KR100467127B1 - 고도로정제된사이클로스포린a및관련된사이클로스포린을수득하기위한크로마토그래피방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사이클로스포린을 함유하는 조 추출물을 산업상 규모로 정제하기에 적합한 신규한 크로마토그래피 방법에 관한 것이다. 이 방법에서는 통상적인 예비 크로마토그래피 분리 방법이 모사이동층(SMB) 방법으로 완전히 또는 적어도 부분적으로 대체된다. 수득된 사이클로스포린 A는 USP XXIII 및 EUROPEAN PHARMACOPOEIA(제2판, 1995)에 기술되어 있는 품질에 대한 요건에 부합한다.
Description
도 1의 내용은 다음과 같다. 제1구역과 제4구역 사이에서 용리액이 순환된다. 샘플 주입물(feed)은 제2구역과 제3구역 사이에 도입시킨다. 새로운 용리액은 제4구역과 제1구역 사이에 첨가한다. 라피네이트(사이클로스포린 A)는 제3구역과 제4구역 사이에서 회수하고, 추출물(사이클로스포린 A + 불순물)은 제1구역과 제2구역 사이에서 회수한다. 이러한 통합 시스템의 경우, 각각의 칼럼에는 주입물(주입 물질), 용리액, 추출물(유용한 생성물 + 불순물) 및 라피네이트 (유용한 생성물)를 위한 4개의 밸브가 장착되어 있다. 지지 물질의 "이동"은 용리 방향과 반대 방향으로 수집 위치와 주입 위치를 이동시킴으로써 모사된다. 이러한 방법으로, 이 칼럼 시스템에서 상(phase)간에 지속적으로 물질 분배가 이루어질 수 있으며, 회수 위치(withdrawal point)에서의 용출액 농도는 일정한 것으로 보인다.
실시예 1
정상 상 시스템/에틸 아세테이트에서 SMB 기술을 이용한 사이클로스포린 A로부터 주로 극성 사이클로스포린(사이클로스포린 C, B, L, U)의 분리
본 실험의 결과를 통해, 원칙상 Si 60 시스템(에틸 아세테이트)에서 사이클로스포린 A로부터 특히 극성 불순물을 분리할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
RP-18 시스템 아세토니트릴/물에서 SMB 기술을 이용한 사이클로스포린 A로부터 주로 비-극성 사이클로스포린(사이클로스포린 G, D)의 분리
본 결과를 통해, RP-18 시스템 아세토니트릴/물(60:40, v/v)에서 사이클로스포린 A로부터 비-극성 불순물을 분리할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
라피네이트/추출물의 위치를 교환한 후, 정상 상 시스템/에틸 아세테이트에서 SMB 기술을 이용한 2번째 크로마토그래피에서의 사이클로스포린 A로부터 주로 비-극성 사이클로스포린(사이클로스포린 C, G, D)의 분리
본 결과를 통해, 정상 상 시스템 실리카 겔 Si 60/에틸 아세테이트에서 SMB 기술을 이용하여 비-극성 불순물을 분리할 수 있다는 것을 알 수 있다. 반면에, 이러한 경우에는 전술한 바와 같이 라피네이트/추출물의 위치를 교환해야 한다.
본 발명은 약제 산업부문에 사용하기에 적합한 사이클로스포린 A(Cy A) 및 관련된 사이클로스포린의 신규한 크로마토그래피 정제 방법에 관한 것이다.
본 방법을 통해, 경제적으로 유리한 조건하에서 약제학적으로 허용가능한 순도를 갖는 상기의 활성 화합물을 수득한다. 즉, 사이클로스포린 A를 예로 들면, PHARMEUROPA(PHARMEUROPA Vol. 4, No. 4, p. 270, 1992년 12월)에 기술되어 있는 순도에 관한 요건을 충족하고 있다.
A. Ruegger 및 그의 동료들이 트리코더마 폴리스포럼(LINK ex PERS.) 라이파이로부터 사이클로스포린 A를 성공적으로 분리함으로써[Helv. Chim. Acta 59, 112 (1976)], 새로운 강력한 면역 억제제 부류의 물질을 최초로 사용할 수 있게 되었다. 한편, 집중적인 연구 결과, 면역 억제 및 항균 활성을 갖는 25 종류 이상의 관련된 사이클로스포린을 밝혀냈다[R. Traber 등, Helv. Chim. Acta 70, 13(1987)].
