CN118055797A - 纯化方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
用于从进料混合物(F)中分离产物(P)的循环色谱纯化方法，所述进料混合物(F)由所述产物(P)以及代表弱吸附杂质(W)和强吸附杂质(S)的至少两种另外的组分组成，所述方法仅使用两个色谱吸附区段作为色谱固定相，其中所述方法包括至少一种基础顺序，所述基础顺序具有至少一个再循环阶段，随后是仅一个纯化阶段，其中优选地基础顺序以循环方式重复。
Description
技术领域
本发明涉及用于产生来源于化学合成的高纯度治疗剂(例如肽和寡核苷酸)的循环色谱方法。
背景技术
活性物质(例如治疗性肽、寡核苷酸和蛋白质)的纯化过程通常包括一系列色谱步骤。
在许多肽和寡核苷酸产生的情况下，目标化合物是通过化学合成获得的。在该过程中，除了目标化合物外，产生了需要在下游过程中除去的产物相关杂质。
由于其高选择性，色谱是用于除去产物相关杂质不可或缺的单元操作。色谱的目的是产生满足纯度规格的产物池，同时维持高的产物产率和通量。
为了实现该目标，经常使用线性梯度色谱。在线性梯度色谱中，在产物与色谱吸附区中的固定相结合之后，则被泵送通过吸附区的流动相的组成随时间以恒定的斜率逐渐变化。
这导致早期洗脱(弱吸附)杂质、产物和晚期洗脱(强吸附)杂质的顺序解吸附。在色谱图中，该洗脱化合物的顺序作为一系列峰可视化。通过运行较浅的线性梯度可以改善待分离化合物的分离度(resolution)，然而这以提高处理时间和降低通量达到。同样，可通过降低加载到柱上的起始物质(进料)的质量来提高化合物的分离度，然而这同样降低了通量。
在制备型色谱中，通量高度重要，并因此梯度持续时间受限导致在制备型色谱图中杂质峰与产物峰重叠。最高的产物纯度通常在产物峰的中心获得，并且在洗脱期间将色谱的该部分在吸附区出口处收集为池。包括其中杂质峰和产物峰与产物重叠的副级分导致产物池纯度降低。为了避免违反纯度限制，通常必须将副级分中的一部分产物从产物池排除。不包括在产物池中的产物级分甚至可以构成加载到吸附区上的起始物质中所含有的大多数产物。为了避免产物损失，回收包含在不纯的副级分中的产物具有很高的利益。通常，将副级分进行再次色谱，即使用副级分作为加载物质进行相同或类似的色谱单元操作。通过该操作，可以回收一部分纯的产物，然而分离是更困难的由于加载物质具有比常规进料物质更高的杂质含量。再次色谱也具有一系列操作的缺点，包括管理限制、副级分储存和处理、副级分稳定性和质量控制。
已经提出了数种在色谱中自动化再循环不纯的副级分的方法。这些方法可以分成单个和多吸附区再循环方法。
单个吸附区设置包括通过同一柱再循环色谱。在稳态再循环(steady-state-recycling，SSR)方法中，从循环色谱的前部和尾部收集级分，并将新鲜样品注射到谱的内部中。
多吸附区再循环方法允许将不纯的副级分从一个吸附区到另一个的内部再循环与逆流原理(即固定相和流动相的相对相反运动)的使用组合，改善了产物和杂质的分离度。通过自动再循环，避免了副级分的产生和收集、副级分的外部储存、处理和分析，同时仅从具有高产率的方法回收纯产物。
组合内部再循环和逆流原理的多吸附区方法被称为模拟移动床(simulatedmoving bed，SMB)方法。早期的SMB方法限于两种化合物的分离(二元分离)并且不可以在线性梯度条件下操作，从而限制了其施加至不需要在色谱中进行中心切割的分离。
SMB的概念进一步被发展以产生具有线性溶剂梯度能力的用于中心切割(三元)分离的非常有效的方法，称为“MCSGP”(多柱逆流溶剂梯度纯化(MulticolumnCountercurrent Solvent Gradient Purification))方法，参见EP-A-1 877 769。该方法在工业上已被良好建立。已经提出了使用多个吸附区和内部再循环的其他色谱多吸附区技术，例如“具有稳态再循环的梯度”(gradient with steady state recycle，GSSR)方法。
尽管MCSGP已针对2至8个柱配置进行描述，但在实践中，由于与使用更多柱的设置相反设备复杂性更低且操作灵活性更高，因此主要使用2个吸附区配置。
MCSGP方法是基于单个柱分批色谱色谱图设计的。通常来说，用MCSGP，可能从分批色谱获得纯度对应于最纯级分的产物。在一些情况下，重叠的杂质可延伸到远低于产物峰，从而限制通过MCSGP可能获得的最大纯度。
发明内容
本发明旨在提供进一步改进的类MCSGP的方法，其可达到比常规MCSGP方法更高的产物纯度。
出乎意料地发现，通过将另外的再循环阶段引入到类似于MCSGP方法的方法中、与加载方案的改变组合，可以以相当的产率获得不仅更高的纯度而且可以获得更高纯度的更高或相等的产生力(通量)。
所提出的另外再循环阶段将色谱从一个色谱吸附区转移至另一个从而施加管线内稀释(inline dilution)，使得色谱在下游吸附区上被重新吸附。通常来说，该管线内稀释以这样的方式进行，在两个柱之间基本上恒定地添加不具有或具有低改性剂含量的洗脱液以降低下游液体的洗脱强度，从而减缓在下游柱中的洗脱。在反相色谱的情况中典型的改性剂是有机溶剂，而在离子交换中典型的改性剂是盐(改变离子强度)或酸/碱(改变pH)。将管线内稀释设置为预期从上游柱洗脱的化合物完全吸附的水平，并且不打算在再循环阶段期间促进在下游柱上的进一步分离。因此，预期将通过从上游洗脱获得的在色谱中部分分离的化合物通过管线内稀释进行湮灭。换言之，通过管线内稀释，分离的损失预期导致与在进料注射之后相同的情况。
因此，本领域技术人员将预期具有正常或“过度”管线内稀释的再循环步骤的引入不会导致产物纯度的提高。
此外，本领域技术人员将预期引入再循环步骤将降低总体方法生产力(通量)，因为再循环步骤需要额外的时间，以及在该时间期间没有引入另外的进料并且不产生产物。
出乎意料地，发现由引入再循环阶段导致的时间损失可通过提高加载来过度补偿。另外，由于再循环可实现显著更高的纯度。
所提供的方法使用两个作为色谱固定相的色谱吸附区段。一个吸附区段可由一个单个柱组成，然而其还可以由数个柱组成，在这种情况下，一个部分的柱总是相互连接的并且在过程中从不断开连接。
第一吸附区段具有第一吸附区段入口和第一吸附区段出口，以及部分第二吸附区段具有第二吸附区段入口和第二吸附区段出口。
所提供的方法包括任选但优选的启动阶段、具有一个或数个再循环顺序(n≥1)的再循环阶段、以及在再循环阶段之后仅进行一次的纯化阶段。再循环阶段和纯化阶段形成所谓的基础顺序，并且该基础顺序至少重复一次(m≥1)。在期望数目的基础顺序之后，然后任选但优选的关闭阶段。
在图1中示意性地示出了该基本原理。
图2示出了用于在再循环阶段中不同数目n＝1、2、3、4个循环的所提供的方法。所有实例均以启动阶段开始并以关闭阶段结束。在启动阶段中，通常将先前平衡的第一吸附区1加载有进料混合物F。进料混合物包含期望的产物P以及杂质，即更弱的吸附杂质W和更强的吸附性杂质S。随后，在存在或不存在(如所示和优选的)继续进料流的情况下，弱吸附杂质W(即比产物P更弱地吸附至固定相的杂质)从该吸附区洗脱。之后，该过程进入再循环阶段。
对于n＝1，再循环阶段本身由一个循环(即一个相互连接(IC-R)步骤和一个断开连接(B-R)步骤)组成。在相互连接步骤中，第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口同时用溶剂进料，其优选地具有梯度(进一步参见下文，特别是图5)。管线内稀释在吸附区之间进行。用基础溶剂进行管线内稀释并因此没有梯度。
然后，在随后的断开连接步骤B-R中，吸附区断开连接，并且强吸附杂质S(即比产物更强地吸附至固定相的杂质)从第一吸附区1洗脱并使该吸附区再平衡，而弱吸附杂质W从第二吸附区2洗脱。在再循环阶段中的该后者的断开连接步骤B-R是任选的。
对于n＝2，再循环阶段由补充有另一个循环(即一个另外的相互连接步骤和一个另外的(任选的)断开连接步骤)的n＝1的再循环阶段组成。在另外的相互连接步骤中，前者第二吸附区2的出口连接至前者第一吸附区1的入口。然后，在之后另外的断开连接步骤中吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第二吸附区2洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附性W杂质从第一吸附区1洗脱。该后者另外的断开步骤也是任选的。
对于n＝3，再循环阶段由补充有又一个另外的相互连接步骤和又一个另外的(任选的)断开连接步骤的n＝2的再循环阶段组成。在相互连接步骤中，第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口。然后，在之后的断开连接步骤中，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第一吸附区1洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第二吸附区2洗脱。该后者的断开连接步骤也是任选的。
