JPS6367569A - クロマトカラムによる分取方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はクロマトカラムによる分取方法に係り、詳しく
は試料中の目的成分の粗分離及び精製分離を一つのクロ
マトカラムで行う方法に関する。

［従来の技術］ クロマトグラフィー法で試料から目的成分を分離、回収
する場合、１回のクロマト分離では十分に満足し得る純
度及び回収率で目的成分の分前、回収が達成し得ない場
合がある。

このような場合、回収効率を向上させるためにクロマト
グラフィーによる分取を粗分離及び精製という２段階式
で行う方法は従来より採用されており、２段階式クロマ
ト法には、粗分離及び精製のそれぞれに専用カラムを設
け、両者独自に分離工程と洗浄工程とをおりまぜて行う
方法と、単一のカラムで粗分離工程、洗浄工程及び精製
工程、洗浄工程の組み合わせをおりまぜて行う方法があ
る。

［発明が解決しようとする問題点コ 単一カラムで粗分離及び精製分離を行う方法は、各々に
専用カラムを設ける方法に比し、設備費や装置設置スペ
ースの面で有利であるという利点を有するものの、処理
時間が長いという欠点がある。

即ち、従来、単一カラムで粗分離、精製の２段階処理を
行う場合、処理操作を模式的に示すと通常、下記の如く
である。

このように、従来においては、粗分離、精製分離を問わ
ず、分離工程の後には必ず洗浄工程を導入しているため
、目的成分の分離、回収に要するトータル時間が長く、
しかも洗浄液使用量も多いという問題があった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、精製分離を行った後、精製分離の通液方法と
同方向に通液して粗分離を行い、次いで各分離工程の通
液方向と反対方向に洗浄液を通してカラムを洗浄するよ
うにしたものである。

即ち、本発明の方法は、クロマトグラフィーによる分取
を、粗分離、精製という２段階式で行う場合、精製−粗
分離一向流洗浄一精製一・・・のサイクルで行うもので
ある。

以下、本発明の構成につき、その作用と共に更に詳細に
説明する。

クロマトグラフィーにより粗分離及び精製の２段階で試
料中の目的物質の分離、回収を行う場合、精製工程の原
液の成分は、粗分離工程の回収域の成分であり、これは
大部分の目的物質と少量の目的物質よりもカラム充填剤
への保持力がわずかに弱い物質とわずかに強い物質との
混合物であると考えられる。従って、精製工程の目的物
質回収後のカラム内には、目的物質よりもわずかにカラ
ム充填剤への保持力の強い物質が残存しているのみと推
定される。しかして、このような物質は、当然、目的物
質回収後も溶出を続け、その濃度は次第に低くなってい
く。

精製工程を連続して行グ場合、このような他物質のリー
クもなくす必要があり、洗浄工程を挟むのが好ましいが
、精製に比べて要求される純度の低い粗分離を次に行う
場合　、前Ｒｕｎの精製工程から続いているリークの影
晋は小さく、殆ど純度低下の要因とはならない。例えば
、粗分離工程の回収域の目的成分濃度が５０００　ｍ　
ｇ　／　１１の場合は、前Ｒｕｎから続くリークが５０
　ｍ　ｇ　／　１１の濃度であっても、それによる純度
の低下は１％以下になる。

従って、精製工程ののちに粗分離を行う場合には、予め
要求される純度等に応じて純度低下の許容範囲を適宜設
定しておき、純度低下がこの許容範囲内となるように１
Ｎ製工稈の相分枡Ｔ程の開始のタイミングを調整して同
方向で通液を行うことにより、精製工程と粗分離工程と
の間に洗浄工程を設けなくても、高純度、高回収率で分
離、回収が可能となる。

以下に、本発明により、糖混合液から特定の糖を分取す
る場合の溶出状態を説明する概念図を示す第１図を参照
して、本発明をより詳細に説明する。

精製工程においては、その開始、即ち、粗分離により得
られた回収液の注入より一定時間後に成分の溶出が始ま
り、目的物質の回収域に至る。目的物質の回収域（図中
、Ａ−Ｂ）の後には、前述の如く目的物質よりカラム充
填剤への保持力がわずかに強い物質が溶出しているが、
回収酸経過後所定のタイムラグを設けた後、糖混合液を
注入して直ちに粗分離工程を開始する（図中、Ｃ）。こ
の際、粗分離工程の通液方向は精製工程の通液方向と同
方向とする。（第１図においては下向流としているが、
上向流としても良い。） この粗分離工程の開始点Ｃは、粗分離の回収域の開始点
りに到達した時に、精製工程の残留成分の溶出が殆ど問
題とならない濃度で、粗分離の回収純度の低下が予め設
定した許容範囲内とするように、粗分離の開始から回収
開始までの時間（Ｄ−Ｃ）、ＩＷ製工程の残留成分の溶
出濃度の低下状況等を勘案して適宜設定する。