오늘날, 사이클로스포린 A가 장기 이식후에 나타나는 면역 방어를 억제하는데 사용하는 매우 중요한 제제라는 것에 대해서는 반론이 없다. 따라서, 이러한 생명을 구하기 위한 약제를 제조하는 방법을 개선시킴으로써, 그 양과 질에 대해 계속 증가하는 필요 요건들을 충족시키기 위해 꾸준히 노력해왔다.
현재까지 알려져있는 사이클로스포린 A를 함유하는 조(crude) 추출물의 정제 방법에는 유기 용매를 용리액(eluent)으로 사용하는 다단계의 크로마토그래피가 대개 포함된다.
따라서, 상기한 A. Ruegger의 연구 내용을 보면, 제1단계에서는 증가량의 메탄올 중의 클로로포름을 사용하여 실리카 겔 60 머크(0.063-0.2mm)상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 수득된 생성물을 메탄올중의 Sephadex LH 20 상에서 겔 크로마토그래피를 한 후, 에틸 아세테이트의 양을 증가시키면서 톨루엔 중의 알루미나(Brockmann, Act. I)상에서 최종적으로 크로마토그래피하였다.
이후의 연구에서도 이와 유사한 공정을 사용하고 있다(표 1 참조). 흡착제로서 Sephadex LH 20, 실리카 겔 60 머크(0.063-0.2mm) 및 중성 알루미나가 자주 사용된다.
대개 사용되는 용리액은 유기 용매 혼합물이다.
클로로포름 및 염화메틸렌은 높은 독성 때문에 사용하기에 적합하지 않은데, 이는 활성 화합물중에 잔존하는 용매 잔류물 및 상대적으로 많은 양의 이러한 성분을 처리하는 공정(증류, 폐기) 중에 발생하는 안전 문제에 기인한다.
게다가, 구배(gradient) 또는 복합(예를 들면 3-원)의 등용매 혼합물을 사용하는 경우, 용출액(eluate)을 증류한 후에 용리액을 다시 조정한다는 것은 번거로울 뿐만 아니라 비용도 많이 든다.
크로마토그래피를 하기 전에 조 추출물에 대해 온도 처리를 수행하는 캐나다 특허 CA 2 096 892에서 BIOGAL이 기술한 방법도 이와 유사하게 평가된다.
조 생성물을 약 1시간 동안 약 110℃에서 가열한 후, 정해진 조건하에서 5시간에 걸쳐 실온으로 냉각시킨다. 높은 비율의 염소화 탄화수소를 사용하여, 순차적으로 사용되는 2개의 용리액 시스템에서 실리카 겔 60 상에서의 단일 단계의 크로마토그래피를 통해 투입량의 약 15%의 사이클로스포린 A를 순도 약 97.6%로 분리한다. 그러나, 산업적인 용도 측면에 있어서, 수득되는 활성 화합물의 수율 및 순도에 관한 이러한 결과는 만족스럽지 못할 수도 있다. 게다가, 이러한 복합 천연 물질은 온도에 불안정하며, 이성화 반응(isomerization)이 발생할 수 있기 때문에 온도 스트레스에 노출시켜서는 안된다는 것은 경험상 알려져 있는 사실이다.
현재 알려져 있는 바로는, FUJISAWA[WO 제9 213094호] 및 BIOGAL[CA 제2 096 892호]의 출원에서만 단일 단계의 크로마토그래피 정제를 다루고 있다. 그러나, 이를 위해서는 복합 용리액 배합 또는 구배가 필요한데, 이로 인해 용리액 재생이 더욱 어렵게 된다.
반면에, 달성되는 수율 및 생성물의 순도에 관해, 이 방법을 좀더 정확하게 평가하기 위해 필요로 하는 상세한 설명이 대부분 부족하다.