对于n＝4，再循环阶段由补充有再一个另外的相互连接步骤和再一个另外的断开连接步骤的n＝3的再循环阶段组成。在相互连接步骤中，第二吸附区2的出口连接至第一吸附区1的入口。然后，在之后的断开连接步骤中，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第二吸附区2洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第一吸附区1洗脱。该后者的断开连接步骤是任选的。
一般而言，对于任何循环数目n(其中n>1)，再循环阶段由补充有一个另外的相互连接阶段和一个另外的(任选的)断开连接阶段的n-1个再循环阶段和步骤组成。
一般而言，对于偶数数目n＝2、4、6……的再循环阶段，在再循环阶段的最后相互连接步骤中，第二吸附区2的出口连接至第一吸附区1的入口。然后，在之后的断开连接步骤中(如果进行)，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第二吸附区2洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第一吸附区1洗脱。该后者的断开连接步骤是任选的。
一般而言，对于奇数数目n＝1、3、5……的再循环阶段，在再循环阶段的最后相互连接步骤中，第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口。然后，在之后的断开连接步骤中，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第一吸附区1洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第二吸附区2洗脱。该后者的断开连接步骤是任选的。
再循环阶段之后是纯化阶段。每个纯化阶段包括第一相互连接步骤IC1、第一分批(断开连接)步骤B1、第二相互连接步骤IC2和第二分批(断开连接)步骤B2。
对于n＝1和n＝3以及任何奇数的自然数n，在纯化阶段的相互连接步骤IC1中，第二吸附区2的出口连接至第一吸附区1的入口，即第二吸附区2处于第一吸附区1的上游并且管线内稀释在两个吸附区之间进行。在随后的分批步骤B1中，吸附区断开连接并且将经纯化的产物P从第二吸附区2洗脱并收集，同时将新的进料混合物F加载到第一吸附区1上。在之后的相互连接步骤IC2中，吸附区是连接的且第二吸附区2处于第一吸附区1的上游，并且管线内稀释在两个吸附区之间进行。
在之后的断开连接步骤B2中，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第二吸附区2洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第一吸附区1洗脱。
对于n＝2和n＝4以及任何偶数的自然数n，在纯化阶段的相互连接步骤IC1中，第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口，即第一吸附区1处于第二吸附区2的上游，并且管线内稀释在两个吸附区之间进行。在随后的分批步骤B1中，吸附区断开连接并且将经纯化的产物P从第一吸附区1洗脱并收集，同时将新的进料混合物F加载到第二吸附区2上。在之后的相互连接步骤IC2中，吸附区是连接的且第一吸附区1处于第二吸附区2的上游，并且管线内稀释在两个吸附区之间进行。
在之后的断开连接步骤中，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第一吸附区1洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第二吸附区2洗脱。
对于任何数目n的再循环阶段和在期望数目m的基础顺序之后，最后纯化阶段之后是在图3中所述的关闭阶段。
图3示出了对于不同数目n＝1、2、3、4……的再循环阶段的关闭阶段。期望数目的基础顺序的最后纯化阶段之后是关闭阶段，其本身由两个阶段(关闭阶段I和II)组成。
第一阶段(关闭阶段I)由与该方法的前述再循环阶段的最后IC-R和(任选的)B-R步骤相同的步骤组成。
第二关闭阶段(关闭阶段II)由与该方法的先前纯化阶段相同的步骤具有一些修改组成，但通过另外的步骤进行延长以洗脱产物P和洗脱杂质S，但是其在没有进一步加载新的进料混合物F的情况下操作。
对于n＝1和n＝3以及任何奇数的自然数n，关闭阶段I由相互连接步骤组成，其中第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口。管线内稀释在吸附区之间进行。在之后的断开连接步骤中，吸附区断开连接，并且强吸附S杂质从第一吸附区1洗脱并使吸附区再平衡，而弱吸附W杂质从第二吸附区2洗脱。该后者的断开连接步骤是任选的。
对于n＝1和n＝3以及任何奇数的自然数n，关闭阶段II由相互连接步骤IC1组成，其中第二吸附区2的出口连接至第一吸附区1的入口，即第二吸附区2处于第一吸附区1的上游，并且管线内稀释在两个吸附区之间进行。在随后的分批步骤B1中，吸附区断开连接并且将经纯化的产物P从第二吸附区2洗脱并收集。在该步骤中，没有新的进料混合物F加载到第一吸附区1上。在之后的相互连接步骤IC2中，吸附区是连接的且第二吸附区2处于第一吸附区1的上游，并且管线内稀释在两个吸附区之间进行。随后将经纯化的产物P从第一吸附区1洗脱和收集，并且强吸附杂质S从第一吸附区1洗脱。
对于n＝2和n＝4以及任何偶数的自然数n，关闭阶段I由以下组成：与奇数数目n的关闭阶段I相同的步骤，但是将吸附区1和2互换；以及对于n＝2和n＝4以及任何偶数的自然数n，关闭阶段II由以下组成：与奇数数目n的关闭阶段II相同的步骤，但是将吸附区1和2互换。
图4示出了对于任意数目n的两个吸附区在启动阶段中的任务。在启动阶段中，先前经平衡的第一吸附区1加载有进料混合物F(步骤B-SU-F)。随后，弱吸附杂质W从该吸附区洗脱(步骤B-SU-W)。在步骤B-SU-W中在第一吸附区1中待操作的线性梯度区段、流速和切换时间优选地对应于针对单个柱色谱图所选择的。
通常来说，所提供的方法的操作参数(即流速、梯度浓度、进料量和切换时间)可来源于单个吸附区色谱图，如在图4的底部所示。因此，所提供的方法可基于单个吸附区色谱图进行设计和初始设置，在操作期间基于例如检测器反馈可能进一步更精细的控制。
图5示出了对于n＝1的所提供的方法的再循环阶段。
再循环阶段本身包括至少一个顺序的相互连接(IC-R)步骤和断开连接(B-R)步骤。在第一相互连接步骤(IC-R)中，第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口。使用溶剂梯度将吸附的化合物W、P、S从第一吸附区1洗脱到第二吸附区2中，其中在吸附区之间用无改性剂或改性剂含量低的基础溶剂进行管线内稀释，使得W、P、S被强烈吸附在第二吸附区2上，并且优选地甚至弱吸附W杂质都没有离开下游吸附区2。然后，在之后的第一断开连接步骤(B-R)中，吸附区断开连接并且使用高的、优选恒定的改性剂浓度将剩余的S杂质从第一吸附区1洗脱，并随后使吸附区1再平衡，同时使用具有低起始改性剂浓度的梯度将弱吸附W杂质从第二吸附区2洗脱(参见在相应步骤下面底部的虚线，指示作为方法的函数的改性剂浓度)。该后者的断开连接步骤B-R是任选的，并且其重要性取决于在进料混合物F中产物P的纯度和纯度规格。较低的纯度对应于较高的W和S含量，并因此人们将考虑在再循环阶段中包括断开连接步骤(B-R)以除去W和S。同样，所提供的方法的操作参数(即流速、梯度浓度、进料量和切换时间)可来源于单个吸附区色谱图，如在图5的底部所示，在操作期间基于例如检测器反馈可能进一步更精细的控制。
对于n＝1，关闭阶段I与再循环阶段相同。每个再循环阶段之后是纯化阶段(图2、图6)。
图6示出了对于n＝1、3、5……所提供的方法的纯化阶段。
每个纯化阶段包括第一相互连接步骤(IC1)、第一分批(断开连接)步骤(B1)、第二相互连接步骤(IC2)和第二分批(断开连接)步骤(B2)。
在相互连接步骤IC1中，第二吸附区2的出口连接至第一吸附区1的入口，即第二吸附区2处于第一吸附区1的上游。在相互连接步骤IC1中，将含有W和P的部分纯的副级分(在色谱图中的重叠区域(参见在图6底部(“区域5”)的示意色谱图))从第二吸附区2洗脱到第一吸附区1中。在IC1操作期间，将含有W和P的流在进入第一吸附区1之前进行管线内稀释，使得W和P在第一吸附区1的入口处被完全吸附。在随后的分批步骤B1中，吸附区断开连接并且将经纯化的产物P从第二吸附区2洗脱并收集，同时将新的进料混合物F加载到第一吸附区1上。在之后的相互连接步骤IC2中，吸附区是连接的且第二吸附区2处于第一吸附区1的上游，并且将含有P和S的部分纯的副级分(在色谱图中的重叠区域，参见图6的底部(“区域7”))从第二吸附区2洗脱到第一吸附区1中。将含有P和S的流在进入第一吸附区1之前进行管线内稀释，使得化合物P和S在第一吸附区1的入口处被完全吸附。同样，所提供的方法的操作参数(即流速、梯度浓度、进料量和切换时间)可来源于单个吸附区色谱图，如在图6的底部所示，在操作期间基于例如检测器反馈可能进一步更精细的控制。