粗分離工程の回収酸経過後（図中、Ｅ）、直ちに精製工
程及び粗分離工程の通液方向とは逆方向、図においては
上向流で洗浄液（本例ではイソプロパツール（Ｉ　ＰＡ
溶液）を通液して洗浄を開始する。

この洗浄液を分離工程と逆方向で通液して向流洗浄を行
う作用効果は下記の通りである。

即ち、クロマトグラフィー法で目的成分を含む試料から
目的成分な＊＊、回収する場合、回収直後のカラム内に
は、目的成分よりも充填剤に保持され易い成分が残存し
ている。その時点におけるカラム内の残存成分の分布状
態の概念図を第２図に示す。

第２図中Ａとは、回収した目的成分に比べわずかに充填
時への保持され易さが強い成分であり、Ｅとは、カラム
内残存成分中で最も充填剤への保持され易さが強い成分
である。Ｂ、Ｃ，ＤはＡとＥの中間の保持され易さをも
つ成分である。

分離工程開始から終了（目的成分の回収終了）までにカ
ラムに通液した溶離液の全をＶとする。

溶離液をＶ流す間に、Ａ成分はａという距離だけ移動し
、同様にＢ成分はｂという距離・・・・・・Ｅ成分はｅ
という距離だけ移動した訳である。

そこで、分離終了時点から分離工程に対して自流になる
ように、分離工程の溶離液と同じものを通液すると通液
量がＶになった時に、Ａ−Ｅ各成分はａ　−ｅという距
離移動し、カラム末端（分離工程の入口）に達すること
になる。実際には、Ａ〜Ｅ各成分ともカラム内で拡散す
るので、洗浄通液量はＶだけでは不足だが、Ａ−Ｅ各成
分は、洗浄通液量Ｖの時にピークをもつ混合物となって
カラム末端から排出される。

従って、分離工程と逆の向きで洗浄する方法が極めて効
果的である。さらに、効果的にするためには、分離工程
の溶離液の濃度を変えたものを洗浄液とすると良い。

洗浄工程で必要な量の洗浄液（洗浄剤の溶蔑力が強いほ
ど必要液量は少なくて済む）を注入した後は、次の分離
のために、分離に用いる溶離液で洗浄剤を押し出し、カ
ラムを安定化させる。

洗浄後の安定化により、第１図に示す如くカラム溶出液
のＩＰＡ濃度が安定化する。即ち、分離工程の溶離液の
濃度を高くしたものを洗浄液とする場合には、洗浄液注
入後の安定化のための溶離液通液で、カラム溶出液濃度
は次第に低下してゆき、溶離液濃度で安定する。

なお、このように洗浄安定化を行った後、次の精製分離
工程を行う場合には、洗浄液の通液方向と同方向に通液
を行うのが好ましい。洗浄液と同方向で次の精製工程の
通液を行なう場合には、精製開始を洗浄後の安定化終了
より所定時間前にすることができる。

即ち、溶離液の濃度を高くしたものを洗浄液として用い
た場合、洗浄後溶離液による押し出し安定化で、カラム
が十分安定化するまでは、カラム内には溶離液よりも高
濃度の液が通液されている状態となっている。このため
、安定化したカラムと同等の分離性能は得られず、通常
は分離成分が早目に溶出する側にその分離性能がずれて
いる。

一方、精製に供する試料のうちで、重要なものは目的物
質、即ち目的物質回収酸付近であるので、この部分の吸
着帯が順次安定化されたカラムを通過していくようであ
れば良い。

このようなことから、本発明においては、第１図に示す
如く、カラムの安定化終了時（Ｈ）より精製開始から回
収域に至るまでに要する時間、即ち１時間前を精製開始
点（Ｆ）とし、カラムの安定化終了時に目的物質回収域
（Ｇ）に達するようにするのが最も好ましい。

このように、洗浄工程の後に、更に前述の如く、精製−
粗分疏一洗浄を繰返して行うことができる。

このような本発明の方法によれば、粗分離及び精製とい
う２段階式のクロマト分取を１つのカラムで行う場合に
おいて、分取に要するトータル時間を大幅に短縮し、ま
た必要とする洗浄液量の低減を図ることができる。

［実施例コ マルトオリゴ糖混合物から０５を２段階式クロマト法で
分取する場合の例を示す。

く粗分離工程〉 原　液二０５含有率３０％のマルトオリゴ糖混合物（Ｇ
ｌ−Ｇ２１＋程度）の水溶液（濃度２０％） 注入量：　８　ｇ−１１１／ｘ−Ｒ（２，４８−Ｇａ　
／Ａ−Ｒ） 溶離液：０．８％シ／ｖｌＰＡ水溶液 カラム：吸着樹脂　セパビーズＳＰ　２０７（三菱化成
工業味製）を充填した１００ｍｍφ Ｘ４０００ｍｍＬのカラム 流　　速：　ＳＶＶＯ２４Ｈ−’ 洗浄済みのカラムを用い、以上の条件で分離開始後２３
０〜３３０分の部分を回収したところ、−収液の０５含
有率は８７％、Ｇ５回収率は６８％（１、６３８−Ｇ　
ｓ　／　Ｊ２−・Ｒ）であった。この分画をｖＡｉａシ
、精製工程の原液とした。なお、回収域の糖濃度は２８
００ｐｐｍ（Ｇｓのみでは２４４０ｐｐｍ）であった。

