KR20240065316A - 정제 방법 및 그의 사용 - Google Patents

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라스 오만
리차드 웰돈
세바스티앙 보그
토마스 뮬러-스파스
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크로마콘 아게
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Abstract

본 발명은 생성물(P) 및 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 강하게 흡착하는 불순물(S)을 나타내는 적어도 2종의 추가 성분으로 구성된 공급물 혼합물(F)로부터 생성물(P)의 단리를 위한 순환식 크로마토그래피 정제 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 방법은 크로마토그래피 고정상으로서 2개의 크로마토그래피 흡착기 섹션만을 사용하되, 상기 방법은 적어도 하나의 재순환 페이스(Recycling Phase)에 이어서 하나의 정제 페이스(Purification Phase)만을 갖는 적어도 하나의 베이스 시퀀스(base sequence)를 포함하고, 바람직하게는 베이스 시퀀스는 순환식 방식(cyclic manner)으로 반복한다.

Description

정제 방법 및 그의 사용
본 발명은 화학적 합성을 통해 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 등의 고순도 치료제를 제조하기 위한 순환식 크로마토그래피 방법(cyclic chromatographic method)에 관한 것이다.
치료제의 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질과 같은 활성 물질의 정제 공정은 대체로 일련의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
펩티드 및 올리고뉴클레오티드 생산의 많은 경우에, 표적 화합물은 화학적 합성에 의해 얻어진다. 이러한 공정에서, 표적 화합물과는 별도로 다운스트림(downstream) 공정에서 제거되어야 할 필요가 있는 생성물-관련 불순물(product-related impurities)이 생성된다.
크로마토그래피는 높은 선택성으로 인해 생성물-관련 불순물을 제거하기 위한 필수적인 단위 작동(unit operation)이다. 크로마토그래피의 목적은 높은 생성물 수율 및 처리량을 유지하면서 순도 사양을 충족하는 생성물 풀(product pool)을 생산하는 것이다.
이러한 목표를 달성하기 위해, 선형 구배 크로마토그래피(linear gradient chromatography)가 자주 사용된다. 선형 구배 크로마토그래피에서는, 크로마토그래피 흡착기(chromatographic adsorber)에서 생성물이 고정상(stationary phase)에 결합된 후, 상기 흡착기를 통해 펌핑되는 이동상(mobile phase)의 조성은 시간에 따라 점차적으로 일정한 기울기로 변화한다.
이는 조기 용리하는(약하게 흡착하는) 불순물, 생성물, 및 늦게 용리하는(강하게 흡착하는) 불순물의 순차적인 탈착(sequential desorption)으로 이어진다. 크로마토그램에서는, 이러한 용리 화합물의 시퀀스는 일련의 피크로 볼 수 있다. 보다 얕은 선형 구배를 실행함으로써, 분리할 화합물의 분해능(resolution)을 개선시킬 수 있으나, 이는 처리 시간의 증가 및 처리량의 감소로 이어진다. 마찬가지로, 상기 화합물의 분해능은 칼럼에 로딩된 출발 물질(공급물)의 질량을 감소시킴으로써 증가될 수 있으나, 이는 처리량도 감소시킨다.
조제용 크로마토그래피(preparative chromatography)에서는, 처리량이 중요하고 따라서 구배 지속 시간(gradient duration)이 제한되어 조제용 크로마토그램에서 불순물과 생성물 피크가 중첩된다. 생성물 순도는 통상적으로 생성물 피크의 중앙에서 가장 높게 얻어지며, 크로마토그램의 이 부분은 용리 중 흡착기 출구에서 풀(pool)로 수집된다. 불순물 피크와 생성물 피크가 중첩되는 사이드 분획(side fractions)을 생성물에 포함시키는 것은 생성물 풀 순도의 감소로 이어진다. 순도 제약을 위반하지 않으려면 통상적으로 사이드 분획 중 생성물의 일부를 생성물 풀에서 제외시켜야 한다. 생성물 풀에 포함되지 않은 생성물의 분획은 흡착기에 로딩된 출발 물질에 포함된 대부분의 생성물을 구성할 수도 있다. 생성물 손실을 방지하기 위해서는 불순물 사이드 분획에 포함된 생성물을 회수하는 것에 대한 관심이 크다. 빈번하게는, 상기 사이드 분획은 재-크로마토그래피를 수행하며, 즉 동일하거나 또는 유사한 크로마토그래피 단위 작동은 로딩 물질로서 사이드 분획을 사용하여 수행된다. 이러한 작동을 통해, 생성물의 분획은 순수하게 회수될 수 있으나, 로딩 재료는 일반 공급물 재료(regular feed material)보다 불순물 함량이 더 높아서 분리가 어렵다. 재-크로마토그래피는 규제적 한계, 사이드 분획 저장 및 취급, 사이드 분획 안정성 및 품질 관리를 포함한 일련의 작동 상의 단점을 갖는다.
크로마토그래피 중 불순한 사이드 분획의 재순환(recycling)을 자동화하는 몇몇 공정들이 제시되었다. 이러한 공정들은 단일 및 다중-흡착기 재순환 공정으로 그룹핑될 수 있다.
단일 흡착기 셋업(adsorber setups)은 동일한 칼럼을 통한 크로마토그래피 프로파일의 재순환을 포함한다. 정상 상태 재순환(steady-state-recycling, SSR) 공정에서는, 순환 크로마토그래피 프로파일(circulating chromatographic profile)의 앞부분(leading portion) 및 뒷부분(trailing portion) 부분으로부터 분획을 수집하고, 프로파일의 내부로 신선한 샘플을 주입한다.
다중-흡착기 재순환 공정은 한 흡착기에서 다른 흡착기로 불순한 사이드-분획의 내부 재순환과 역류-원리(counter-current principles)의 사용, 즉 고정상과 이동상의 상대적 반대 이동(relative opposite movement)의 조합을 허용하고, 이는 생성물과 불순물의 분해능을 향상시킨다. 자동 재순환을 통해, 사이드-분획의 생성 및 수집, 외부 저장, 취급, 및 분석을 방지할 수 있는 반면, 공정으로부터 순수한 생성물만 고수율로 회수된다.
내부 재순환과 역류-원리를 조합한 다중-흡착기 공정은 시뮬레이션된 이동층(simulated moving bed; SMB) 공정으로 알려져 있다. 초기 SMB 공정은 두 화합물의 분리(이원 분리(binary separations))로 제한되어 선형 구배 조건 하에서는 작동할 수 없어 크로마토그램에서 중심 컷(center cut)을 필요로 하지 않는 분리로 그 적용을 제한하였다.
SMB의 개념은 "MCSGP(다중칼럼 역류 용매 구배 정제(Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification))" 공정으로 알려진 선형 용매 구배 능력(linear solvent gradient capabilities)을 가진 중심 컷 (삼원(ternary)) 분리에 대한 매우 효율적인 공정을 도출하도록 더 개발되었다(EP-A-1 877 769 참조). 이 공정은 산업적으로 잘 확립되어 있다. 다중-흡착기 및 내부 재순환을 이용한 기타 크로마토그래피 다중-흡착기 기술, 예를 들어 "정상 상태 재순환을 이용한 구배"(GSSR) 공정이 제안되었다.
MCSGP는 2 내지 8개의 칼럼 구성에 대해 기술되어 있지만, 더 많은 칼럼을 사용하는 셋업과는 반대로 장비 복잡성이 낮고 작동 유연성이 높기 때문에 실제로는 주로 2-흡착기 구성이 사용된다.
MCSGP 공정은 단일 칼럼 배치 크로마토그래피 크로마토그램을 기반으로 설계된다. 일반적으로 MCSGP는 배치 크로마토그램(batch chromatogram)에서 가장 순수한 분획에 해당하는 순도의 생성물을 얻을 수 있다. 일부 경우에, 중첩 불순물은 생성물 피크보다 훨씬 아래로 늘어나 MCSGP에 의해 얻을 수 있는 최대의 순도를 제한할 수 있다.
본 발명은 일반 MCSGP(다중칼럼 역류 용매 구배 정제(Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification)) 공정보다 더 높은 생성물 순도에 도달할 수 있는 추가로 개선된 MCSGP 유사 공정을 제공하는 것을 목적으로 한다.
놀랍게도, 로딩 설계(loading scheme)의 변화와 조합된, MCSGP 공정과 유사한 공정으로의 추가적인 재순환 페이스들(recycling phases)의 도입을 통해서, 더 높은 순도뿐만 아니라 더 높은 순도에 대해 더 높거나 또는 동등한 생산성(처리량)이 필적할만한 수율로 얻어질 수 있다는 것을 발견하였다.
제안된 상기 추가적인 재순환 페이스들은 하나의 크로마토그래피 흡착기(chromatographic adsorber)로부터 다른 것으로 크로마토그래피 프로파일(chromatographic profile)을 이동시킴으로써 인라인 희석(inline dilution)을 적용하여 상기 크로마토그래피 프로파일을 다운스트림 흡착기(downstream adsorber)에 재-흡착시킨다. 전형적으로, 이러한 인라인 희석은 무함량 또는 저함량 개질제(modifier content)가 다운스트림 칼럼에서 다운스트림 액체의 용리 강도를 감소시키는 2개의 칼럼 사이에서 본질적으로 일정하게 첨가되는 방식으로 수행된다. 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography)의 경우 전형적인 개질제는 유기 용매인 반면, 이온 교환에서 전형적인 개질제는 (이온 강도를 개질시키는) 염 또는 (pH를 개질시키는) 산/염기이다. 상기 인라인 희석은 업스트림(upstream) 칼럼으로부터 용리되는 화합물의 완전한 흡착이 예상되는 수준으로 설정되며, 상기 재순환 페이스 동안 다운스트림 칼럼에서의 추가 분리를 촉진시키려는 것은 아니다. 따라서, 업스트림으로부터의 용리를 통해 얻어진 크로마토그래피 프로파일에서의 화합물의 부분 분리는 인라인 희석을 통해 소멸될 것으로 예상된다. 즉, 인라인 희석을 통한 분리 손실은 공급물 주입(feed injection) 후와 동일한 상황으로 이어질 것으로 예상된다.