현재 알려져 있는 사이클로스포린 A의 크로마토그래피 정제 방법에 관한 몇가지 예
SMB 기술에 관해서는 문헌에 간단히 기술되어 있다[참조: 예를 들면, R. M. Nicoud, LC-GC INTL Vol. 5, No. 5, 43-47 및 K. K. Unger(Ed.), Handbuch der HPLC (HPLC Handbook), Part 2, GIT Verlag, Darmstadt, 1994](도 1 참조).
여기서 개요를 설명한 선행 기술을 살펴보건대, 생성물의 순도 및 수율에 관한 고도의 요건들을 충족하는 진보성이 있는 사이클로스포린 A의 크로마토그래피 정제 방법을 수득하기 위해서는 하기의 사항들이 충족되어야 한다.
- 신규한 공정에서는 PHARMEUROPA에 상응하는 품질을 가지며, 사용된 사이클로스포린 A 양의 70% 이상을 수득해야 한다(크로마토그래피 정제 단계에 기초한 것이다).
- 이러한 공정은 연간 처리량(throughput)에 관한 가장 엄격한 요구 조건들을 충족해야하고, 이와 동시에 정지상(stationary phase)을 위해 필요로 하는 용매 및 물질을 급감시켜야 한다.
- 이러한 기술적 해결책은 단순, 신속 및 강력해야 하는데, 즉 용매 및 흡착제는 가능한 한 오랜동안 재사용이 가능해야 한다. 따라서, 등용매적으로 사용되어야 하기 때문에 조정 또는 재생하기가 곤란한 용매 혼합물 및 구배는 사용할 수 없다.
- 염소화 탄화수소를 사용해서는 안된다.
- 이러한 방법은 자동화, 즉 연속 작동이 가능해야 하며, 동시에 GMP에 따른 생산 조건들을 충족해야 한다.
크로마토그래피 정제에 사용되는 출발 물질은, 예를 들면 공지의 방법[예를 들면, DD 제295 872 A5호]을 사용하여 사이클로스포린 A를 함유하는 건조 균사체(mycelium)로부터 추출(에틸 아세테이트) 및 탈지방(석유 스피리트/메탄올/물)에 의해 수득한 조 추출물인데, 여기에는 대부분 알려져 있지 않은 수 많은 황색 또는 적색의 물질 및 오일성 생성물 이외에도 하기의 사이클로스포린 조성물이 포함되어 있다.
1)PHARMEUROPA Vol. 4, No. 4, 270 ff에 따른 HPLC 분석 측정
크로마토그래피 제1단계에서는, 극성 사이클로스포린(C, B, L, U)과 비-극성 사이클로스포린(G, D)을 분리하여, 사이클로스포린 A 이외에 극성 또는 비-극성 불순물만을 함유하는 2 종류의 유용한 분획물을 수득한다. 이러한 방법으로, 크로마토그래피 제2단계에서는, 이러한 각각의 불순물로부터 사이클로스포린 A를 용이하게 정제할 수 있다.
본 발명에 따라, 기존의 HPLC와 모사이동층(Simulated Moving Bed, SMB) 기술을 결합한 크로마토그래피 정제법을 사용하여 사이클로스포린 A를 초정제(ultrapurification)한다(하기 참조):
크로마토그래피 제1단계: HPLC 또는 SMB 기술
크로마토그래피 제2단계: SMB 기술
반응식 1 내지 4 참조.
더 정확하게는, 본 발명은
a) 크로마토그래피 제1단계에서, 분리된 농축 프로파일 중의 분획물 컷(fraction cut)에 의해 예비 HPLC 또는 SMB 기술을 사용하여 비-극성 부수물(concomitant)을 함유하는 유용한 분획물 1 및 보다 극성을 띠는 부수물을 함유하는 유용한 분획물 2로 조 추출물을 분리한 후,
b) 유용한 분획물 1(라피네이트, raffinate) 및 유용한 분획물 2(추출물)를 SMB 기술을 이용하여 후속적인 크로마토그래피 제2단계에 도입시키는 것을 특징으로 하는, 실리카 겔을 흡착제로 이용하는 크로마토그래피 방법을 사용하여 사이클로스포린을 함유하는 조 추출물로부터 사이클로스포린 A 및 관련된 사이클로스포린을 정제하는 방법에 관한 것이다. 크로마토그래피 제1단계 및 제2단계 모두 정상 상 시스템(에틸 아세테이트) 또는 역상 시스템(아세토니트릴/물)에서 수행할 수 있다.