图7：为了避免在方法操作结束时产物P损失，纯化阶段之后是关闭阶段，其本身由两个阶段(关闭阶段I和关闭阶段II)组成。
对于n＝1、3、5……，关闭阶段I功能上与对于n＝1的再循环阶段相同且在在图5中示出。关闭阶段I包括步骤IC’-R和B’-R，使用与该方法再循环阶段的最后顺序相同的条件。
图7示出了对于n＝1，3，5……的所提供的方法的关闭阶段II。
关闭阶段II包括与该方法的先前纯化阶段基本相同的步骤，但没有进料，参见图6(IC1-SD对应于IC1，B1-SD对应于B1但没有进料，IC2-SD对应于IC2，B2-SD对应于B2)，但是通过另外的步骤进行延长以从先前处于下游位置的第一吸附区1洗脱产物P(B-SD-P)并洗脱杂质S并清洁和再生同一吸附区(B-SD-S)。在B-SD-P和B1-SD中用于收集P的条件优选地在流速和梯度浓度方面相同。同样，在B-SD-S和B2-SD中用于除去S的条件优选在流速和梯度浓度方面相同。
在先前再循环阶段包括偶数数目顺序(n＝2，4，6……)的相互连接步骤IC-R和断开连接步骤B-R的情况下，在步骤IC1-SD、B1-SD、IC2-SD和B2-SD中将吸附区的位置互换，即在相互连接的步骤IC1-SD中，第一吸附区1的出口连接至第二吸附区2的入口，使得第一吸附区1处于第二吸附区2的上游。同样，在阶段B1-SD、IC2-SD和B2-SD中将吸附区的位置互换。
在所提供的方法中，可以并且优选地将梯度特别是线性梯度用于任何步骤中以通过改变梯度斜率来增强化合物的分离和/或改变洗脱的速度。
在再循环阶段步骤(IC-R和/或B-R)中选择比用于纯化阶段步骤(IC1、B1、IC2和/或B2)更高的梯度斜率使得再循环阶段更快地完成，并因此将提高整体方法生产力。
更一般地说，本发明涉及用于从进料混合物F分离产物P的循环色谱纯化方法，所述进料混合物F由产物P以及代表弱吸附杂质W和强吸附杂质S的至少两种另外的组分组成。
所提供的方法仅使用两个色谱吸附区段作为色谱固定相。第一吸附区段具有第一吸附区段入口和第一吸附区段出口，并且第二吸附区段具有第二吸附区段入口和第二吸附区段出口。
所提供的方法包括至少一个基础顺序，所述基础顺序具有至少一个再循环阶段，随后是仅一个纯化阶段，其中优选地基础顺序以循环方式重复至少两次。
根据本发明，所述再循环阶段由至少一个再循环顺序组成，优选地由仅一个或至少两个、或至少三个、或至少四个再循环顺序的顺序组成，所述再循环顺序包括以下步骤：
a.相互连接再循环步骤IC-R，其中所述吸附区段相互连接，并且其中在再循环相互连接时间跨度tIC-R期间上游吸附区段出口连接至下游吸附区段入口，
其中所述上游吸附区段经由所述上游吸附区段入口加载有洗脱液，并且其中将含有至少与产物P重叠的范围内的所述弱吸附杂质W、所述产物P和至少与产物P重叠的范围内的所述强吸附杂质S的级分从所述上游吸附区段洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区出口的流在进入所述下游吸附区入口之前进行管线内稀释；
b.任选的分批再循环步骤B-R，其中在再循环分批时间跨度tB-R期间所述吸附区段断开连接，以及
其中将先前前述步骤a.的上游吸附区段进行清洁以除去所述强吸附杂质S并再生，并且其中将洗脱液加载至先前步骤a.的下游吸附区段的入口以洗脱不与产物P重叠的范围内的弱吸附杂质W；
其中在每一个步骤a.和b.的再循环顺序之后，按顺序切换所述吸附区段，其中再循环顺序的数目为≥1，
根据本发明，再循环阶段之后是仅一个纯化阶段。
该纯化阶段按顺序包括以下步骤，其中前述再循环阶段的最后一个相互连接再循环步骤的所述上游吸附区段承担所述下游吸附区段的功能，前述再循环阶段的最后一个相互连接再循环步骤的所述下游吸附区段承担所述上游吸附区段的功能：
c.第一相互连接纯化步骤IC1，其中所述吸附区段相互连接，其中在第一相互连接纯化时间跨度tIC1期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口，
其中所述上游吸附区经由所述上游吸附区入口加载有洗脱液，并且其中将含有重叠的弱吸附杂质W和产物P的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
d.第一分批纯化步骤B1，其中在第一分批纯化时间跨度tB1期间所述吸附区段断开连接，并且其中产物P从先前上游吸附区段洗脱，并且其中将进料混合物F供应至先前下游吸附区段入口；
e.第二相互连接纯化步骤IC2，其中在第二相互连接纯化时间跨度tIC2期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口，
其中所述上游吸附区段经由所述上游吸附区段入口加载有洗脱液，并且其中将含有处于重叠的产物P和强吸附杂质S的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
f.第二分批纯化步骤B2，其中在第二纯化分批时间跨度tB2期间所述吸附区断开连接，并且其中对所述先前上游吸附区进行清洁并再生，并且其中将洗脱液加载至所述先前的下游吸附区入口。
如以上所指出的，优选地在至少一个或所有阶段中使用洗脱液梯度。
在该方法的相互连接步骤中，优选地通过上游吸附区入口向上游部分入口加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且将离开上游吸附区段出口的流在进入下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的、优选较低的洗脱液进行管线内稀释。
进一步优选地，在该方法的无纯化产物洗脱的分批步骤中，对先前的上游吸附区进行清洁，例如用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液或用具有不同的改性剂的洗脱液或用清洁溶液进行清洁，并再生，并且其中向先前的下游吸附区入口加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度。
在具有经纯化的产物洗脱的方法的分批步骤中，优选地通过上游吸附区入口向先前上游吸附区加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度。
根据一个优选实施方案，在所述再循环阶段中的所述相互连接再循环步骤IC-R中，通过上游吸附区段入口向上游吸附区段加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且将离开上游吸附区出口的流在进入下游吸附区入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释。
根据另一个优选实施方案，在任选的分批再循环步骤B-R中，将前述步骤a.中之前的上游吸附区段用洗脱液或用清洁溶液清洁并再生，所述洗脱液例如具有比前述相互连接再循环步骤结束时更高的改性剂浓度或具有不同的改性剂，并且将梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液加载至步骤a.中之前的下游吸附区段的入口以洗脱不与产物P重叠的范围内的弱吸附杂质W。
另一个优选实施方案的特征在于在所述纯化阶段中的所述第一相互连接纯化步骤IC1中，通过上游吸附区入口向上游吸附区段加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且将离开上游吸附区段出口的流在进入下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释。
此外，优选的是如果在所述第一分批纯化步骤B1中，通过经其入口向先前的上游吸附区段加载梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液来从其中洗脱产物P。
在所述第二相互连接纯化步骤IC2中，优选地通过上游吸附区入口向所述上游吸附区段入口加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且将离开上游吸附区段出口的流在进入下游吸附区段入口之前用无改性剂(单独的基础溶剂)或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释。