따라서, 당업자는 정상 또는 "과도한" 인라인 희석을 갖는 재순환 단계(recycling step)의 도입이 생성물 순도의 개선으로 이어지지 않을 것으로 예상할 것이다.
더욱이, 당업자는 재순환 단계는 초과 시간(extra time)이 걸리고 이 시간 동안 추가 공급물(feed)이 도입되지 않고 생성물이 생산되지 않기 때문에 재순환 단계의 도입이 전체적인 공정 생산성(처리량)을 저하시킬 것으로 예상할 것이다.
놀랍게도, 재순환 페이스의 도입으로부터 초래하는 시간 손실은 로드(load)의 증가에 의해 과보상될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 외에도 재순환으로 인해 현저히 더 높은 순도를 얻을 수 있다.
상기 제시된 방법은 크로마토그래피 고정상(chromatographic stationary phase)으로서 2개의 크로마토그래피 흡착기 섹션을 사용한다. 하나의 흡착기 섹션은 하나의 단일 칼럼으로 구성될 수 있지만, 하나의 섹션의 칼럼이 공정에서 항상 상호 연결되고 결코 분리되지 않는 경우에는 여러 칼럼으로 구성될 수도 있다.
제1 흡착기 섹션은 제1 흡착기 섹션 유입구(first adsorber section inlet) 및 제1 흡착기 섹션 유출구(first adsorber section outlet)를 갖고, 제2 흡착기 섹션은 제2 흡착기 섹션 유입구 및 제2 흡착기 유출구를 갖는다.
상기 제시된 방법은 선택적이지만 바람직한 스타트업 페이스(Startup Phase, 시동 페이스), 하나 또는 여러 개의 재순환 시퀀스(n≥1)를 갖는 재순환 페이스(n≥1), 상기 재순환 페이스 후에 한번만 수행되는 정제 페이스(Purification Phase)를 포함한다. 상기 재순환 페이스 및 정제 페이스는 소위 베이스 시퀀스(base sequence, 기본 시퀀스)를 형성하고, 이러한 베이스 시퀀스는 적어도 1회(m≥1) 반복된다. 원하는 수의 베이스 시퀀스 후에는, 선택적인 그러나 바람직한 셧다운 페이스(Shutdown Phase, 정지 시퀀스)가 이어진다.
이러한 기초적 원리는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.
도 2는 재순환 페이스에서 사이클(순환)의 상이한 수 n = 1, 2, 3, 4에 대해 제시된 방법을 보여준다. 모든 실시예는 스타트업 페이스로 시작하고 셧다운 페이스로 끝난다. 상기 스타트업 페이스에서, 정상적으로 사전 평형화된, 제1 흡착기(1)에 공급물 혼합물(feed mixture)(F)을 로딩한다. 상기 공급물 혼합물은 원하는 생성물(P) 뿐만 아니라 불순물, 즉 더 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 더 강하게 흡착하는 불순물(S)를 포함한다. 후속적으로, 상기 약하게 흡착하는 불순물(W), 즉 생성물(P)보다 고정상에 더 약하게 흡착하는 불순물은 (기술되고 바람직한) 공급물 유동(Feed flow)을 계속하거나 또는 계속하지 않는 이러한 흡착제로부터 용리된다. 이후, 공정은 재순환 페이스로 들어간다.
n=1인 경우, 재순환 페이스 자체는 하나의 사이클(순환), 즉 하나의 상호 연결된(IC-R) 단계 및 하나의 분리된(B-R) 단계로 구성된다. 상기 상호 연결된 단계에서, 제1 흡착기(1)의 유출구는, 바람직하게는 구배(gradient)를 이용하여, 용매를 공급하는 동안 제2 흡착기(2)의 유입구에 연결된다(더 상세한 것은 도 5 참조). 인라인 희석은 흡착기들 사이에서 수행된다. 인라인 희석은 베이스 용매를 사용하여 구배없이 일어난다.
이어서, 후속 분리 단계(B-R)에서, 흡착기는 분리되어 불순물(S), 즉 생성물보다 고정상에 보다 강하게 흡착하는 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리되고 이러한 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 불순물(W)은 제2 흡착기(2)로부터 용리된다. 재순환 페이스에서 이러한 후자의 분리된 단계(B-R)는 선택적이다.
n=2인 경우, 재순환 페이스는, 하나 초과의 사이클(순환), 즉 하나의 추가로 상호 연결된 단계 및 하나의 추가로 (선택적) 분리된 단계에 의해 보충된, n=1의 재순환 페이스로 구성된다. 상기 추가로 상호 연결된 단계에서, 전자의 제2 흡착기(2)의 유출구는 전자의 제1 흡착기(1)의 유입구에 연결된다. 이어서, 다음의 추가로 분리된 단계에서, 흡착기는 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리되고 상기 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리된다. 이러한 후자의 추가로 분리된 단계는 다시 선택적이다.
n=3인 경우, 재순환 페이스는, 하나의 짝수의 추가로 상호 연결된 단계 및 하나의 짝수의 추가로 (선택적) 분리된 단계에 의해 보충된, n=2의 재순환 페이스로 구성된다. 추가로 상호 연결된 단계에서, 제1 흡착기(1)의 유출구는 제2 흡착기(2)의 유입구에 연결된다. 이어서, 다음의 분리된 단계에서, 흡착기는 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리되고 상기 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리된다. 이러한 후자의 분리 단계는 다시 선택적이다.
n=4인 경우, 재순환 페이스는, 다시 하나의 추가로 상호 연결된 단계 및 다시 하나의 추가로 분리된 단계에 의해 보충된, n=3의 재순환 페이스로 구성된다. 추가로 상호 연결된 단계에서, 제2 흡착기(2)의 유출구는 제1 흡착기(1)의 유입구에 연결된다. 이어서, 다음의 분리된 단계에서, 흡착기는 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리되고 상기 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리된다. 이러한 후자의 분리된 단계는 선택적이다.
일반적으로, 임의의 사이클(순환) 수 n(n>1을 가짐)의 경우, 재순환 페이스는, 하나의 추가로 상호 연결된 단계 및 하나의 추가로 (선택적) 분리된 단계에 의해 보충된, 단계 및 n-1의 재순환 페이스로 구성된다.
일반적으로, 재순환 페이스의 마지막 상호 연결된 단계에서, 상기 재순환 페이스의 짝수 n=2, 4, 6, ...인 경우, 제2 흡착기(2)의 유출구는 제1 흡착기(1)의 유입구에 연결된다. 이어서, 다음의 분리된 단계에서, 수행되는 경우, 흡착기는 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리되고 상기 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리된다. 이러한 후자의 분리된 단계는 선택적이다.
일반적으로, 재순환 페이스의 마지막 상호 연결된 단계에서, 상기 재순환 페이스의 홀수 n=1, 3, 5, ...인 경우, 제1 흡착기(1)의 유출구는 제2 흡착기(2)의 유입구에 연결된다. 이어서, 다음의 분리된 단계에서, 흡착기는 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리되고 상기 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리된다. 이러한 후자의 분리된 단계는 선택적이다.
재순환 페이스 다음에 정제 페이스가 이어진다. 각 정제 페이스는 제1 상호 연결된 단계(IC1), 제1 배치(분리된) 단계(first batch (disconnected) step)(B1), 제2 상호 연결된 단계(IC2) 및 제2 배치(분리된) 단계(B2)를 포함한다.
n=1 및 n=3이고 임의의 홀수 자연수 n에 대해, 정제 페이스의 상호 연결된 단계(IC1)에서, 제2 흡착기(2)의 유출구는 제1 흡착기(1)의 유입구에 연결되며, 즉 제2 흡착기(2)는 제1 흡착기(1)의 업스트림에 있고 2개의 흡착기 사이에서 인라인 희석이 수행된다. 후속 배치(batch) 단계(B1)에서는, 흡착기가 분리되고 정제된 생성물(P)은 제2 흡착기(2)로부터 용리되어 수집되는 한편, 새로운 공급물 혼합물(F)이 제1 흡착기(1)에 로딩된다. 다음의 상호 연결된 단계(IC2)에서, 흡착기가 연결되고 제2 흡착기(2)는 제1 흡착기(1)의 업스트림에 있으며 2개의 흡착기 사이에서 인라인 희석이 수행된다.
다음의 분리된 단계(B2)에서, 흡착기가 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리되고 흡착기가 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리된다.
n=2 및 n=4이고 임의의 짝수 자연수 n에 대해, 정제 페이스의 상호 연결된 단계(IC1)에서, 제1 흡착기(1)의 유출구는 제2 흡착기(2)의 유입구에 연결되며, 즉 제1 흡착기(1)는 제2 흡착기(2)의 업스트림에 있고 2개의 흡착기 사이에서 인라인 희석이 수행된다. 후속 배치 단계(B1)에서는, 흡착기가 분리되고 정제된 생성물(P)은 제1 흡착기(1)로부터 용리되어 수집되는 한편, 새로운 공급물 혼합물(F)이 제2 흡착기(2)에 로딩된다. 다음의 상호 연결된 단계(IC2)에서, 흡착기가 연결되고 제1 흡착기(1)는 제2 흡착기(2)의 업스트림에 있으며 2개의 흡착기 사이에서 인라인 희석이 수행된다.
다음의 분리된 단계에서, 흡착기가 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리되고 흡착기가 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리된다.
재순환 페이스의 임의의 수 n에 대해 그리고 베이스 시퀀스의 원하는 수 m 후에, 마지막 정제 페이스 다음에 도 3에 기술된 셧다운 페이스가 이어진다.