특히, SMB 기술을 사용함으로써 얻게 되는 잇점을 아래에 기술하였다:
- 불연속적으로 물질을 주입할 필요가 없는 신규한 크로마토그래피 방법에 의해 완전 연속 공정이 가능하다. 이와 같이 연속적으로 작동하는 크로마토그래피 방법은 특히 산업상 용도로 이용하기에 유리하다.
- SMB 기술을 사용함으로써, 과거에 비해 더 농축된 용액으로 작업을 수행할 수 있게 되었다. 이 결과, 용매에 관한 요구 조건들이 완화되었으며, 이와 동시에 용매를 회수하는 데에 걸리는 시간도 감소하였다.
이와 같은 경제적인 변수에 따라, 생명 공학적인 방법에 의해 생산된 단백질 및 아미노산을 크로마토그래피 방법으로 분리하는 경우에도 SMB 기술을 많이 사용하고 있다[참조: Nadler, T.K., Sch.Sci., Purdue Univ. East Lafayette, IN 47907 USA; Adachi, S. 등, Agric. Biol. Chem. 1991, 55, 925-32].
또한, 본 경우와 같은 사이클로스포린 A를 함유하는 생성물을 정제하는 경우, 기존의 크로마토그래피 방법과 비교하여 SMB 기술이 우월하다는 것을 알 수 있다.
- HPLC 기술과 SMB 기술의 효율 비교
스위칭 시간 함수로서 용리 전선(elution front)의 준-정체 상태(quasi-stationary state)를 보장하기 위해, 다양한 각각의 흐름(flow)을 정확하게 조정하는 것이 SMB 분리에 있어서 가장 중요한 기술적 필요 조건이다(실시예 참조).
게다가, SMB 분리를 최적으로 조정하기 위해, 사용된 크로마토그래피 시스템에서의 유용한 생성물 및 불순물의 흡착 등온선(adsorption isotherm)을 정확하게 알 필요가 있다. 이들은 분석적으로 미리 측정되어야 한다.
또한, 소위 제5구역(zone)을 도입함으로써, 통상적인 2 성분의 4 구역 SMB 분리 방법을 사용하지 않을 수가 있었다. 이렇게 추가된 구역내에 장착된 세척 시스템을 사용하여, 동일한 수행에서도 사이클로스포린 A에 대해 극한의 k' 수치를 갖는 불순물을 제거할 수 있다. 따라서, 유용한 생성물의 질이 향상될 수 있다. 통상적으로, 표준 SMB 기술을 이용하는 경우, 0.6 내지 2.0의 k' 수치를 갖는 혼합물들을 용이하게 분리할 수 있다(k'=1은 유용한 생성물을 의미한다). 반면에, 이 범위를 벗어나는 성분은 추출물중에서 불완전하게 세척되어, 주입물(feed)에 비해 라피네이트에서 농축이 일어난다[도 1 참조].
본 발명에 따른 신규한 공정에 있어서, 제4구역과 제1구역간에 스위칭(switching)이 일어나자마자, 칼럼을 강한 용리력을 갖는 용매(예를 들면, 메탄올)로 세척하여 정의된 상태로 만든다. 그리고 나서, 제5구역내에 위치한 당해 장치의 칼럼을 1 사이클 동안 다른 4개의 구역으로 이루어진 폐환 유니트로부터 완전히 분리시킨다[도 1 참조].
제5구역을 하기의 2단계로 나눈다:
1. 제1단계에서는, 제5구역에 있는 칼럼을 강한 용리력을 갖는 적합한 용매로 세척하여, 불순물이 부착되어 있는 정지상을 세정한다.
사용되는 세정제(rinsing agent)로는 메탄올이 바람직하다. RP 물질을 세정하는 경우, 순수한 아세토니트릴을 사용할 수도 있는데, 이로써 용매를 추가할 필요가 없어짐으로써 용매의 회수 문제가 간단해진다.