此外，优选的是如果在所述第二分批纯化步骤B2中，将先前上游吸附区用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液或用具有不同的改性剂的洗脱液或用清洁溶液进行清洁，并再生，并且其中将梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液加载至先前下游吸附区入口。
改性剂优选地选自不同于洗脱液的基础溶剂(或其混合物)的有机溶剂或无机溶剂(或其混合物)、在这样的有机溶剂或无机溶剂(或其混合物)中的电解质，优选地选自溶解的盐或pH，或其组合。
优选地所述基础溶剂是有机溶剂或无机溶剂(或其混合物)，特别地是水或水与至少一种有机溶剂的混合物，任选地含有缓冲盐、酸或碱或其组合。例如基础溶剂可以是99.9％水和三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA，0.1％)的混合物，并且改性剂可以是9.9％水、0.1％ TFA和90.0％乙腈的混合物。或者改性剂可以是100％乙腈。在另一个实例中，基础溶剂可以是25mM磷酸缓冲液水溶液，pH 7.0，以及改性剂可以是25mM磷酸缓冲液、500mM NaCl，pH 7.0。
特别是在待分离的生物分子(例如由生物化学过程产生)的情况下，基础溶剂通常是水或和与水相比为较小比例的一种或更多种盐和/或有机溶剂混合中的水(例如补充有乙腈和三氟乙酸)，在以下的该基础溶剂中将被称为溶剂A。为了建立梯度，将其与不同于基础溶剂(混合物)的另外的溶剂或溶剂混合物混合。该另外的溶剂例如可以是与基础溶剂相同但具有不同比例的溶剂的混合物(例如对于上述实例，水补充有较高比例的乙腈)。特别是对于生物分子，通常该另外的溶剂也基于水，但是具有进一步提高比例的有机溶剂。为了建立梯度，通常在梯度开始时提供具有与基础溶剂不同的相当低浓度的组分(例如有机溶剂、盐或pH或者其组合，如果例如基础溶剂是水)的改性剂混合物作为洗脱液，并通过梯度泵逐渐与另外的溶剂混合，得到相应的控制梯度。进料混合物可以在不同的溶剂中被提供，或其可以在基础溶剂中被提供，或者进料混合物可以作为原始溶液(通常水溶液)在与适当浓度的基础溶剂的混合物中的混合物提供。
优选地在至少一个或所有阶段中使用具有为时间上改变的改性剂浓度提高的形式的梯度的线性洗脱液梯度。
如上所述，优选地在进行第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤之前进行启动阶段，其中
在第一分批启动时间跨度tB-SU-F期间，所述吸附区断开连接，
并且将进料混合物F供应至吸附区段的入口以成为第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤的上游吸附区段，
同时对成为第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤的下游吸附区段的吸附区段进行平衡，或者其已被平衡并且不运转(inactive)，
并且其中优选地随后，在第二分批启动时间跨度tB-SU-W期间所述吸附区断开连接，并且将弱吸附杂质W从已在前述第一分批启动步骤中供应了进料混合物F的吸附区段洗脱，同时对另一吸附进行平衡，或者其已被平衡并且不运转。
在所述第一分批启动时间跨度tB-SU-F之后并且在所述第二分批启动时间跨度(tB-SU-W)之前，可以将洗脱液供应至吸附区段的入口以成为第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤的上游吸附区段，并且所述洗脱液可以无改性剂(单独的基础溶剂)或者其改性剂浓度基本上对应于在所述第一分批启动时间跨度期间施加的起始改性剂浓度，或在不存在第二分批启动步骤的情况下对应于所述第一相互连接再循环步骤的改性剂浓度施加的起始改性剂浓度。
此外，在所述第二分批启动时间跨度期间，可向已供应有进料混合物F的吸附区段的入口加载梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液。
在至少一个基础顺序、优选地多于一个基础顺序终止之后可进行关闭阶段，其中关闭阶段按顺序包括以下步骤：
a’.相互连接关闭再循环步骤IC’-R，其中前述的和最后的第二相互连接纯化步骤IC2的所述上游吸附区段占据所述下游位置，而另一吸附区段占据所述上游位置，其中所述吸附区段相互连接，并且其中在关闭再循环相互连接时间跨度tIC’-R-SD期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口，
其中所述上游吸附区段经由所述上游吸附区段入口加载有洗脱液，并且其中将含有至少与产物P重叠的范围内的所述弱吸附杂质W、所述产物P和至少与产物P重叠的范围内的所述强吸附杂质S的级分从所述上游吸附区段洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区出口的所述流在进入所述下游吸附区入口之前进行管线内稀释；
b’.任选的分批关闭再循环步骤B’-R，其中所述吸附区段断开连接，其中在关闭再循环分批时间跨度tB’-R期间所述吸附区段断开连接，并且
其中将前述步骤a’的所述先前上游吸附区段进行清洁和再生，并且其中将洗脱液加载至步骤a的所述先前下游吸附区段的入口以洗脱不与产物P重叠的范围内的弱吸附杂质W；
优选地者随后按顺序进行以下步骤，其中所述相互连接关闭再循环步骤的上游吸附区段承担所述下游吸附区段的功能，并且所述相互连接关闭再循环步骤的下游吸附区段承担所述上游吸附区段的功能：
c’.第一相互连接关闭纯化步骤IC1-SD，其中所述吸附区段相互连接，其中在第一相互连接关闭纯化时间跨度tIC1’期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口，
其中所述上游吸附区经由所述上游吸附区入口加载有洗脱液，并且其中将含有重叠的弱吸附杂质W和产物P的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的所述流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
d’.第一分批关闭纯化步骤B1-SD，其中在第一分批纯化时间跨度tB1’期间所述吸附区段断开连接，并且其中将产物P从所述先前上游吸附区段洗脱，并且其中所述先前下游吸附区段是空闲的或者将洗脱液供应至所述先前下游吸附区段入口；
e’.第二相互连接关闭纯化步骤IC2-SD，其中在第二相互连接关闭纯化时间跨度tIC2’期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口连接，
其中所述上游吸附区段经由所述上游吸附区段入口加载有洗脱液，并且其中将含有处于重叠的产物P和强吸附杂质S的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的所述流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
f’.第二分批关闭纯化步骤B2-SD，其中在第二纯化分批时间跨度tB2’期间所述吸附区断开连接，并且其中对所述先前上游吸附区进行清洁并再生，并且其中将洗脱液加载至所述先前下游吸附区入口
这随后通常是
g’.第一最终关闭分批步骤B-SD-P，其中在第一最终关闭分批时间跨度tB-SD-P期间所述第一吸附区和第二吸附区断开连接，并且其中产物P从所述先前下游吸附区洗脱，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的；
h’.任选地第二最终关闭分批步骤(B-SD-S)，其中在第二最终关闭分批时间跨度tB-SD-S期间所述第一吸附区和第二吸附区断开连接，并且强吸附杂质S从所述先前下游吸附区洗脱，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的。
在所述相互连接关闭再循环步骤IC’-R中，可以通过上游吸附区段入口向前述的和最后的第二相互连接纯化步骤IC2的上游吸附区段加载恒定组成洗脱液，或加载梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液，其中将离开上游吸附区出口的流在进入下游吸附区入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释。
在所述分批关闭再循环步骤B’-R中，可将前述步骤a.中之前的上游吸附区段用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液或用具有不同的改性剂的洗脱液或用清洁溶液进行清洁，并再生，并且其中将梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液加载至步骤a’的先前下游吸附区段的入口以洗脱不与产物P重叠的范围内的弱吸附杂质W。