도 3은 재순환 페이스의 상이한 수 n=1, 2, 3, 4, ...에 대한 셧다운 페이스를 보여준다. 원하는 베이스 시퀀스의 수의 마지막 정제 페이스 다음에 셧다운 페이스가 뒤따르며, 셧다운 페이스 자체는 셧다운 페이스 I 및 II의 2개의 단계로 구성된다.
첫번째 페이스인 셧다운 페이스 I은 공정의 선행 재순환 페이스의 마지막 IC-R 및 (선택적인) B-R 단계와 동일한 단계로 구성된다.
두번째 셧다운 페이스인 셧다운 페이스 II는 일부 수정을 가한 공정의 이전 정제 페이스와 동일한 단계로 구성되지만, 생성물(P)을 용리하고 불순물(S)을 용리하는 추가 단계로 확장되지만, 새로운 공급물 혼합물(F)을 추가로 로딩하지 않고 작동된다.
n=1 및 n=3이고 임의의 홀수 자연수 n에 대해, 상기 셧다운 페이스 I은 상호 연결된 단계로 구성되되, 여기서 제1 흡착기(1)의 유출구는 제2 흡착기(2)의 유입구에 연결된다. 인라인 희석은 흡착기 사이에서 수행된다. 다음의 분리된 단계에서, 상기 흡착기는 분리되고 강하게 흡착하는 S 불순물은 제1 흡착기(1)로부터 용리되고 상기 흡착기는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 제2 흡착기(2)로부터 용리된다. 이러한 후자의 분리된 단계는 선택적이다.
n=1 및 n=3이고 임의의 홀수 자연수 n에 대해, 셧다운 페이스 II는 상호 연결된 단계(IC1)로 구성되되, 여기서 제2 흡착기(2)의 유출구는 제1 흡착기(1)의 유입구에 연결되며, 즉 제2 흡착기(2)는 제1 흡착기(1)의 업스트림에 있고 2개의 흡착기 사이에서 인라인 희석이 수행된다. 후속 배치 단계(B1)에서, 흡착기가 분리되고 정제된 생성물(P)이 제2 흡착기(2)로부터 용리되어 수집된다. 이러한 단계에서, 새로운 공급물 혼합물(F)은 제1 흡착기(1)에 로딩되지 않는다. 다음의 상호 연결된 단계(IC2)에서, 흡착기가 연결되고 제2 흡착기(2)는 제1 흡착기(1)의 업스트림에 있으며 2개의 흡착기 사이에서 인라인 희석이 수행된다. 후속적으로 정제된 생성물(P)이 용리되어 제1 흡착기(1)로부터 수집되고 강하게 흡착하는 불순물(S)은 제1 흡착기(1)로부터 용리된다.
n=2 및 n=4이고 임의의 짝수 자연수 n에 대해, 셧다운 페이스 I은 홀수 n에 대해 셧다운 페이스 I과 동일한 단계로 구성되지만, 흡착기(1) 및 (2)는 서로 교환되고, n=2 및 n=4이고 임의의 짝수 자연수 n에 대해, 셧다운 페이스 II는 홀수 n에 대해 셧다운 페이스 II와 동일한 단계로 구성되지만 흡착기(1) 및 흡착기(2)는 서로 교환된다.
도 4는 임의의 n에 대한 스타트업 페이스에서의 2개의 흡착기의 과업(tasks)을 보여준다. 상기 스타트업 페이스에서, 사전에 평형화된 제1 흡착기(1)에 공급물 혼합물(F)를 로딩한다(B-SU-F 단계). 이어서 약하게 흡착하는 불순물(W)은 이러한 흡착기로부터 용리된다(B-SU-W 단계). B-SU-W 단계에서의 제1 흡착기(1)에서 작동되는 선형 구배 구간(linear gradient segment), 유량(flow rate) 및 교체 시간(switch time)은 바람직하게는 단일 칼럼 크로마토그램에 대해 선택되는 것에 대응한다.
일반적으로, 상기 제시된 방법의 작동 파라미터, 즉 유량, 구배 농도, 공급물 양(feed amount) 및 교체 시간은 도 4의 하단에 도시된 바와 같이 단일 흡착기 크로마토그램으로부터 도출될 수 있다. 따라서, 상기 제시된 방법은 단일 흡착기 크로마토그램을 기반으로 설계 및 초기 설정될 수 있으며, 예를 들어 검출기 피드백을 기반으로 한 작동 중 더욱 정교한 제어가 가능하다.
도 5는 n=1에 대해 제시된 방법의 재순환 페이스를 보여준다.
재순환 페이스 자체는 적어도 하나의 상호 연결된(IC-R) 및 분리된(B-R) 단계의 시퀀스를 포함한다. 제1 상호 연결된 단계(IC-R)에서, 제1 흡착기(1)의 유출구는 제 2 흡착기(2)의 유입구에 연결된다. 흡착된 화합물 W, P, S는 용매 구배를 이용하여 제1 흡착기(1)로부터 제 2 흡착기(2)로 용리되되, 여기서 개질제 없이 또는 개질제 함량이 낮은 베이스 용매(base solvent)를 갖는 흡착기들 사이에서 인라인 희석이 수행되어 제2 흡착기(2)에 W, P, S가 강하게 흡착되고 바람직하게는 약하게 흡착하지 않는 W 불순물은 다운스트림 흡착기(2)에서 빠져나온다. 이어서, 다음의 제1 분리된 단계(B-R)에서, 흡착기가 분리되고 잔여 S 불순물이 높은, 바람직하게는 일정한 개질제 농도를 이용하여 제1 흡착기(1)로부터 용리되고 이어서 흡착기(1)는 재-평형화되는 한편, 약하게 흡착하는 W 불순물은 낮은 출발 개질제 농도 구배를 이용하여 제2 흡착기(2)로부터 용리된다(공정의 함수로서 개질제 농도를 나타내는 각 단계 아래의 하단 점선 참조). 이러한 후자의 분리된 단계(B-R)는 선택적이며, 그의 중요성은 공급물 혼합물(F)에서 생성물(P)의 순도 및 순도 사양(purity specification)에 따라 달라진다. 낮은 순도는 W 및 S의 보다 높은 함량에 대응하므로 W 및 S의 제거를 위한 재순환 페이스에서 분리 단계(B-R)를 포함하는 것으로 고려할 수 있다. 다시 말해, 제시된 방법의 작동 파라미터, 즉 유량, 구배 농도, 공급물 양 및 교체 시간은 도 5의 하단에 도시된 바와 같이 단일 흡착 크로마토그램으로부터 도출될 수 있으며, 예를 들어 검출기 피드백에 기초하여 작동 중 더욱 정밀한 제어가 가능하다.
n=1에 대해, 셧다운 페이스 I은 재순환 페이스와 동일하다. 각각의 재순환 페이스에 정제 페이스(도 2, 도 6)가 이어진다.
도 6은 n=1, 3, 5, ...에 대해 제시된 방법의 정제 페이스를 보여준다. 각각의 정제 페이스는 제1 상호 연결된 단계(IC1), 제1 배치 (분리된) 단계(B1), 제2 상호 연결된 단계(IC2) 및 제 2 배치 (분리된) 단계(B2)를 포함한다.
상호 연결된 단계(IC1)에서, 제2 흡착기(2)의 유출구는 제1 흡착기(1)의 유입구에 연결되며, 즉 제2 흡착기(2)는 제1 흡착기(1)의 업스트림에 있다. 상호 연결된 단계(IC1)에서, W 및 P를 함유하는 부분적으로 순수한 사이드 분획(크로마그램에서 중첩 영역, 도 6의 하단의 개략적인 크로마토그램("구역 5") 참조)이 제2 흡착기(2)로부터 제1 흡착기(1)로 용리된다. IC1 작동 중, W 및 P를 함유하는 스트림(stream)은 W 및 P가 제1 흡착기(1)의 입구에서 완전히 흡착되도록 제1 흡착기(1)로 들어가기 전에 인라인으로 희석된다. 후속적인 배치 단계(B1)에서, 흡착기가 분리되고 정제된 생성물(P)은 제2 흡착기(2)로부터 용리되어 수집되는 한편, 새로운 공급물 혼합물(F)은 제1 흡착기(1)에 로딩된다. 후속적인 상호 연결된 단계(IC2)에서, 흡착기는 연결되고 제2 흡착기(2)는 제1 흡착기(1)의 업스트림에 있으며, P 및 S를 함유하는 부분적으로 순수한 사이드 분획(크로마그램에서 중첩 영역, 도 6의 하단("구역 7") 참조)이 제2 흡착기(2)로부터 제1 흡착기(1)로 용리된다. P 및 S를 함유하는 스트림은 화합물(P) 및 (S)가 제1 흡착기(1)의 입구에서 완전히 흡착되도록 제1 흡착기(1)로 들어가기 전에 인라인 희석된다. 다시 말해, 제시된 방법의 작동 파라미터, 즉 유량, 구배 농도, 공급물 양 및 교체 시간은 도 6의 하단에 도시된 바와 같이 단일 흡착 크로마토그램으로부터 도출될 수 있으며, 예를 들어 검출기 피드백에 기초하여 작동 중 더욱 정밀한 제어가 가능하다.
도 7: 공정 작동 종료시에 생성물(P) 손실을 방지하기 위해, 정제 페이스 다음에 셧다운 페이스가 이어지며, 셧다운 페이스 자체는 셧다운 페이스 I 및 셧다운 페이스 II의 2개의 단계로 구성된다.
n=1, 3, 5, ...에 대해, 셧다운 페이스 I은 n=1에 대한 재순환 페이스와 기능적으로 동일하며, 도 5에 도시된 바와 같다. 셧다운 페이스 I은 공정의 재순환 페이스의 마지막 시퀀스와 동일한 조건을 사용하는 단계 IC'-R과 B'-R을 포함한다.
도 7은 n=1, 3, 5, ...에 대한 제시된 방법의 셧다운 페이스 II를 보여준다.