2. 제2단계에서는, 세정 과정이 세정제로부터 특정 분리를 위해서 필요한 용리제로 변한다.
칼럼을 구역내에 분포시켜 제5구역내에 다수의 칼럼이 위치해 있는 경우, 이 칼럼들이 세정 과정이 이루어지는 동안 평행하게 연결되어 있는 경우에 세정 방법이 강화될 수 있다.
크로마토그래피 제1단계에서의 소위 유용한 분획물 2를 초정제함에 있어서, 이 공정을 더 최적화시킬 수 있었다. 특히, 이 분획물에는 사이클로스포린 A 이외에 사이클로스포린 U 및 L과 같은 보다 극성을 띄는 불순물이 함유되어 있다. SMB 플랜트상의 추출물과 라피네이트의 회수 지역(withdrawal site)을 교환한 후에, 이 유용한 분획물 2를 매우 쉽게 분리할 수 있다는 놀라운 사실을 알게 되었다. 이와 관련하여, 극성 불순물이 유용한 생성물인 사이클로스포린 A보다 먼저 용리되는데, 즉 이러한 극성 불순물들은 사이클로스포린 A보다 정체 시간(retention time)이 짧다. 이는 크로마토그래피 제2단계에서 이러한 특정 SMB 시스템을 사용하는 경우, 이 단계에서 RP-18 시스템을 배타적으로 사용할 수 있다는 것을 의미하는데, 이로써 용매의 회수가 매우 단순화된다[반응식 2 참조].
하기의 3개의 실시예를 통해 SMB 기술의 적합성을 확인할 수 있다.
실시예 1에서는, 정상 상 시스템 실리카 겔 Si 60/에틸 아세테이트에서 SMB 기술을 사용하여 중간체를 초정제한 것을 보여주고 있다. 사이클로스포린 A 이외에도, 사용된 생성물에는 주로 극성이 큰 불순물이 함유되어 있다.
결과에서 볼 수 있듯이, 극성 사이클로스포린(특히, U와 L 및 또한 B와 C)이 급격히 감소되었다는 사실에 주목해야 하는데, 이로써 SMB 기술과 병용하는 분리 시스템이 원칙상 적합하다는 것이 명백하다.
실시예 2에서는, RP-18 역상 시스템 아세토니트릴/물(60:40, v/v)에서 SMB 기술을 사용하여 유용한 분획물 1로서 주로 비-극성 불순물을 함유하는 중간체를 초정제하는 것에 대해 기술하고 있다. SMB 분리의 결과, 비-극성 사이클로스포린(특히, G 및 D)이 급격히 감소하였음이 관측된다. 이와 동시에, 이러한 상 시스템은 그 효능이 보다 높다는 것이 밝혀졌는데, 건조 후에 수득된 사이클로스포린 A의 높은 최종 순도 및 함량을 통해 알 수 있다.
실시예 3에서는, 정상 상 시스템 실리카 겔/에틸 아세테이트에서 SMB 기술을 사용하여 주로 비-극성 불순물을 함유하는 중간체를 초정제하는 것에 대해 기술하고 있다. 실시예 1과는 달리, 라피네이트의 위치를 교환함으로써 비-극성 불순물이 급감하였을 뿐만 아니라 용매의 소비량도 감소하였다.
재결정화후에 수득된 사이클로스포린 A는 USP XXIII 및 EUROPEAN PHARMACOPOEIA(제2판, 1995)에 기술되어 있는 품질에 대한 요건에 부합한다.
이러한 미세 분리는 놀라운 사실이며, 이는 몇 년 전까지만 해도, 분석 HPLC를 이용하더라도 사이클로스포린 A와 이러한 크로마토그래피상 극히 유사한 불순물간의 상호 분리는 불가능했었기 때문이다.
