vnútorný priemer, axiálna kompresia LiChrosespher^(R) Si 60,15 pm etylacetát #011194 cyklosporín čistota [%]

C2,3

B6,9

L0,7

U1,2

A86,2

G	1,0
	D	0,1
	súhrn znečistení	13,8 %
Vklad substancie	roztok v etylacetáte 5,8 g/1
Vkladaný materiál 5,3 ml/min
Eluent	100 ml/min
Recyklácia	151 ml/min
Detekcia	HPLC - analýza v prúde extraktu a rafinátu
Výsledky Rafinát	cyklosporíny	čistota [%]
	C	0,2
	B	0,4
	L	0,0
	U	0,4
	A	97,4
	G	1,1
	D	0,1
	súhrn znečistení	2,6 %
	výťažnosť, cyklosporín A:	>95 %
Extrakt	cyklosporín A	75,5 %
	súhrn znečistení	24,5 %

Výsledok pokusu ukazuje principiálnu možnosť oddelenia prevažne polárnych nečistôt z cyklosporínu A v systéme Si 60/etylacetát.

Príklad 2

Oddelenie prevažne nepolámych cyklosporínov (cyklosporíny G, D) od cyklosporínu A pomocou SMB techniky v systéme RP-18/acetonitril, voda.

LiChrosep(R) 8-50, pilotné zariadenie 8 kolón, dĺžka 100 mm x 50 mm vnútorný priemer, axiálna kompresia LiChrospher(R) RP-18, 15 pm acetonitril/voda - 60/40, objemovo

Zariadenie

Kolóna

Stacionárna fáza

Mobilná fáza Surová substancia

Prívod substancie # 251094 cyklosporíny čistota [%]

L0,3

U0,8

A92,5

G4,1

D1,6 súhrn znečistenia 7,5 % roztok v acetonitrile

Vkladaný materiál 1 g/1

12,7 ml/min.

Eluent 81 ml/min.

Recyklácia Detekcia Výsledky Rafinát

151 ml/min.

HPLC analýza v prúde extraktu a rafinátu cyklosporíny čistota [%] neznáme (a = 3,4)0,1

L0,2

U0,5

A99,1

G0,0

D0,0 neznáme (a = 20,1)0,1 súhrn znečistenia 0,9 % obsah, cyklosporín A (sušina) 99,4 % stupňová výťažnosť, cyklosporín A >95 %

V pokuse dosiahnutá čistota rafinátu predstavuje 99,1 %. Po usušení tejto substancie bol stanovený obsah cyklosporinu A na 99,4 %.

Výsledok ukazuje možnosť oddelenia nepolámych nečistôt od cyklosporínu A v systéme RP-18/acetonitril, voda (60 :40, objemovo).

Príklad 3

Oddelenie prevažne nepolámych cyklosporínov (cyklosporíny C, G, D) od cyklosporínu A v druhej chromatografie pomocou SMB techniky v systéme normálnej fázy/etylacetát pri zámene miesta odberu na extrakt a rafinát.

Zariadenie

Kolóna

Stacionárna fáza

Mobilná fáza Surová substancia

Eluent Detekcia Výsledky Extrakt

LiChrosep(R) 12-96, pilotné zariadenie 8 kolón, dĺžka 100 mm x 26 mm vnútorný priemer, axiálna kompresia LiChrospher(R) Si 60,15 - 25 pm etylacetát cyklosporíny

C čistota [%]

0,04

B0,122

L0,075

A 92,462

G2,934

D4,177 súhrn znečistenia 7,538 %

Prívod substancie roztok v etylacetáte 28 g/í

Vkladaný materiál 1,5 ml/min.

16,4 ml/min.

HPLC analýza v prúde extraktu a rafinátu

cyklosporíny	čistota [%]
C	0,02
B	0,075
L	0,063
A	99,364
neznáme	0,219
G	0,175
súhrn znečistenia	0,636 %
výťažnosť,
cyklosporín A	> 95 %

Výsledok ukazuje, že vyššie zmieneného režimu zapojenia SMB technikou môžu byť v systéme Si 60/etylacetát veľmi dobre oddelené tiež nepoláme nečistoty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

L Spôsob čistenia cyklosporínu A a príbuzných cyklosporínov z cyklosporín A obsahujúceho surového extraktu, ktorý využíva chromatograficky postup so silikagélom ako adsorbentom, vyznačujúci sa tým, že sa

a) v prvom stupni chromatografie pomocou preparatívnej HPLC alebo techniky „simulated moving bed“ surový extrakt frakčných krokov v oddelených koncentračných profiloch rozdelí na nepoláme sprievodné látky obsahujúce hodnotnú frakciu 1 a polárnej šie látky obsahujúce hodnotnú frakciu 2 a

b) hodnotná frakcia 1 (rafinát) a hodnotná frakcia 2 (extrakt) v nasledujúcom druhom stupni chromatografie podrobí ďalšiemu čisteniu pomocou SMB techniky.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa

a) tak prvý, ako aj drahý stupeň chromatografie uskutočňuje v systéme normálna fáza/etylacetát alebo obrátená fáza/acetonitril, voda,

b) hodnotná frakcia 1 (rafinát) pomocou SMB techniky v systéme obrátená fáza, acetonitril/voda a hodnotná frakcia

2 (extrakt) podrobí druhému stupňu chromatografie v systéme normálna fáza/etylacetát,

c) hodnotná frakcia 2 (extrakt) pomocou SMB techniky v systéme obrátená fáza/acetonitril, voda a hodnotná frakcia 1 (rafmát) podrobí druhému stupňu chromatografie v systéme normálna fáza/etylacetát.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa zavedením piatej zóny uskutoční premývanie najprv alkoholom a následne tekutým prostriedkom a že sa viac kolón v piatej zóne takto premýva v paralelnom zapojení.
4. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa delenie v druhom stupni chromatografie uskutočňuje v systéme obrátená fáza acetonitril/voda v pomere acetonitril/voda 40 až 80 k 20 až 60, prednostne 60 : 40, kde pomery sú uvedené objemovo.
5. Spôsob podľa nároku 1 a 2, vyznačujúci sa t ý m , že sa kolóny a tekutý prostriedok v SMB zariadení udržuje v rozmedzí teplôt od 40 do 80 °C, prednostne ale pri 60 °C.
6. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa v systéme obrátená fáza/acetonitril, voda hodnota pH tekutého prostriedku nastavuje v rozmedzí 2 až 5, prednostne ale na 3.