셧다운 페이스 II는 공급물이 없지만 본질적으로 본 방법의 이전 정제 페이스와 동일한 단계를 포함하지만(도 6(IC1에 대응하는 IC1-SD, 공급물이 없지만 B1에 대응하는 B1-SD, IC2에 대응하는 IC2-SD, B2에 대응하는 B2-SD) 참조), 이전에 다운스트림 위치에 있던 제1 흡착기(1)로부터 생성물(P)(B-SD-P)를 용리하고 불순물(S)를 용리하고 동일한 흡착기(B-SD-S)를 세정 및 재생하는 추가 단계에 의해 확장된다. P의 수집을 위한 B-SD-P 및 B1-SD에서의 조건은 바람직하게는 유량 및 구배 농도의 측면에서 동일하다. 마찬가지로, S의 제거를 위한 B-SD-S 및 B2-SD에서의 조건은 바람직하게는 유량 및 구배 농도의 측면에서 동일하다.
선행 재순환 페이스가 상호 연결된 단계(IC-R) 및 분리된 단계(B-R)의 짝수의 시퀀스(n=2, 4, 6, ...)를 포함하는 경우, 단계(IC1-SD, B1-SD, IC2-SD, 및 B2-SD)에서 흡착기의 위치는 교환되며, 즉 상호 연결된 단계(IC1-SD)에서 제1 흡착기(1)의 유출구는 제 2 흡착기(2)의 유입구에 연결되어 제1 흡착기(1)는 제2 흡착기(2)의 업스트림에 있다. 마찬가지로, 상기 단계(B1-SD, IC2-SD, B2-SD)에서 흡착기의 위치는 교환된다.
상기 제시된 방법에서, 구배, 특히 선형 구배는 바람직하게는 화합물의 분리를 향상시키고/시키거나 구배 기울기(gradient slope)를 변경하여 용리 속도를 개질시키는 임의의 단계에서 사용될 수 있다.
정제 페이스 단계(IC1, B1, IC2 및/또는 B2)보다 재순환 페이스 단계(IC-R 및/또는 B-R)에서 더 높은 구배 기울기를 선택하면 재순환 페이스가 더 빨리 완료될 수 있으므로 전체 공정 생산성이 향상될 것이다.
보다 일반적으로 말하면, 본 발명은, 생성물(P), 및 약하게 흡착하는 불순물(weakly adsorbing impurities; W) 및 강하게 흡착하는 불순물(strongly adsorbing impurities; S)를 나타내는 적어도 2종의 추가 성분으로 구성된 공급물 혼합물(feed mixture; F)로부터 생성물(P)의 단리(isolation)를 위한 순환식 크로마토그래피 정제 방법에 관한 것이다.
상기 제안된 방법은 크로마토그래피 고정상으로서 2개의 크로마토그래피 흡착기 섹션만을 사용한다. 제1 흡착기 섹션은 제1 흡착기 섹션 유입구 및 제1 흡착기 섹션 유출구를 가지며, 제2 흡착기 섹션은 제2 흡착기 섹션 유입구 및 제2 흡착기 섹션 유출구를 갖는다.
상기 제안된 방법은 적어도 하나의 재순환 페이스(Recycling Phase)에 이어서 하나의 정제 페이스만을 갖는 적어도 하나의 베이스 시퀀스를 포함하되, 바람직하게는 상기 베이스 시퀀스는 순환식 방식으로 적어도 2회 반복된다.
본 발명에 따르면, 상기 재순환 페이스는 적어도 하나의 재순환 시퀀스(recycling sequences), 바람직하게는 오직 하나 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 재순환 시퀀스로 구성되며, 하기 단계:
a. 상호 연결된 재순환 단계(IC-R) - 상기 흡착기 섹션이 상호 연결되고, 업스트림 흡착기 섹션 유출구(upstream adsorber section outlet)가 재순환 상호 연결된 기간(recycling interconnected timespan)(tIC-R) 동안 다운스트림 흡착기 섹션 유입구(downstream adsorber section inlet)에 연결되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액(eluent)으로 로딩(loading)되고, 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 약하게 흡수하는 불순물(W), 상기 생성물(P), 및 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 강하게 흡수하는 불순물(S)을 함유하는 분획은 상기 업스트림 흡착기 섹션으로부터 상기 다운스트림 흡착기 섹션으로 용리되고, 상기 업스트림 흡수기 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡수기 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨 - ;
b. 선택적인 배치 재순환 단계(B-R) - 상기 단계는 전술한 흡착기 섹션들이 재순환 배치 기간(recycling batch timespan)(tB-R) 동안 분리되고(disconnected), 선행 단계 a.의 이전 업스트림 흡착기 섹션(previously upstream adsorber section)을 세정하여 상기 강하게 흡수하는 불순물(S)를 제거하고 재생시키며 용리액을 단계 a.의 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩하여 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)를 용리시킴 - ;
를 포함하되,
상기 단계 a. 및 b. 각각의 재순환 시퀀스 후에, 상기 흡착기 섹션은, 상기 재순환 시퀀스의 수가 ≥1인 순서로 교체(switch)된다.
본 발명에 따르면, 재순환 페이스 다음에 오직 하나의 정제 페이스(Purification Phase)만이 이어진다.
이러한 정제 페이스는 하기 단계들:
c. 제1 상호 연결된 정제 단계(IC1) - 상기 흡착기 섹션들이 상호 연결되되, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구는 제1 상호 연결된 정제 기간(tIC1) 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되고, 상기 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고, 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 생성물(P)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기 섹션으로 용리되되, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨 - ;
d. 제1 배치 정제 단계(B1) - 전술한 흡착기 섹션들이 제1 배치 정제 기간(tB1) 동안 분리되고 생성물(P)은 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션으로부터 용리되며 공급물 혼합물(F)이 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 공급됨 - ;
e. 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2) - 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구가 제2 상호 연결된 정제 기간(tIC2) 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고, 생성물(P) 및 강하게 흡착하는 불순물(S)를 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기로 용리되되, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 들어가기 전에 인라인으로 희석됨 - ;
f. 제2 배치 정제 단계(B2) - 전술한 흡착기 섹션들이 제2 정제 배치 기간(tB2) 동안 분리되되 상기 이전 업스트림 흡착기는 세정되고 재생되며 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩됨 - ;
를 순서대로 포함하되, 상기 선행 재순환 페이스의 마지막 상호 연결된 재순환 단계의 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 다운스트림 흡착기 섹션의 기능을 수행하고 상기 선행 재순환 페이스의 마지막 상호 연결된 재순환 단계의 상기 다운스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션의 기능을 수행한다.
위에서 지적한 바와 같이, 바람직하게는 용리액 구배는 적어도 하나 또는 모든 페이스에서 사용된다.
상기 방법의 상호 연결된 단계에서, 바람직하게는 상기 업스트림 섹션 유입구는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상이한, 바람직하게는 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구에서보다 낮은, 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석된다.
더욱 바람직하게는, 정제된 생성물 용리가 없는 상기 방법의 배치 단계에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는, 예를 들어 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 또는 상이한 개질제 또는 세정액으로 세정되고 재생되며 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩된다.
정제된 생성물 용리가 있는 상기 방법의 배치 단계에서, 바람직하게는 상기 이전 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 업스트림 흡착기 유입구에 로딩된다.
상기 상호 연결된 재순환 단계(IC-R)의 상기 재순환 페이스에서, 바람직한 구현예에 따르면, 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림 흡착기 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 선택적인 배치 재순환 단계(B-R)에서, 선행 단계 a.의 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션은, 예를 들어 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는, 용리액으로, 또는 상이한 개질제로, 또는 세정 용액으로 세정되고, 재생되며 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액은 단계 a.의 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩되어 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리한다.
또 다른 바람직한 구현예는 상기 제1 상호 연결된 정제 단계(IC1)에서의 상기 정제 페이스에서, 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되는 것을 특징으로 한다.
더욱이, 상기 제1 배치 정제 단계(B1)에서, 생성물(P)이 그의 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩함으로써 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션으로부터 용리되는 것이 바람직하다.
상기 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2)에서, 바람직하게는 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 (베이스 용매 단독) 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석된다.
또한, 상기 제2 배치 정제 단계(B2)에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 또는 상이한 개질제로 또는 세정액으로 세정되고, 재생되고 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액이 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩되는 것이 바람직하다.
상기 개질제는 바람직하게는 상기 용리액의 베이스 용매(또는 그들의 혼합물)와 상이한 유기 또는 무기 용매(또는 그들의 혼합물), 상기 유기 또는 무기 용매(또는 그들의 혼합물) 중의 전해질로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 용해된 염 또는 pH 또는 그들의 조합으로부터 선택된다.
바람직하게는 상기 베이스 용매는 유기 또는 무기 용매(또는 그들의 혼합물), 특히 물 또는 물과 적어도 하나의 유기 용매의 혼합물이며, 선택적으로는 완충제 염(buffer salts), 산, 또는 염기 또는 이들의 조합물을 함유한다. 예를 들어 상기 베이스 용매는 물 99.9% 및 트리플루오로아세트산(TFA, 0.1%)의 혼합물일 수 있고, 상기 개질제는 물 9.9%, TFA 0.1%, 및 아세토니트릴 90.0%의 혼합물일 수 있다. 대안적으로, 상기 개질제는 100% 아세토니트릴일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 베이스 용매는 수성 25 mM 인산염 완충제(pH 7.0)일 수 있고, 상기 개질제는 25 mM 인산염 완충제, 500 mM NaCl, pH 7.0일 수 있다.