게다가, 놀랍게도 통상의 크로마토그래피에 비해 SMB 기술을 사용하는 경우, 한편에서는 부수적 사이클로스포린 U와 L이, 다른 한편에서는 G와 D가 더 완전하게 분리됨과 동시에, 이러한 단계에서 수율도 더 높다는 사실이 실험 테스트를 통해 밝혀졌다. 이러한 결과를 통해, 생산성은 높으면서도 플랜트의 크기는 작게할 수 있게 되었는데, 따라서 칼럼 충진 물질 및 용리액의 필요성이 상대적으로 작다.
물론, 원칙적으로는 SMB 기술을 크로마토그래피 제1단계에서도 사용할 수 있다(반응식 3 및 4 참조). 원칙상, SMB 분리는 제1단계에서도 적합한 조 추출물(불활성 물질, 특히 친지성 물질을 소량 부하한 것이다) 존재하에서 역상 시스템 아세토니트릴/물에서 수행할 수 있다(반응식 4 참조). 추가로 확인된 바와 같이, 극성이 큰 불순물은 사이클로스포린 A의 라피네이트/추출물 위치를 교환한 후, 역상 시스템 아세토니트릴/물에서 분리할 수도 있기 때문에, 역상 시스템 아세토니트릴/물만을 사용하는 SMB 기술을 이용하여 2 단계로 사이클로스포린 A를 정제할 수도 있다.
이와 동일하게, 라피네이트/추출물 위치를 교환한 후, SMB 기술을 이용하여 정상 상 시스템 실리카 겔 Si 60/에틸 아세테이트에서 비-극성 불순물을 분리할 수도 있다. 따라서, 정상 상 시스템 실리카 겔/에틸 아세테이트만을 사용하는 SMB 기술을 이용하여 2 단계로 사이클로스포린 A를 정제할 수도 있다.
[반응식 1]
[반응식 2]
[반응식 3]
[반응식 4]
Claims (9)
- 흡착제로서 실리카 겔을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 사이클로스포린을 함유하는 조 추출물로부터 사이클로스포린 A 및 관련된 사이클로스포린을 정제하는 방법에 있어서,a) 크로마토그래피 제1단계에서 예비 HPLC 또는 모사이동층(Simulated Moving Bed, SMB) 기술을 이용하여, 분리된 농축 프로파일에서의 분획 컷(fraction cut)에 의해 조 추출물을, 사이클로스포린 A와 부수물로서의 사이클로스포린 G 및 D를 함유하는 분획물 1, 및 사이클로스포린 A와 부수물로서의 사이클로스포린 C, B, L 및 U를 함유하는 분획물 2로 분리한 후,b) 크로마토그래피 제2단계에서 SMB 기술을 이용하여, 상기 분획물 1(라피네이트) 및 상기 분획물 2(추출물)를 추가로 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,a) 정상 상 시스템 에틸 아세테이트 또는 역상 시스템 아세토니트릴/물에서 크로마토그래피 제1단계 및 제2단계 모두를 수행하거나,b) SMB 기술을 이용하여, 상기 분획물 1(라피네이트)을 역상 시스템 아세토니트릴/물에서 크로마토그래피 제2단계에 도입시키고, 상기 분획물 2(추출물)를 정상 상 시스템 에틸 아세테이트에서 크로마토그래피 제2단계에 도입시키거나,c) SMB 기술을 이용하여, 상기 분획물 2(추출물)를 역상 시스템 아세토니트릴/물에서 크로마토그래피 제2단계에 도입시키고, 상기 분획물 1(라피네이트)을 정상 상 시스템 에틸 아세테이트에서 크로마토그래피 제2단계에 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 4 구역 SMB에 제5구역을 도입하여 처음에는 알콜, 그 다음에는 용리액을 사용하여 세정 단계를 수행하며, 제5구역내에서 다수의 칼럼을 사용하는 경우 이들을 평행하게 유동시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 아세토니트릴/물의 비가 40:60 내지 80:20(v/v)인 역상 시스템 아세토니트릴/물에서 크로마토그래피 제2단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SMB 단계 동안 칼럼 및 용리액을 온도 40 내지 80℃로 유지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 역상 시스템 아세토니트릴/물에서의 용리액의 pH가 2 내지 5임을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 아세토니트릴/물의 비가 60:40임을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 온도가 60℃임을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, pH가 3임을 특징으로 하는 방법.
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