く精製工程〉 原　液二Ｇ５含有率８７％のマルトオリゴ糖混合物水溶
液（粗分離で得たもの）。

Ｇ５以外の成分は０１〜Ｇ４、Ｇ６の み（濃度１０％） 注入量：１．８４ｇ−糖／Ｊ！−Ｒ（１，６３／Ｇ５／
旦−Ｒ） 溶離液：粗分離工程と同じ 流　速：５Ｖ＝０．３Ｈ−’ 洗浄済みのカラムを用い、以上の条件で分離開始後３４
０〜５００分の部分を回収したところ、回収液の０５含
有率（純度）は９８．５％、０５回収率は７８％（１、
２５ｇ　−Ｇ　ｓ　／　ｆｌ　−Ｒ）であった。

Ｇ５域回収後も溶離液を流し続けたところ、精製工程開
始から４．３８．Ｖ、の時、溶出液の糖（成分は殆どＧ
ａ）の濃度は２０ｐｐｍまで低下していた。

く洗浄工程〉 洗浄液：１０％ν／　ｖ　Ｉ　Ｐ　Ａ水溶液洗浄剤ｆＨ
：　６０ｍｕ−Ｉ　ＰＡ／４２−Ｒ（０，６Ｂ、Ｖ、） 押し出し液：分離工程溶離液（＝Ｏ，ａ％シ／シＩＰＡ
水溶液） 流　　　速　：５Ｖ＝０．　４Ｈ−’ 通液方向：前分離工程に対して自流 以上の条件で洗浄を行ったところ、１．６Ｂ、Ｖ、まで
にカラム内の残存糖は殆ど洗い出され、それ以降のカラ
ム溶出液の糖濃度は３ｐｐｍ以下であった。洗浄工程開
始後３．６Ｂ、Ｖ。

（９時間）の時点で、カラム溶出液のＩＰＡ濃度は０，
８％ν／νになり、安定した。

分取方法■（比較例） 上記３工程を第３図に示す如く、粗分離−洗浄−精製→
洗浄という組み合わせで行ったところ、トータル所要時
間は２５時間で、要したＩＰＡ量は、１８４ｍＪ２−Ｉ
ＰＡ／ｉ−Ｒであった。

分取方法ｎ　（本発明例） 上記３工程を第４図に示す如く、精製−粗分離−洗浄と
いう組み合わせで行ったところ（即ち、粗分離には精製
後未洗浄のカラムを用いた）、トータル所要時間は２１
．５時間で、要したＩＰＡ量は、１１７ｍｊ２−　Ｉ　
ＰＡ／Ｉｔ−Ｒであった。

なお、粗分離回収液及び精製液の０５純度及び回収率は
、分取方法ｌの場合とほぼ同等であった。

［発明の効果コ 以上の実施例からも明らかな通り、本発明によれば、粗
分離及び精製という２段階式のクロマト分取を１つのカ
ラムで行う場合において、洗浄に要する洗浄量を低減で
き、トータルで必要な溶媒量を減らすことができるうえ
に、分取に要するトータル時間を大幅に短縮することが
できる。

従って、本発明方法によれば、粗分離、精製及び洗浄の
各工程を低コストで効率良く行うことができ、工業的に
極めて有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法により糖分数を行う場合の溶出状況
を説明する概念図、第２図は分離工程後のカラム内の成
分分布を示す模式図である。第３図及び第４図は各々、
実施例における分取方法！及びｎで採用した工程を示す
図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）一つのクロマトカラムにより試料中の目的成分の
   粗分離及び精製を行う分取方法において、精製分離を行
   った後、該精製分離工程の通液方向と同方向に通液して
   粗分離を行い、次いで前記各分離工程の通液方向と反対
   方向に洗浄液を通液してクロマトカラムを洗浄すること
   を特徴とするクロマトカラムによる分取方法。
2. （２）洗浄液の溶媒は、分取時の溶媒と濃度が異なる同
   種のものである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）洗浄液をクロマトカラムに通液した後、分取時の
   溶媒を通液して洗浄液を押し出してカラムの安定化を行
   う特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）カラムの安定化を終了する前に、洗浄工程の通液
   方向と同方向に通液して次の精製分離を開始する特許請
   求の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）カラムの安定化終了よりも精製時の試料の注入か
   ら目的成分の回収域に到達するに要する時間あるいは該
   時間よりも短い時間だけ早く次の精製を開始する特許請
   求の範囲第４項に記載の方法。