在所述第一相互连接关闭纯化步骤IC1-SD中，可通过上游吸附区入口向上游吸附区加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且将离开上游吸附区段出口的流在进入下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释。
在所述第一分批关闭纯化步骤B1-SD中，可通过经由上游吸附区入口加载梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液从先前上游吸附区段来洗脱产物P，并且先前下游吸附区段是空闲的或者将洗脱液供应至先前下游吸附区段入口，优选地基础溶剂。
在所述第二相互连接关闭纯化步骤IC2-SD中，可通过上游吸附区段入口向上游吸附区段加载恒定组合物洗脱液或梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液，并且将离开上游吸附区段出口的流在进入下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释。
此外，在所述第二分批关闭纯化步骤B2-SD中，可将先前上游吸附区用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液进行清洁并再生，并且其中将洗脱液加载至先前下游吸附区入口。
最后，在所述第一最终关闭分批步骤B-SD-P中，可用具有为时间上改变改性剂浓度形式的梯度的洗脱液从先前下游吸附区洗脱产物P，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的
以及/或者在所述第一最终第二最终关闭分批步骤B-SD-S中，可用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液从先前下游吸附区洗脱强吸附杂质S，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的。
在再循环阶段中和/或在纯化阶段中优选地使用具有不同斜率和/或流速的线性梯度，其中优选地在再循环阶段中使用比在纯化阶段中更高的斜率和/或更高的流速。
根据另一个优选实施方案，在该方法的大多数(特别是除了步骤IC2和IC2-SD之外的所有)或所有相互连接步骤中，通过上游吸附区入口向上游部分入口加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且将离开上游吸附区段出口的流在进入下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释，
并且
在该方法的没有纯化产物洗脱的分批步骤中，对先前的上游吸附区用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液进行清洁并再生，并且如果适用的话，则将梯度形式为随时间改变的改性剂浓度的洗脱液加载至先前下游吸附区入口，
或者在具有经纯化的产物洗脱的方法的分批步骤中，通过上游吸附区入口向先前上游吸附区加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，
并且其中改性剂选自不同于洗脱液的基础溶剂或其混合物的溶剂或其混合物、在这样的溶剂或其混合物中的电解质，优选地选自溶解的盐或pH，或其组合，其中优选地所述基础溶剂是水或者水与至少一种有机溶剂的混合物、或者水在和与水相比为较小比例的一种或更多种盐和/或有机溶剂的混合物中，并且其中进一步优选地所述改性剂是有机溶剂；或者水与至少一种有机溶剂的混合物，其所述至少一种有机溶剂的浓度高于基础溶剂；水或者水的混合物，具有与在基础溶剂中不同的盐或H+浓度，
并且其中经以下步骤，所述改性剂浓度是提高的，优选地线性提高，其过程为从不与产物P重叠的范围内的弱吸附杂质W洗脱(B-SU-W、B-R、B’-R、B2、B2-SD)开始时的最低浓度的过程中起始：
再循环(IC-R、IC’-R、IC1、IC1-SD)，除以下的最终关闭分批步骤(B-SD-P)的情况之外，以及
如果适用的话，产物洗脱(B1、B1-SD、B-SD-P)，并且如果适用的话，则另一再循环(IC2、IC2-SD)，其中在所述再循环(IC2、IC2-SD)期间，改性剂浓度可以变化或只在所述再循环(IC2、IC2-SD)保持恒定
提高至最高浓度，然后开始强吸附杂质S的洗脱(B-R、B’-R、B2、B2-SD、B-SD-S)。
在所提供的方法中，可以使用不同尺寸的或具有不同固定相的或者尺寸固定相二者都不同的吸附区。产物P的洗脱总是发生于同一吸附区，加载新的进料物质是同样的。例如，在再循环阶段仅包含IC-R和B-R的单个顺序(n＝1)的情况下，主要的纯化任务由吸附区2进行(W/P的再循环、产物P洗脱、P/S的再循环)。因此，小颗粒色谱树脂可用于吸附区2中的该任务以使分离度最大化，而大颗粒树脂可用于接收吸附区1中的再循环流。由于在步骤IC1和IC2中W/P和P/S的管线内稀释，洗脱液进入吸附区1的流大于离开吸附区2的流，并因此吸附区1可受益于较大颗粒，其在流下具有比小颗粒树脂更低的背压。
此外，本发明涉及如上所详述的用于纯化天然或合成来源的生物分子的用途，所述生物分子优选地选自：核酸分子包括DNA和RNA分子，蛋白质包括抗体，肽，碳水化合物，脂质及其组合和修饰物以及其片段。
本发明的另一些实施方案在从属权利要求中记录(lay down)。
附图说明
以下参照附图描述了本发明的一些优选实施方案，这些附图是出于举例说明本发明的当前优选实施方案的目的，而不是出于限制其的目的。在附图中，
图1示出了所提供的方法的通用方案，包括启动阶段、再循环阶段、纯化阶段和关闭阶段；
图2更详细地示出了所提供的方法(启动阶段、再循环阶段、纯化阶段)的逻辑，包括在再循环阶段中对于n＝1……4顺序的吸附区连接以及进入和离开吸附区的流。不含有W、P、S或F的进料/洗脱液的流没有特别标记；
图3更详细地示出了所提供的方法(关闭阶段)的逻辑，包括在再循环阶段中对于n＝1……4顺序的吸附区连接以及进入和离开吸附区的流。不含有W、P、S或F的进料/洗脱液的流没有特别标记；
图4示出了参照单个柱色谱图(在底部示出)两个吸附区在启动阶段中的任务，并示意性地指示了在线性梯度操作的情况下在该过程中使用的线性梯度段(粗虚线)。垂直细虚线示意性地指示了部分边界；在图4至7中，被指定为区域并由细垂直虚线分隔的垂直部分指示在各自区域中柱的不同功能；在右侧的底部示出了产物P的色谱图，以及在产物P的左侧比产物P更早洗脱的更弱吸附杂质W，以及在产物P的右侧比产物P更晚洗脱的更强吸附杂质S；还在区域2中指示了在底部以虚线给出的进料浓度，其适用于在该区域中在柱入口处的区域2。在色谱图的区域(在图4和图6至7中的区域4至8以及在图5中的区域4至6)中，在底部的虚线指示在洗脱更弱吸附杂质W和产物P期间(在图4和图6至7中的区域4至7以及在图5中的区域4至5)，在各自区域中在柱入口处用于所施加的梯度的改性剂浓度，以及在洗脱不与P重叠的范围内的S的阶段(在图4和图6至7中的区域8以及在图5中的区域6)中所施加的高水平但通常恒定的改性剂浓度；
图5示出了参照单个柱色谱图(在底部示出)两个吸附区在再循环阶段中的任务，并示意性地指示了在线性梯度操作的情况下在该过程中使用的线性梯度区段；
图6示出了参照单个柱色谱图(在底部示出)两个吸附区在纯化阶段中的任务，并示意性地指示了在线性梯度操作的情况下在该过程中使用的线性梯度区段；
图7示出了参照单个柱色谱图(在底部示出)两个吸附区在关闭阶段II中的任务，并示意性地指示了在线性梯度操作情况下在该过程中使用的线性梯度区段；
图8a)示出了所提供的方法的关闭阶段和单个柱参考运行的UV曲线的叠加，b)示出了通过所提供的方法的关闭阶段和单个柱参考运行的离线HPLC分析确定的产物浓度值的叠加，c)示出了通过所提供的方法的关闭阶段和单个柱参考运行的离线HPLC分析确定的产物纯度值的叠加，以及d)示出了通过所提供的方法的关闭阶段和单个柱参考运行的离线HPLC分析确定的杂质含量值的叠加。在d)中用箭头指示了强吸附杂质S主峰；
图9示出了所提供的方法和单个柱参考运行的纯度/产率曲线的叠加；
图10，在a)中示出了在阶段IC1、B1、IC2和B2中从始至终在上游柱的柱出口处记录的常规MCSGP方法的内部色谱图；在b)中示出了在步骤IC1、B1、IC2和B2中从始至终在上游柱的柱出口处记录的对于n＝1的所提供的方法的纯化阶段的内部色谱图；以及在c)中示出了在步骤IC1、B1、IC2和B2中从始至终在上游柱的柱出口处记录的对于n＝2的所提供的方法的纯化阶段的内部色谱图；矩形形状区域指示产物收集间隔，以及用“W”表示的箭头指向弱吸附杂质的位置并且用“S”表示的箭头指向强吸附杂质的位置。