상기 베이스 용매는 특히 예를 들어 생화학적 공정으로부터 생성되는, 분리되는 생체 분자의 경우, 일반적으로 물 또는 물과 비교하여 소량의 하나 이상의 염 및/또는 유기 용매(예를 들어 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산으로 보충됨)의 혼합물인 물이며, 이하에서 상기 베이스 용매는 용매 A로 지칭된다. 구배를 설정하기 위해, 이는 상기 베이스 용매(혼합물)와 상이한 추가 용매 또는 용매 혼합물과 혼합된다. 이러한 추가 용매는 예를 들어 상기 베이스 용매와 동일하지만 다른 비율을 가질 수 있는 용매의 혼합물(예를 들어 상기 예에서 높은 비율의 아세토니트릴로 보충된 물)일 수 있다. 특히 생체 분자의 경우, 전형적으로 이러한 추가 용매는 다시 물에 기반하지만, 더 증가된 비율의 유기 용매를 갖는다. 구배를 설정하기 위해, 일반적으로 상기 베이스 용매와 상이한 다소 낮은 농도의 성분(예를 들어 상기 베이스 용매가 물인 경우, 예를 들어 유기 용매(들), 염 또는 pH, 또는 이들의 조합)을 갖는 개질제 혼합물은 상기 구배의 시작시에 용리액으로서 제공되고, 대응하는 조절된 구배를 유도하는 상기 추가 용매를 갖는 구배 펌프에 의해 점점 더 혼합된다. 상기 공급물 혼합물은 상이한 용매에 제공될 수 있거나, 또는 상기 베이스 용매에 제공될 수 있거나, 또는 상기 공급물 혼합물은 적절한 농도의 상기 베이스 용매와의 혼합물인 원래의 용액(전형적으로 수용액)의 혼합물로서 제공될 수 있다. 바람직하게는, 선형 용리액 구배는 일시적으로 변화하는 개질제 농도 증가의 형태로 구배를 갖는 적어도 하나 또는 모든 단계에서 사용된다.
전술한 바와 같이, 바람직하게는 상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계를 수행하기 전에, 스타트-업 단계가 수행되되, 여기서
제1 배치 스타트-업 기간(tB-SU-F) 동안 상기 흡착기는 분리되고
공급물 혼합물(F)은 상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계의 업스트림 흡착기 섹션이 되도록 상기 흡착기 섹션의 유입구에 공급되는 한편,
상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계의 다운스트림 흡착기 섹션이 되는 흡착기 섹션은 평형화되고 있거나 또는 이미 평형화되고 불활성(inactive)이며,
바람직하게는 후속적으로, 제2 배치 스타트-업 기간(tB-SU-W) 동안 상기 흡착기는 분리되고 약하게 흡착하는 불순물(W)은 다른 흡착기가 평형화되고 있거나 또는 이미 평형화되고 불활성인 동안 상기 선행 제1 배치 스타트-업 단계에서 공급물 혼합물(F)이 공급된 상기 흡착기 섹션으로부터 용리된다.
상기 제1 배치 스타트-업 기간(tB-SU-F) 후에 및 상기 제2 배치 스타트-업 기간(tB-SU-W) 전에, 용리액이 상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계의 업스트림 흡착기 섹션이 되도록 상기 흡착기 섹션의 유입구에 공급될 수 있고, 상기 용리액은 개질제가 없거나 (베이스 용매 단독) 또는 상기 제1 배치 스타트-업 기간 동안 또는 상기 제1 상호 연결된 재순환 단계의 제2 배치 스타트-업 단계의 부재 시에 적용되는 출발 개질제 농도에 본질적으로 대응하는 개질제 농도를 가질 수 있다.
또한, 상기 제 2 배치 스타트-업 기간 동안 공급물 혼합물(F)이 공급된 상기 흡착기 섹션의 유입구에는 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액이 로딩될 수 있다.
적어도 하나의 베이스 시퀀스, 바람직하게는 하나 초과의 베이스 시퀀스의 종결 후에, 셧다운 페이스가 수행될 수 있으되, 상기 셧다운 페이스는 하기 단계들:
a'. 상기 선행 및 마지막 제 2 상호 연결된 정제 단계(IC2)의 업스트림 흡착기 섹션이 다운스트림 위치를 취하고 상기 다른 흡착기 섹션은 상기 업스트림 위치를 취하되, 상기 흡착기 섹션은 상호 연결되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구는 셧다운 재순환 상호 연결된 기간(tIC'-R-SD) 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되는, 상호 연결된 셧다운 재순환 단계(IC'-R),
여기서 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 약하게 흡착하는 불순물(W), 상기 생성물(P), 및 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 강하게 흡착하는 불순물(S)을 함유하는 분획은 상기 업스트림 흡착기 섹션으로부터 상기 다운스트림 흡착기 섹션으로 용리되며,
상기 업스트림 흡착기 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
b'. 상기 흡착기 섹션이 분리되되, 상기 흡착기 섹션은 셧다운 재순환 배치 기간(tB'-R) 동안 분리되는, 선택적 배치 셧다운 재순환 단계(B'-R),
여기서 선행 단계 a'.의 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션이 세정되고 재생되며, 용리액은 단계 a의 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩되어 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리시킴;
을 순서대로 포함한다.
바람직하게는 이는 하기 단계들:
c'. 상기 흡착기 섹션이 상호 연결되되, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구는 제 1 상호 연결된 셧다운 정제 기간(tIC1) 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되는, 제1 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC1-SD),
여기서 상기 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 생성물(P)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기 섹션으로 용리되고,
상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
d'. 상기 흡착기 섹션이 제1 배치 정제 기간(tB1') 동안 분리되고 생성물(P)은 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션으로부터 용리되고 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션은 유휴 상태(idle)이거나 또는 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기에 공급되는, 제1 배치 셧다운 정제 단계(B1-SD);
e'. 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구가 제2 상호 연결된 셧다운 정제 기간(tIC2') 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되는, 제 2 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC2-SD),
여기서 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고 생성물(P) 및 강하게 흡착하는 불순물(S)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기로 용리되고,
상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
f'. 상기 흡착기가 제2 정제 배치 기간(tB2') 동안 분리되고 상기 이전 업스트림 흡착기는 세정되고 재생되며 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩되는, 제2 배치 셧다운 정제 단계(B2-SD);
가 순서대로 이어지되,
상기 상호 연결된 셧다운 재순환 단계의 업스트림 흡착기 섹션은 상기 다운스트림 흡착기 섹션의 기능을 취하고 상기 상호 연결된 셧다운 재순환 단계의 다운스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션의 기능을 취한다.
이는 전형적으로는 하기 단계들:
g'. 상기 제1 및 제2 흡착기가 제1 최종 셧다운 배치 기간(tB-SD-P) 동안 분리되고 생성물(P)은 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리되고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생되는, 제1 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-P);
h'. 선택적으로, 상기 제1 및 제2 흡착기가 제2 최종 셧다운 배치 기간(tB-SD-S) 동안 분리되고 강하게 흡착하는 불순물(S)은 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리되고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생되는, 제2 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-S);
가 순서대로 이어진다.
상기 상호 연결된 셧다운 재순환 단계(IC'-R)에서, 상기 선행 및 마지막 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2)의 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 일정한 조성 또는 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩될 수 있으되, 상기 업스트림 흡착기 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석된다.
상기 배치 셧다운 재순환 단계(B'-R)에서, 선행 단계 a.의 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션은 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로, 또는 상이한 개질제로 또는 세정 용액으로 세정될 수 있고, 재생되며 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액이 단계 a'.의 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩되어 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리한다.
상기 제1 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC1-SD)에서, 상기 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩될 수 있고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구에서 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석된다.
상기 제1 배치 셧다운 정제 단계(B1-SD)에서, 생성물(P)은 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩함으로써 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션으로부터 용리될 수 있고, 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션은 유휴 상태이거나 용리액이 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션 유입구, 바람직하게는 베이스 용매에 공급된다.
상기 제2 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC2-SD)에서, 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 일정한 조성 또는 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩될 수 있고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석된다.
또한, 상기 제2 배치 셧다운 정제 단계(B2-SD)에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 세정되고 재생될 수 있으며 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩된다.
최종적으로, 상기 제1 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-P)에서, 생성물(P)은 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리될 수 있고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생되고/되거나,
상기 제1 최종 및 제2 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-S)에서, 강하게 흡착하는 불순물(S)은 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리될 수 있고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생된다.
상이한 기울기 및/또는 유량을 갖는 선형 구배는 바람직하게는 재순환 페이스 및/또는 정제 페이스에 사용되되, 바람직하게는 보다 높은 기울기 및/또는 보다 높은 유량이 상기 정제 페이스에서 보다 상기 재순환 페이스에 사용된다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 대부분(특히 단계(IC2) 및 (IC2-SD)를 제외한 모든 단계) 또는 상기 방법의 모든 상호 연결된 단계에서, 상기 업스트림 섹션 유입구는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고,
정제된 생성물 용리가 없는 상기 방법의 배치 단계에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 세정되고 재생되며, 적용 가능한 경우, 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩되거나,
또는 정제된 생성물 용리가 있는 상기 방법의 배치 단계에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고,
상기 개질제는 상기 용리액의 베이스 용매 또는 그들의 혼합물과 상이한 용매 또는 그들의 혼합물, 상기 용매 또는 그들의 혼합물 중의 전해질로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 용해된 염 또는 pH 또는 그들의 조합으로부터 선택되되, 바람직하게는 상기 베이스 용매는 물 또는 물과 적어도 하나의 유기 용매의 혼합물 또는 물과 비교하여 적은 비율의 하나 이상의 염 및/또는 유기 용매의 혼합물 중의 물이며, 여기서 더욱 바람직하게는, 상기 개질제는 유기 용매 또는 물과 상기 베이스 용매 보다 높은 농도의 상기 적어도 하나의 유기 용매를 갖는 적어도 하나의 유기 용매의 혼합물, 물 또는 물과 상기 베이스 용매에서 보다 상이한 염 및/또는 H+ 농도를 갖는 것의 혼합물이고,
상기 개질제 농도는 하기 단계들:
하기 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-P)의 경우를 제외한, 재순환(IC-R, IC'-R, IC1, IC1-SD); 및
적용 가능한 경우, 생성물 용리(B1, B1-SD, B-SD-P) 및, 적용 가능한 경우, 추가 재순환(IC2, IC2-SD), 여기서 상기 재순환(IC2, IC2-SD) 동안, 상기 개질제 농도는 변경될 수 있거나 또는 상기 재순환 단계에서만 일정하게 유지될 수 있음;
에 걸쳐서 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 상기 약하게 흡착하는 불순물(W)의 용리(B-SU-W, B-R, B'-R, B2, B2-SD)의 시작 시 최저 농도로부터 상기 강하게 흡착된 불순물(S)의 용리(B-R, B'-R, B2, B2-SD, B-SD-S)의 시작 전에 최고 농도로 상기 공정에서 증가되고, 바람직하게는 선형으로 증가된다.