图11，在a)中示出了具有10cm床高的分批参照方法的色谱图；以及在b)中示出了具有20cm床高的分批参照方法的色谱图。矩形形状区域指示产物收集间隔，以及用“W”表示的箭头指向弱吸附杂质的位置并且用“S”表示的箭头指向强吸附杂质的位置。
图12示出了针对以下的产物池纯度vs生产力：1.在再循环阶段中具有n＝1个顺序的所提供的方法、2.在再循环阶段中具有n＝2个顺序的所提供的方法、MCSGP方法、具有10cm床高的单个柱分批参照方法以及具有20cm床高的单个柱分批参照方法。对于分批方法，该图还示出了纯度/生产力曲线，其点对应于多种尺寸的产物池。
具体实施方式
实施例1：血管紧张素II的纯化
在溶剂A(水中的5％乙腈(ACN)+0.1％三氟乙酸(TFA))中制备含有来自化学合成的2.1g/L血管紧张素II的进料溶液。对于色谱运行，使用溶剂A和溶剂B(水中的50％ ACN+0.1％ TFA)。进料纯度为％W＝4.76，％P＝91.67，％S＝3.57(在每种情况下面积％基于分析型HPLC)。
使用两个2.5mL柱体积的柱(0.46cm内径×15cm床高)来运行所提供的方法。对于参考，使用相同的材料进行单个柱运行。
在Contichrom CUBE系统(ChromaCon)上使用如在表1中给出的参数运行所提供的方法。
为了研究再循环阶段的作用，在再循环阶段之后直接运行关闭阶段，并在非循环非连续过程中将产物峰分级。分级关闭与单个柱参考运行的分级的比较表明了用所提供的方法产物峰更宽，如在柱出口处记录的UV检测器信号中可视化的二者(图8a)，并通过使用分析型HPLC的离线分析来确定(图8b)。然而，在所提供的方法中在显著更宽的级分范围内获得的纯度(如通过分析型HPLC确定的)更高(图8c)。离线HPLC分析确定了在所提供的方法中强吸附杂质S已被显著减缓，使得在产物池中包含更大数目的级分(图8d)。
绘制的分批参考方法和所提供的方法的纯度-产率曲线(图9)示出了在16g/L的相同初始加载的情况下，所提供的方法针对给定纯度提供了更高的产率。产率-纯度曲线的单个点表示通过分组级分获得的多种尺寸的池。
表1-用于检验所提供的方法的再循环阶段作用的Contichrom CUBE系统操作参数。
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CV：相对体积/柱体积；％B：溶剂B的比例，由溶剂A给出补足至100％。
实施例2：寡核苷酸纯化的数值模拟
模拟了用于通过阴离子交换色谱纯化寡核苷酸的所提供的方法。用于模拟的进料混合物由20mer dsDNA寡核苷酸以及W和S杂质组成：P＝2.865g/L(87.2％纯)，W1＝0.13g/L，W2＝0.23g/L，S1＝0.08g/L，S2＝0.13g/L。在图10和11中用G示出了梯度。
使用两个0.5cm内径和10cm床高、填充有YMC SmartSep Q30的柱。对于模拟，采用了基于双朗缪尔(bi-Langmuir)吸附等温线的机械模型，并使用一组具有多个梯度斜率和加载的单个柱梯度实验进行了校准。
图10a示出了在IC1、B1、IC2和B2阶段中从始至终在上游柱的柱出口处记录的根据EP-A-1 877 769的常规MCSGP方法的内部色谱图。
同样，图10b和图10c示出了在各自的阶段IC1、B1、IC2和B2中从始至终在上游柱的柱出口处分别记录的对于n＝1(图10b)和n＝2(图10c)(即对于一个或两个再循环阶段)的纯化阶段的内部色谱图。图10a至c中的矩形阴影区域指示产物收集间隔。在产物收集窗内可以看出，随再循环阶段的重复提高(范围为n＝0(常规MCSGP方法，图10a)，经n＝1(再循环阶段的一次重复，图10b)至n＝2(再循环阶段的两次重复，图10c))，在产物洗脱窗中收集的产物变得纯的多。这是更好地除去“W”和“S”杂质的结果，其在图10a至c中通过箭头指出。
表中给出了用于检验的模拟系统的操作参数。
表2-用于检验所提供的方法的作用的系统参数(“n.a.”-不适用)。
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为了比较，图11a和b分别示出了具有10cm和20cm床高的分批参照方法的色谱图。如在图10a至c中，矩形形状区域指示产物收集间隔，以及用“W”表示的箭头指向相关重叠弱吸附杂质的位置并用“S”表示的箭头指向相关重叠强吸附杂质的位置。可以看出，使用的再循环阶段越多，产物池包含杂质W和S的量就越低。
结果在产物池纯度vs.产量方面进行了比较并且在图12中示出。除了双柱方法之外，模拟了单个柱参考方法。对于单个柱参考方法，从模拟色谱图提取不同尺寸的产物池，对应于具有不同产物和杂质含量的池，并因此对应于不同的产量和纯度。
可以看出在相当的生产力下，用所提供的方法(>97.5％纯度，对于n＝1和n＝2二者)可获得比用参照分批方法(<97.0％纯度)高得多的纯度。与根据EP-A-1 877 769的“常规”MCSGP方法相比，所提供的方法实现了更高的纯度(MCSGP纯度<96.0％纯度)，但生产力稍低。此外，图12确定了通过提高再循环阶段顺序的数目n，产物纯度可进一步提高(对于n＝1纯度＝97.8％vs.对于n＝2纯度＝98.4％)，然而这是以生产力为代价达到的(对于n＝1生产力＝3.4g/L/小时vs.对于n＝2生产力＝2.3g/L/小时)。
参考标记列表
IC1 纯化阶段的第一相 B1 纯化阶段的第一断开连接步骤
互连接步骤 (分批步骤)
IC2 纯化阶段的第二相 B2 纯化阶段的第二断开连接步骤
互连接步骤 (分批步骤)
IC-R 再循环阶段或关闭 B-R 再循环阶段或关闭阶段I的断开
阶段I的相互连接 连接步骤(分批步骤)
步骤
IC1-SD 关闭阶段II的第一 B1-SD 关闭阶段II的第一断开连接步
相互连接步骤 骤(分批步骤)
IC2-SD 关闭阶段II的第二 tIC2 阶段IC2的持续时间
相互连接步骤 tIC-R 阶段IC-R的持续时间
B2-SD 关闭阶段II的第二 tB1 步骤B1的持续时间
断开连接步骤(分 tB2 步骤B2的持续时间
批步骤)
B-SU-F 启动阶段的断开连 tB-R 步骤B-R的持续时间
接步骤(进料步骤) tB-SU-F 步骤B-SU-F的持续时间
B-SU-W 启动阶段的断开连 tB-SU-W 步骤B-SU-W的持续时间
接步骤(W洗脱步 tB-SD-P 步骤B-SD-P的持续时间
骤)
B-SD-P 关闭阶段的断开连 tB-SD-S 步骤B-SD-S的持续时间
接步骤(产物洗脱 P 产物
步骤)
B-SD-S 关闭阶段的断开连 F 含有W、P和S的进料混合物
接步骤(S洗脱步 W 弱吸附杂质
骤)
tIC1 阶段IC1的持续时 S 强吸附杂质
间
Claims (15)
1.用于从进料混合物(F)中分离产物(P)的循环色谱纯化方法，所述进料混合物(F)由所述产物(P)以及代表弱吸附杂质(W)和强吸附杂质(S)的至少两种另外的组分组成，
所述方法仅使用两个色谱吸附区段作为色谱固定相，其中第一吸附区段(1)具有第一吸附区段入口和第一吸附区段出口，并且第二吸附区段(2)具有第二吸附区段入口和第二吸附区段出口，
其中所述方法包括至少一种基础顺序，所述基础顺序具有至少一个循环阶段，随后是仅一个纯化阶段，其中优选地基础顺序以循环方式重复至少两次，
并且其中所述再循环阶段由至少一个包括以下步骤的再循环顺序组成：
a.相互连接再循环步骤(IC-R)，其中将所述吸附区段相互连接，并且其中在再循环相互连接时间跨度(tIC-R)期间上游吸附区段的出口连接至下游吸附区段的入口，
其中通过所述上游吸附区段入口将洗脱液加载到所述上游吸附区段，并且其中将含有至少与产物(P)重叠的范围内的弱吸附杂质(W)、所述产物(P)和至少与产物(P)重叠的范围内的强吸附杂质(S)的级分从所述上游吸附区段洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区出口的流在进入所述下游吸附区入口之前进行管线内稀释；
b.任选的分批再循环步骤(B-R)，其中在再循环分批时间跨度(tB-R)期间将所述吸附区段断开连接，以及
其中对前述步骤a.中之前的上游吸附区段进行清洁以除去所述强吸附杂质(S)并再生，并且其中将洗脱液加载至步骤a.中之前的下游吸附区段的入口以洗脱不与产物(P)重叠的范围内的弱吸附杂质(W)；
其中在每一个步骤a.和b.的再循环顺序之后，按顺序切换所述吸附区段，其中再循环顺序的数目为≥1，
并且其中每个再循环阶段之后是仅一个纯化阶段，
其中所述纯化阶段按顺序包括以下步骤，其中前述再循环阶段的最后一个相互连接再循环步骤中的上游吸附区段承担下游吸附区段的功能，前述再循环阶段的最后一个相互连接再循环步骤的下游吸附区段承担上游吸附区段的功能：
c.第一相互连接纯化步骤(IC1)，其中将所述吸附区段相互连接，其中在第一相互连接纯化时间跨度(tIC1)期间使上游吸附区段出口连接至下游吸附区段入口，
其中通过所述上游吸附区入口将洗脱液加载到所述上游吸附区，并且其中将含有重叠的弱吸附杂质(W)和产物(P)的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
d.第一分批纯化步骤(B1)，其中在第一分批纯化时间跨度(tB1)期间将所述吸附区段断开连接，并且其中产物(P)从先前的上游吸附区段洗脱，并且其中将进料混合物(F)供应至先前的下游吸附区段入口；
e.第二相互连接纯化步骤(IC2)，其中在第二相互连接纯化时间跨度(tIC2)期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口，
其中所述上游吸附区段经由所述上游吸附区段入口加载有洗脱液，并且其中将含有重叠的产物(P)和强吸附杂质(S)的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
f.第二分批纯化步骤(B2)，其中在第二纯化分批时间跨度(tB2)期间将所述吸附区断开连接，并且其中对先前的上游吸附区进行清洁并再生，并且其中将洗脱液加载至先前的下游吸附区入口。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在至少一个或所有阶段中使用洗脱液梯度，优选地线性洗脱液梯度，其中优选地在所述再循环阶段步骤(IC-R和/或B-R)中选择比所述纯化阶段步骤(IC1、B1、IC2和/或B2)更高的梯度斜率。
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在所述方法的相互连接步骤中，通过所述上游吸附区入口向所述上游区段入口加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，并且其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前用无改性剂或具有与所述上游吸附区段入口处不同的改性剂浓度的洗脱液进行管线内稀释。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在该方法的无纯化产物洗脱的分批步骤中，对先前的上游吸附区进行清洁，优选地用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液或用具有不同改性剂的洗脱液或用清洁溶液进行清洁，并再生，并且其中向先前的下游吸附区入口加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度，
以及/或者其中在具有经纯化的产物洗脱的方法的分批步骤中，通过所述上游吸附区入口向先前上游吸附区加载洗脱液，其梯度形式为随时间改变的改性剂浓度。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在所述再循环阶段中的所述相互连接再循环步骤(IC-R)中，所述通过所述上游吸附区段入口向上游吸附区段加载具有改性剂浓度随时间改变的梯度形式的洗脱液，并且其中将离开所述上游吸附区出口的流在进入所述下游吸附区入口之前用无改性剂或改性剂浓度与所述上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释；
以及/或者其中在所述任选的分批再循环步骤(B-R)中对前述步骤a.中先前的上游吸附区段进行清洁，优选地用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液或用具有不同改性剂的洗脱液或用清洁溶液进行清洁，并再生，并且其中将具有改性剂浓度随时间改变的梯度形式的洗脱液加载至步骤a.中先前的下游吸附区段的入口以洗脱不与产物(P)重叠的范围内的弱吸附杂质(W)。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在所述纯化阶段中的所述第一相互连接纯化步骤(IC1)中，通过所述上游吸附区入口向所述上游吸附区段加载具有改性剂浓度随时间改变的梯度形式的洗脱液，并且其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与所述上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释；
以及/或者其中在所述第一分批纯化步骤(B1)中，通过经其入口向先前的上游吸附区段加载具有改性剂浓度随时间改变的梯度形式的洗脱液来从其中洗脱产物(P)；
以及/或者其中在所述第二相互连接纯化步骤(IC2)中，通过上游吸附区入口向所述上游吸附区段入口加载有具有改性剂浓度形式随时间改变的梯度形式的洗脱液，并且其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度与所述上游吸附区段入口处不同的洗脱液进行管线内稀释；
以及/或者其中在所述第二分批纯化步骤(B2)中，对先前的上游吸附区进行清洁，优选地用改性剂浓度高于前述相互连接再循环步骤结束时的洗脱液或用具有不同改性剂的洗脱液或用清洁溶液进行清洁，并再生，并且其中将具有改性剂浓度随时间改变的梯度形式的洗脱液加载至先前的下游吸附区入口。
7.根据前述权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述改性剂选自不同于所述洗脱液的基础溶剂或其混合物的有机溶剂或无机溶剂或其混合物、在这样的有机溶剂或无机溶剂(或其混合物)中的电解质，优选地选自溶解的盐或pH，或其组合，其中
优选地所述基础溶剂是水或者水与至少一种有机溶剂的混合物、或者与一种或更多种盐和/或有机溶剂混合的水，所述一种或更多种盐和/或有机溶剂中的一者或二者与水相比为较小比例，并且其中
进一步优选地，所述改性剂是有机溶剂；或者水与至少一种有机溶剂的混合物，其所述至少一种有机溶剂的浓度高于所述基础溶剂；水或者水与至少一种有机溶剂的混合物，具有与所述基础溶剂不同的盐或H+浓度。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在至少一个或所有阶段中使用洗脱液梯度，优选线性洗脱液梯度，其梯度形式为改性剂浓度随时间改变的提高。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在进行所述第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤之前进行启动阶段，其中
在第一分批启动时间跨度(tB-SU-F)期间，将所述吸附区(1，2)断开连接，
并且将进料混合物(F)供应至所述吸附区段(1)的入口以成为所述第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤的上游吸附区段，
同时对成为所述第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤的下游吸附区段的吸附区段(2)进行平衡，或者其已被平衡并且不运转，
并且其中优选地随后，在第二分批启动时间跨度(tB-SU-W)期间将所述吸附区(1，2)断开连接，并且将弱吸附杂质(W)从已在前述第一分批启动步骤中供应了进料混合物(F)的吸附区段(1)洗脱，同时对另一吸附区(2)进行平衡或者其已被平衡并且不运转。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述第一分批启动时间跨度(tB-SU-F)之后并且在所述第二分批启动时间跨度(tB-SU-W)之前，将洗脱液供应至所述吸附区段的入口以成为所述第一再循环阶段的第一相互连接再循环步骤的上游吸附区段，并且其中所述洗脱液无改性剂，或者其改性剂浓度基本上对应于在所述第一分批启动时间跨度期间施加的起始改性剂浓度，或在不存在第二分批启动时间跨度的情况下对应于所述第一相互连接再循环步骤的改性剂浓度；
以及/或者其中在所述第二分批启动时间跨度期间，向已供应有进料混合物(F)的吸附区段(1)的入口加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在至少一个基础顺序、优选地多于一个基础顺序终止之后进行关闭阶段，
其中所述关闭阶段按顺序包括以下步骤：
a’.相互连接关闭再循环步骤(IC’-R)，其中前述的和最后的第二相互连接纯化步骤(IC2)的上游吸附区段占据所述下游位置，而另一吸附区段占据所述上游位置，其中所述吸附区段相互连接，并且其中在关闭再循环相互连接时间跨度(tIC’-R-SD)期间上游吸附区段出口连接至下游吸附区段入口，