상기 제시된 공정에서, 상이한 치수의 흡착기 또는 상이한 고정상을 갖는 흡착기 또는 둘 다를 사용할 수 있다. 생성물(P)의 용리는 항상 동일한 흡착기로부터, 마찬가지로 새로운 공급물 재료의 로드(load)로부터 일어난다. 예를 들어 IC-R 및 B-R(n=1)의 단일 시퀀스만을 포함하는 재순환 페이스의 경우, 주요 정제 작동은 흡착기(2)(W/P의 재순환, 생성물(P) 용리, P/S의 재순환)에 의해 수행된다. 따라서, 흡착기(2)에서는 이 작동을 위해 작은 입자 크로마토그래피 수지를 사용하여 분해능을 극대화할 수 있는 한편, 흡착기(1)에서는 큰 입자 수지를 사용하여 재순환된 스트림을 수용할 수 있다. IC1과 IC2 단계에서 W/P 및 P/S의 인라인 희석으로 인해, 흡착기(1)로 들어가는 용리액의 흐름은 흡착기(2)에서 빠져나오는 스트림보다 크므로, 흡착기(1)은 작은 입자 수지보다 흐름 시 낮은 역압의 유동을 갖는 큰 입자로부터 이익을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은, 바람직하게는 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자, 항체를 포함한 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질뿐만 아니라 그들의 조합물 및 변형물, 뿐만 아니라 이들의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 천연 또는 합성 기원의 생체 분자의 정제를 위한 위에서 상세히 기술된 방법들의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예들은 종속항의 범위 내에 속한다.
본 발명의 바람직한 구현예는 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것일뿐 한정하기 위한 것이 아닌 하기 도면을 참조하여 기술된다.
도 1은 스타트업 페이스, 재순환 페이스, 정제 페이스, 및 셧다운 페이스를 포함한 제시된 공정의 일반적인 설계를 도시한 것이다.
도 2는 재순환 페이스에서 n=1....4 시퀀스에 대한 흡착기 연결 및 흡착기로 들어가고 빠져나오는 스트림을 포함한 상기 제시된 공정(스타트업 페이스, 재순환 페이스, 정제 페이스)의 로직을 보다 구체적으로 나타낸 것이다. W, P, S 또는 F를 함유하지 않는 공급물/용리액의 스트림은 특정하여 표시되지 않았다.
도 3은 재순환 페이스에서 n=1....4 시퀀스에 대한 흡착기 연결 및 흡착기로 들어가고 빠져나오는 스트림을 포함한 상기 제시된 공정(셧다운 페이스)의 로직을 보다 구체적으로 나타낸 것이다. W, P, S 또는 F를 함유하지 않는 공급물/용리액의 스트림은 특정하여 표시되지 않았다.
도 4는 단일 칼럼 크로마토그램(하단에 도시됨)을 참조로 하여 스타트업 페이스에서의 2개의 흡착기의 작업을 나타내고 선형 구배 작동의 경우 상기 공정에 사용되는 선형 구배 부분(굵은 점선)을 개략적으로 나타낸다. 수직인 얇은 점선은 섹션 경계를 개략적으로 나타내며; 도 4 내지 도 7에서 구역(zone)으로 지정되고 얇은 수직 점선에 의해 분리된 수직 섹션은 각각의 구역에 있는 칼럼의 서로 다른 기능을 나타내고; 우측 하단에서 상기 크로마토그램은 생성물(P)로, 상기 생성물(P) 보다 먼저 용리하는 생성물(P)의 좌측 상의 보다 약하게 흡착하는 불순물(W)로, 및 생성물(P) 보다 나중에 용리하는 생성물(P)의 우측 상의 보다 강하게 흡착하는 불순물(S)로 예시되어 있으며; 또한 구역(2)의 하단에서 점선으로 표시되어 있는 바와 같이, 그 구역의 칼럼의 유입구에서 그 구역(2)에서 적용 가능한 공급물 농도를 나타낸다. 상기 크로마토그램의 구역(도 4의 구역 (4) 내지 (8), 도 6 내지 도 7, 및 도 5의 구역 (4) 내지 (6))에서, 하단의 점선은 보다 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 생성물(P)의 용리 동안 각각의 구역에 있는 칼럼의 유입구에 적용되는 구배에 사용되는 개질제의 농도를 나타내고(도 4의 구역 (4) 내지 (7), 도 6 내지 도 7, 및 도 5의 구역 (4) 내지 (5)), P와 중첩되지 않은 S의 용리의 페이스에서 적용된 높은 수준이지만 일반적으로는 일정한 개질제 농도를 나타낸다(도 4의 구역 (8), 도 6 내지 도 7, 도 5의 구역 (6)).
도 5는 단일 칼럼 크로마토그램(하단에 도시됨)을 참조로 하여 재순환 페이스에서의 2개의 흡착기의 과업을 나타내며 선형 구배 작동의 경우 상기 공정에 사용되는 선형 구배 세그먼트를 개략적으로 나타낸다.
도 6은 단일 칼럼 크로마토그램(하단에 도시됨)을 참조로 하여 정제 페이스에서 2개의 흡착기의 과업을 나타내며, 선형 구배 작동의 경우 상기 공정에 사용되는 선형 구배 세그먼트를 개략적으로 나타낸다.
도 7은 단일 칼럼 크로마토그램(하단에 도시됨)을 참조로 하여 셧다운 페이스 II에서 2개의 흡착기의 과업을 나타내며, 선형 구배 작동의 경우 상기 공정에 사용되는 선형 구배 세그먼트를 개략적으로 나타낸다.
도 8a는 상기 제시된 공정의 셧다운 페이스 및 단일 칼럼 기준 실행(single column reference run)의 UV 프로파일의 오버레이(overlay)를 나타내고, 도 8b는 상기 제시된 공정의 셧다운 페이스 및 단일 칼럼 기준 실행의 오프라인 HPLC 분석에 의해 결정된 생성물 농도 값의 오버레이를 나타내며, 도 8c는 상기 제시된 공정의 셧다운 페이스 및 단일 칼럼 기준 실행의 오프라인 HPLC 분석에 의해 결정되는 생성물 순도 값의 오버레이를 나타내고, 도 8d는 상기 제시된 공정의 셧다운 페이스 및 단일 칼럼 기준 실행의 오프라인 HPLC 분석에 의해 결정되는 불순물 함량 값의 오버레이를 나타낸다. 강하게 흡착하는 불순물(S)의 주요 피크는 도 8d)에서 화살표로 표시된다.
도 9는 상기 제시된 공정 및 단일 칼럼 기준 실행의 순도/수율 곡선의 오버레이를 나타낸다.
도 10a는 페이스 IC1, B1, IC2 및 B2를 통해 업스트림 칼럼의 칼럼 유출구(column outlet)에 기록된 일반 MCSGP 공정의 내부 크로마토그램을 나타내고; 도 10b는 단계 IC1, B1, IC2 및 B2를 통해 업스트림 칼럼의 칼럼 유출구에 기록된 n=1에 대한 상기 제시된 공정의 정제 페이스의 내부 크로마토그램을 나타내며; 도 10c은 단계 IC1, B1, IC2 및 B2를 통해 업스트림 칼럼의 칼럼 유출구에 기록된 n=2에 대한 상기 제시된 공정의 정제 페이스의 내부 크로마토그램을 나타내고; 직사각형 영역(rectangular shaped areas)은 생성물 수집 간격을 나타내고, 약하게 흡착하는 불순물의 위치에서는 "W" 점으로 표시된 화살표로 그리고 강하게 흡착하는 불순물의 위치에서는 "S" 점으로 표시된 화살표로 나타내었다.
도 11a는 10 cm 층 높이(bed height)를 갖는 배치 기준 공정(batch reference process)의 크로마토그램을 나타내고; 도 11b는 20 cm 층 높이를 갖는 배치 기준 공정의 크로마토그램을 나타낸다. 직사각형 영역은 생성물 수집 간격을 나타내고, 약하게 흡착하는 불순물의 위치에서는 "W" 점으로 표시된 화살표로 그리고 강하게 흡착하는 불순물의 위치에서는 "S" 점으로 표시된 화살표로 나타내었다.
도 12는 1, 즉 재순환 페이스에서 n=1 시퀀스로 제시된 공정, 2, 즉 재순환 페이스에서 n=2 시퀀스로 제시된 공정, MCSGP 공정, 10cm 층 높이를 갖는 단일 칼럼 배치 기준 공정, 20cm 층 높이를 갖는 단일 칼럼 배치 기준 공정에 대한 생성물 풀 순도(product pool purity) 대 생산성(productivity)을 보여준다.
실시예 1: 안지오텐신 II의 정제
화학 합성으로부터의 2.1g/L의 안지오텐신을 함유하는 공급 용액을 용매 A(5% 아세토니트릴(ACN) + 물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)) 중에서 제조하였다. 크로마토그래피 실행(chromatographic runs)을 위해, 용매 A 및 용매 B(50% ACN + 물 중의 0.1% TFA)를 사용하였다. 공급물 순도는 %W=4.76, %P=91.67, %S=3.57(분석용 HPLC에 기초한 면적% 각각의 경우)이었다.
상기 제시된 공정을 수행하기 위해 2.5mL의 칼럼 부피(내경 0.46 cm × 층 높이 15 cm)의 2개의 칼럼을 사용하였다. 참고로, 동일한 물질을 사용하여 단일 칼럼 실행을 수행하였다.
상기 제시된 공정은 표 1에 주어진 파라미터를 사용하여 콘티크롬(Contichrom) CUBE 시스템(ChromaCon) 상에서 수행하였다.
상기 재순환 페이스의 효과를 조사하기 위해, 상기 재순환 페이스 직후 셧다운 페이스를 수행하고 생성물 피크를 비-순환식 비-연속식 공정(non-cyclic non-continuous process)으로 분별하였다. 분별된 셧다운(fractionated shutdown)과 단일 칼럼 기준 실행의 분별의 비교는 칼럼 유출구(도 8a)에 기록되고 분석용 HPLC(도 8b)를 이용하여 오프라인 분석으로 확인된 UV 검출기 신호에서 모두 가시적이므로 상기 제시된 공정으로 생성물 피크가 넓다는 것을 나타낸다. 그러나 분석용 HPLC에 의해 결정된 바와 같이, 달성된 순도는 상기 제시된 공정에서 상당히 넓은 분획 범위에 걸쳐 더 높았다(도 8c). 오프라인 HPLC 분석은 상기 제시된 공정에서 강하게 흡착하는 불순물(S)이 현저히 지연되어 생성물 풀(도 8d)에 더 많은 분획이 포함되어 있음을 확인하였다.
상기 배치 기준 공정 및 상기 제시된 공정(도 9)의 수율-순도 곡선을 플롯팅한 것은 16 g/L의 동일한 초기 로드로, 상기 제시된 공정이 주어진 순도에 대해 더 높은 수율을 제공함을 알 수 있다. 상기 수율-순도 곡선의 개별 점은 분획을 그룹핑하여 얻은 다양한 크기의 풀을 나타낸다.
상기 제시된 공정의 재순환 페이스의 효과를 조사하기 위한 콘티크롬 CUBE 시스템의 작동 파라미터
단계 　 스타트업 리사이클 셧다운
공급물 농도
로드 [g/L] 16.8 - -
개질제 농도
로드 전 평형화 [%B] 10% - 10%
로드 [%B] - - -
로드 후 세척 [%B] 10% - -
구배 시작 [%B] - 10% 10%
구배 종료 [%B] - 50% 50%
세정(스트립) [%B] - 100% 100%
유량
로드 전 평형화 [cm/h] 600 - 500
로딩 [cm/h] 300 - -
로드 후 세척 [cm/h] 300 - -
구배 유량 [cm/h] - 217 300
인-라인 희석 유량 [cm/h] 　 434 -
세정(스트립) [cm/h] - 600 300
재-평형화 [cm/h] - 600 500
유동 부피
로드 전 평형화 [CV] 3 - 3
로드 [CV] 4 - -
로드 후 세척 [CV] 2 - -
구배 지속시간 [CV] 10 10 10
세정(스트립) [CV] 2 2 2
재-평형화 [CV] 4 4 4
실시예 2: 올리고뉴클레오티드 정제의 수치 시뮬레이션
상기 제시된 공정은 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 올리고뉴클레오티드 정제를 위해 시뮬레이션하였다. 시뮬레이션을 위한 공급물 혼합물은 20 mer dsDNA 올리고뉴클레오티드 및 W 및 S 불순물로 구성되었다: P = 2.865 g/L (87.2% pure), W1 = 0.13 g/L, W2 = 0.23 g/L, S1 = 0.08 g/L, S2 = 0.13 g/L. 상기 구배는 도 10 및 11에서 G로 도시된다.
YMC SmartSep Q30으로 패킹된 내경 0.5cm 및 층 높이 10cm의 2개의 칼럼을 사용하였다. 시뮬레이션을 위해, 바이-랭뮤어 흡착 등온선(bi-Langmuir adsorption isotherm)에 기반한 기계적 모델을 사용하여 다양한 구배 기울기 및 로드를 갖는 단일 칼럼 구배 실험 세트(single column gradient experiments)를 이용하여 보정하였다.
도 10a는 업스트림 칼럼의 칼럼 유출구에서 페이스 IC1, B1, IC2 및 B2를 통해 기록된 EP-A-1877769에 따른 일반 MCSGP 공정의 내부 크로마토그램을 도시한다.
마찬가지로, 도 10b 및 도 10c는, 즉 각각의 페이스 IC1, B1, IC2 및 B2를 통해 업스트림 칼럼의 칼럼 유출구에 기록된 n=1(도 10b), n=2(도 10c)에 대한 정제 페이스의 내부 크로마토그램, 즉 1회 또는 2회의 재순환 페이스 각각의 크로마토그램을 보여준다. 도 10a 내지 도 10c의 직사각형 음영 영역은 생성물 수집 간격을 나타낸다. 생성물 수집 윈도우(product collection window) 내에서, n=0(일반 MCSGP 공정, 도 10a)로부터, n=1(재순환 페이스의 1회 반복, 도 10b)을 거쳐서, n=2(재순환 페이스의 2회 반복, 도 10c)까지의 범위에서, 재순환 페이스의 반복이 증가함에 따라, 상기 생성물 수집 윈도우에서 수집된 생성물이 훨씬더 순수해진다는 것을 알 수 있다. 이는 도 10a 내지 도 10c에서 화살표로 표시된 'W' 및 'S' 불순물의 더 나은 제거의 결과이다.
상기 표에서, 조사하는 시뮬레이션 시스템의 작동 파라미터가 주어져 있다.
상기 제시된 공정의 효과를 조사하는 시스템의 파라미터('n.a.' - 적용 불가)
단계 　 제시된 공정 n=1 제시된 공정 n=2 MCSGP
스타트업 절차 B-SU-F
절차 지속시간 [min] 31 31 n.a.
로드 지속시간 [min] 11 11 n.a.
로드 [g/L] 9.3 9.3 n.a.
공급물 유량 [cm/h] 150 150 n.a.
세척 유량 [cm/h] 150 150 n.a.
세척 농도(일정) [%B] 0 0 n.a.
스타트업 절차 B-SU-W
지속시간 [min] 17 17 n.a.
구배 유량 [cm/h] 150 150 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 10.5 10.5 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 40.1 40.1 n.a.
상호 연결된 절차 IC-R
지속시간 [min] 30 30 n.a.
구배 유량 [cm/h] 107 107 n.a.
인-라인 희석 유량 [cm/h] 400 400 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 30 30 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 60 60 n.a.
배치 절차 B-R
지속시간 [min] 0 0 n.a.
세정 유량(S-용리) [cm/h] 0 0 n.a.
구배 유량(W-용리) [cm/h] 0 0 n.a.
상호 연결된 절차 IC1
지속시간 [min] 2.2 2.2 2.2
구배 유량 [cm/h] 150 150 150
인-라인 희석 유량 [cm/h] 409 409 409
구배 시작 농도 [%B] 40.1 41.2 38.0
구배 최종 농도 [%B] 44.0 44.8 41.2
배치 페이스 B1
지속시간 [min] 11.0 11.0 11.0
구배 유량(P-용리) [cm/h] 150 150 150
구배 시작 농도 [%B] 44.0 44.8 41.2
구배 최종 농도 [%B] 63.2 64.0 61.1
공급물 유량 [cm/h] 150 150 150
상호 연결된 페이스 IC2
지속시간 [min] 8.20 8.20 8.20
구배 유량 [cm/h] 107 107 107
인-라인 희석 유량 [cm/h] 400 400 400
구배 시작 농도 [%B] 63.2 64.0 61.1
구배 최종 농도 [%B] 63.2 64.0 61.1
배치 페이스 B2
지속시간 [min] 17.0 17.6 15.7
세정 유량(S-용리) [cm/h] 562 562 562
구배 유량(W-용리) [cm/h] 150 150 150
구배 시작 농도(S-elu.) [%B] 100 100 100
구배 최종 농도(S-elu.) [%B] 100 100 100
구배 시작 농도(W-elu.) [%B] 6 6 6
구배 최종 농도(W-elu.) [%B] 40.1 41.2 38.0
셧다운 페이스 I (IC-R)
지속시간 [min] 30 30 n.a.
구배 유량 [cm/h] 107 107 n.a.
인-라인 희석 유량 [cm/h] 400 400 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 30 30 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 60 60 n.a.
셧다운 페이스 I (IC-B)
지속시간 [min] 0 0 n.a.
세정 유량(S-용리) [cm/h] 0 0 n.a.
구배 유량(W-용리) [cm/h] 0 0 n.a.
셧다운 페이스 II (IC1-SD)
지속시간 [min] 2.2 2.2 n.a.
구배 유량 [cm/h] 150 150 n.a.
인-라인 희석 유량 [cm/h] 409 409 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 40.1 40.1 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 44.0 44.0 n.a.
셧다운 페이스 II (B1-SD)
지속시간 [min] 11.0 11.0 n.a.
구배 유량(P-용리) [cm/h] 150 150 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 44.0 44.0 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 63.2 63.2 n.a.
공급물 유량 [cm/h] 0 0 n.a.
셧다운 페이스 II (IC2-SD)
지속시간 [min] 8.20 8.20 n.a.
구배 유량 [cm/h] 107 107 n.a.
인-라인 희석 유량 [cm/h] 400 400 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 63.2 63.2 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 63.2 63.2 n.a.
셧다운 페이스 II (B2-SD)
지속시간 [min] 17.0 17.0 n.a.
세정 유량(S-용리) [cm/h] 562 562 n.a.
구배 유량(W-용리) [cm/h] 150 150 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 10.5 10.5 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 40.1 40.1 n.a.
셧다운 페이스 II (B1-SD-P)
지속시간 [min] 11.0 11.0 n.a.
구배 유량(P-용리) [cm/h] 150 150 n.a.
구배 시작 농도 [%B] 44.0 44.0 n.a.
구배 최종 농도 [%B] 63.2 63.2 n.a.