其中通过所述上游吸附区段入口向所述上游吸附区段加载洗脱液，并且其中将含有至少与产物(P)重叠的范围内的所述弱吸附杂质(W)、所述产物(P)和至少与产物(P)重叠的范围内的所述强吸附杂质(S)的级分从所述上游吸附区段洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区出口的流在进入所述下游吸附区入口之前进行管线内稀释；
b’.任选的分批关闭再循环步骤(B’-R)，其中将所述吸附区段断开连接，其中在关闭再循环分批时间跨度(tB’-R)期间所述吸附区段断开连接，并且
其中对前述步骤a’.中先前的上游吸附区段进行清洁和再生，并且其中将洗脱液加载至先前步骤a的下游吸附区段的入口以洗脱不与产物(P)重叠的范围内的弱吸附杂质(W)；
随后按顺序进行以下步骤，其中所述相互连接关闭再循环步骤的上游吸附区段承担所述下游吸附区段的功能，并且所述相互连接关闭再循环步骤的下游吸附区段承担所述上游吸附区段的功能：
c’.第一相互连接关闭纯化步骤(IC1-SD)，其中所述吸附区段相互连接，其中在第一相互连接关闭纯化时间跨度(tIC1’)期间将上游吸附区段出口连接至下游吸附区段入口，
其中通过所述上游吸附区入口向所述上游吸附区加载洗脱液，并且其中将含有重叠的弱吸附杂质(W)和产物(P)的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区段中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
d’.第一分批关闭纯化步骤(B1-SD)，其中在第一分批纯化时间跨度(tB1’)期间所述吸附区段断开连接，并且其中将产物(P)从先前上游吸附区段洗脱，并且其中先前的下游吸附区段是空闲的或者将洗脱液供应至所述先前的下游吸附区段入口；
e’.第二相互连接关闭纯化步骤(IC2-SD)，其中在第二相互连接关闭纯化时间跨度(tIC2’)期间将所述上游吸附区段出口连接至所述下游吸附区段入口，
其中通过所述上游吸附区段入口向所述上游吸附区段加载洗脱液，并且其中将含有处于重叠的产物(P)和强吸附杂质(S)的产物级分从所述上游吸附区洗脱到所述下游吸附区中，并且
其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前进行管线内稀释；
f’.第二分批关闭纯化步骤(B2-SD)，其中在第二纯化分批时间跨度(tB2’)期间所述吸附区断开连接，并且其中对先前的上游吸附区进行清洁并再生，并且其中将洗脱液加载至先前的下游吸附区入口
随后是
g’.第一最终关闭分批步骤(B-SD-P)，其中在第一最终关闭分批时间跨度(tB-SD-P)期间所述第一吸附区和第二吸附区断开连接，并且其中产物(P)从先前的下游吸附区洗脱，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的；
h’.任选但优选的第二最终关闭分批步骤(B-SD-S)，其中在第二最终关闭分批时间跨度(tB-SD-S)期间所述第一吸附区和第二吸附区断开连接，并且强吸附杂质S从先前的下游吸附区洗脱，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述相互连接关闭再循环步骤(IC’-R)中，通过所述上游吸附区段入口向前述的和最后的第二相互连接纯化步骤(IC2)的上游吸附区段加载恒定组成洗脱液，或加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液，其中将离开所述上游吸附区出口的流在进入所述下游吸附区入口之前用无改性剂或改性剂浓度不同于所述上游吸附区段入口处的洗脱液进行管线内稀释；
以及/或者其中在所述分批关闭再循环步骤(B’-R)中，对前述步骤a.中之前的上游吸附区段进行清洁并再生，并且其中将具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液加载至先前步骤a’.的下游吸附区段的入口以洗脱不与产物(P)重叠的范围内的弱吸附杂质(W)；
以及/或者其中在所述第一相互连接关闭纯化步骤(IC1-SD)中，通过所述上游吸附区入口向所述上游吸附区加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液，并且其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度不同于所述上游吸附区段入口处的洗脱液进行管线内稀释：
以及/或者其中在所述第一分批关闭纯化步骤(B1-SD)中，通过经由所述上游吸附区入口加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液，从先前上游的吸附区段洗脱产物(P)，并且其中先前的下游吸附区段是空闲的或者将洗脱液供应至先前的下游吸附区段入口，优选地洗脱液为所述基础溶剂形式；
以及/或者其中在所述第二相互连接关闭纯化步骤(IC2-SD)中，通过所述上游吸附区段入口向所述上游吸附区段加载恒定组成洗脱液或加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液，并且其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度不同于所述上游吸附区段入口处的洗脱液进行管线内稀释；
以及/或者其中在所述第二分批关闭纯化步骤(B2-SD)中，对先前的上游吸附区进行清洁并再生，并且其中将洗脱液加载至先前的下游吸附区入口；
以及/或者其中在所述第一最终关闭分批步骤(B-SD-P)中，用具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液从先前的下游吸附区洗脱产物(P)，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的；
以及/或者其中在所述第一最终关闭分批步骤第二最终关闭分批步骤(B-SD-S)中，将强吸附杂质S从先前的下游吸附区洗脱，并且其中另一吸附区是空闲的或再生的。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在所述再循环阶段中和/或在所述纯化阶段中使用具有不同斜率和/或流速的线性梯度。
14.根据前述权利要求2至13中任一项所述的方法，其中在所述方法的大多数或所有相互连接步骤中，通过所述上游吸附区入口向所述上游部分入口加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液，并且其中将离开所述上游吸附区段出口的流在进入所述下游吸附区段入口之前用无改性剂或改性剂浓度不同于所述上游吸附区段入口处的洗脱液进行管线内稀释，
并且其中
在该方法的没有经纯化产物洗脱的分批步骤中，对先前的上游吸附区用洗脱液进行清洁并再生，并且如果适用的话，则其中将具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液加载至先前的下游吸附区入口，
或者在有经纯化的产物洗脱的方法的分批步骤中，通过所述上游吸附区入口向先前的上游吸附区加载具有随时间改变的改性剂浓度的梯度形式的洗脱液，
并且其中所述改性剂选自不同于所述洗脱液的基础溶剂或其混合物的溶剂或其混合物、在这样的溶剂或其混合物中的电解质，优选地选自溶解的盐或pH，或其组合，其中优选地所述基础溶剂是水或者水与至少一种有机溶剂的混合物、或者和与水相比为较小比例的一种或更多种盐和/或有机溶剂混合的水，并且其中进一步优选地所述改性剂是有机溶剂；或者水与至少一种有机溶剂的混合物，所述至少一种有机溶剂的浓度高于所述基础溶剂；水或者水的混合物，具有与所述基础溶剂不同的盐或H+浓度，
并且其中经以下步骤，所述改性剂浓度是提高的，优选地线性提高，其过程为从不与产物(P)重叠的范围内的弱吸附杂质(W)洗脱(B-SU-W、B-R、B’-R、B2、B2-SD)开始时的最低浓度起始，在以下步骤中：
再循环(IC-R、IC’-R、IC1、IC1-SD)，除以下的最终关闭分批步骤(B-SD-P)的情况之外，以及
如果适用的话，产物洗脱(B1、B1-SD、B-SD-P)，并且如果适用的话，则另外的再循环(IC2、IC2-SD)，其中在所述再循环(IC2、IC2-SD)期间，所述改性剂浓度可以变化或只在所述再循环(IC2、IC2-SD)保持恒定
提高至最高浓度，然后开始所述强吸附杂质(S)的洗脱(B-R、B’-R、B2、B2-SD、B-SD-S)。
15.根据任一前述权利要求所述的方法用于纯化天然或合成来源的生物分子的用途，所述生物分子优选地选自：核酸分子包括DNA和RNA分子，蛋白质包括抗体，肽，碳水化合物，脂质，及其组合和修饰物以及其片段。
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