셧다운 페이스 II (B1-SD-S)
지속시간 [min] 17.0 17.0 n.a.
세정 유량(S-용리) [cm/h] 562 562 n.a.
구배 시작 농도(S-elu.) [%B] 100 100 n.a.
구배 최종 농도(S-elu.) [%B] 100 100 n.a.
비교를 위해, 도 11a 및 도 11b는 각각 10 cm, 20 cm의 층 높이를 갖는 배치 기준 공정의 크로마토그램을 보여준다.
도 10a 내지 도 10c에서와 같이, 직사각형 형상의 영역은 생성물 수집 간격을 나타내며, 적절히 중첩하는 약하게 흡착하는 불순물의 위치에서는 "W" 점으로 표시된 화살표로 그리고 적절히 중첩하는 강하게 흡착하는 불순물의 위치에서는 "S" 점으로 표시된 화살표로 나타내었다. 생성물 풀은 훨씬 더 적은 양의 불순물(W) 및 (S)를 함유하고 더 많은 재순환 페이스가 사용되는 것을 알 수 있다.
그 결과를 생성물 풀 순도 대 생산성의 측면에서 비교하여 도 12에 나타내었다. 트윈-칼럼 공정 이외에도 단일 칼럼 기준 공정을 시뮬레이션하였다. 상기 단일 칼럼 기준 공정의 경우, 상이한 생성물 및 불순물 함량을 갖는 풀에 해당하는 다양한 크기의 생성물 풀을 시뮬레이션된 크로마토그램으로부터 추출하였고, 따라서 상이한 생산성 및 순도에 해당한다.
비교할만한 생산성으로, 기준 배치 공정(<97.0% 순도)보다 제시된 공정(>97.5% 순도, n=1 및 n=2 모두)으로 훨씬 더 높은 순도를 얻을 수 있음을 알 수 있다. EP-A-1 877 769에 따른 "일반" MCSGP 공정과 비교할 때, 상기 제시된 공정은 더 높은 순도(MCSGP 순도 < 96.0% 순도)를 달성하지만 다소 더 낮은 생산성을 달성한다. 더욱이, 도 12는 재순환 페이스의 시퀀스의 수 n을 증가시킴으로써 생성물 순도는 더 증가될 수 있지만(n=1에 대해 순도 = 97.8%, n=2에 대해 순도 = 98.4%), 이것은 n=2에 대해 생산성의 비용(n=1에 대해 생산성 = 3.4 g/L/h 대 n=2에 대해 생산성 = 2.3 g/L/h)이 든다는 것을 확인한다.
IC1 : 정제 페이스의 제 1 상호 연결된 단계
IC2 : 정제 페이스의 제 2 상호 연결된 단계
IC-R : 셧다운 페이스 I의 재순환 단계의 상호 연결된 단계
IC1-SD : 셧다운 페이스 II의 제 1 상호 연결된 단계
IC2-SD : 셧다운 페이스 II의 제 2 상호 연결된 단계
B1 : 정제 페이스의 제 1 상호 연결된 단계(배치 단계)
B2 : 정제 페이스의 제 2 상호 연결된 단계(배치 단계)
B-R : 재순환 페이스 또는 셧다운 페이스 I의 분리된 단계(배치 단계)
B1-SD : 셧다운 페이스 II의 제 1 분리된 단계(배치 단계)
B2-SD : 셧다운 페이스 II의 제 2 분리된 단계(배치 단계)
B-SU-F : 스타트업 페이스의 분리된 단계(공급 단계)
B-SU-W : 스타트업 페이스의 분리된 단계(W 용리 단계)
B-SD-P : 셧다운 페이스의 분리된 단계(생성물 용리 단계)
B-SD-S : 셧다운 페이스의 분리된 단계(S 용리 단계)
tIC1 : 페이스 IC1의 지속시간
tIC2 : 페이스 IC2의 지속시간
tIC-R : 페이스 IC-R의 지속시간
tB1 : 단계 B1의 지속시간
tB2: 단계 B2의 지속시간
tB-R : 단계 B-R의 지속시간
tB-SU-F : 단계 B-SU-F의 지속시간
tB-SU-W : 단계 B-SU-W의 지속시간
tB-SD-P : 단계 B-SD-P의 지속시간
tB-SD-S : 단계 B-SD-S의 지속시간
P : 생성물
F : W, P 및 S을 함유하는 공급물 혼합물
W : 약하게 흡착하는 불순물
S : 강하게 흡착하는 불순물

Claims (15)

  1. 생성물(P) 및 적어도 2종의 추가 성분 -약하게 흡착하는 불순물(weakly adsorbing impurities; W) 및 강하게 흡착하는 불순물(strongly adsorbing impurities; S)을 나타냄-으로 구성된 공급물 혼합물(feed mixture; F)로부터 생성물(P)의 단리(isolation)를 위한 순환식 크로마토그래피 정제 방법으로서,
    상기 방법은 크로마토그래피 고정상으로서 2개의 크로마토그래피 흡착기 섹션(chromatographic adsorber sections)만을 사용하되, 여기서, 제1 흡착기 섹션(1)은 제1 흡착기 섹션 유입구 및 제1 흡착기 섹션 유출구를 가지며, 제2 흡착기 섹션(2)은 제2 흡착기 섹션 유입구 및 제2 흡착기 섹션 유출구를 갖고,
    상기 방법은 적어도 하나의 재순환 페이스(Recycling Phase) 이후 하나의 정제 페이스(Purification Phase)만을 갖는 적어도 하나의 베이스 시퀀스(base sequence)를 포함하되, 바람직하게는 상기 베이스 시퀀스는 순환식 방식으로 적어도 2회 반복되고,
    상기 재순환 페이스는 적어도 하나의 재순환 시퀀스(recycling sequences)로 구성되되,
    상기 재순환 시퀀스는:
    a. 상호 연결된 재순환 단계(IC-R) - 상기 흡착기 섹션들이 상호 연결되고, 업스트림의 흡착기 섹션 유출구(upstream adsorber section outlet)가 재순환 상호 연결된 기간(recycling interconnected timespan)(tIC-R) 동안 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구(downstream adsorber section inlet)에 연결되며,
    여기서 상기 업스트림의 흡착기 섹션은 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액(eluent)으로 로딩(loading)되고, 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 약하게 흡수하는 불순물(W), 상기 생성물(P), 및 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 강하게 흡수하는 불순물(S)을 함유하는 분획(fraction)이 상기 업스트림의 흡착기 섹션으로부터 상기 다운스트림의 흡착기 섹션으로 용리되고,
    상기 업스트림의 흡수기 유출구를 빠져나오는 스트림(stream)은 상기 다운스트림의 흡수기 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨 - ;
    b. 선택적인 배치 재순환 단계(B-R) - 상기 흡착기 섹션들은 재순환 배치 기간(recycling batch timespan)(tB-R) 동안 분리되고(disconnected), 여기서 선행 단계 a.의 상기 이전 업스트림의 흡착기 섹션(previously upstream adsorber section)을 세정하여 상기 강하게 흡수하는 불순물(S)을 제거하고 재생시키며 용리액을 상기 단계 a.의 상기 이전 다운스트림의 흡착기 섹션의 유입구에 로딩하여 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리시킴 - ;
    를 포함하되,
    각각의 재순환 시퀀스의 단계 a. 및 b. 후에, 상기 흡착기 섹션들은 순서대로 교체(switch)되고, 여기서 상기 재순환 시퀀스의 수가 ≥1이며,
    각각의 재순환 페이스 다음에 하나의 정제 페이스만이 이어지되,
    상기 정제 페이스는:
    c. 제1 상호 연결된 정제 단계(IC1) - 상기 흡착기 섹션들이 상호 연결되되, 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구는 제1 상호 연결된 정제 기간(tIC1) 동안 상기 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구에 연결되고,
    여기서 상기 업스트림의 흡착기는 상기 업스트림의 흡착기 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고, 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 생성물(P)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림의 흡착기로부터 상기 다운스트림의 흡착기 섹션으로 용리되되,
    상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨 - ;
    d. 제1 배치 정제 단계(B1) - 상기 흡착기 섹션들이 제1 배치 정제 기간(tB1) 동안 분리되고 생성물(P)은 상기 이전 업스트림의 흡착기 섹션으로부터 용리되며 공급물 혼합물(F)이 상기 이전 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구에 공급됨 - ;
    e. 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2) - 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구가 제2 상호 연결된 정제 기간(tIC2) 동안 상기 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구에 연결되고,
    여기서 상기 업스트림의 흡착기 섹션은 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고, 생성물(P) 및 강하게 흡착하는 불순물(S)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림의 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기로 용리되되,
    상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구에 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
    f. 제2 배치 정제 단계(B2) - 상기 흡착기들이 제2 정제 배치 기간(tB2) 동안 분리되되 상기 이전 업스트림의 흡착기는 세정되고 재생되며 용리액은 상기 이전 다운스트림의 흡착기 유입구에 로딩됨 - ;
    를 순서대로 포함하되,
    상기 선행 재순환 페이스의 마지막 상호 연결된 재순환 단계의 상기 업스트림의 흡착기 섹션은 상기 다운스트림의 흡착기 섹션의 기능을 수행하고 상기 선행 재순환 페이스의 마지막 상호 연결된 재순환 단계의 다운스트림의 흡착기 섹션은 상기 업스트림의 흡착기 섹션의 기능을 수행하는,
    방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    용리액 구배, 바람직하게는 선형 용리액 구배(linear eluent gradients)는 상기 페이스들 중의 적어도 하나 또는 모두에 사용되되,
    바람직하게는 상기 재순환 페이스 단계들(IC-R 및/또는 B-R)에서 더 높은 구배 기울기(gradient slope)가 상기 정제 페이스 단계들(IC1, B1, IC2 및/또는 B2)에 대해서 더 선택되는,
    방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법의 상호 연결된 단계에서,
    상기 업스트림의 섹션 유입구는 상기 업스트림의 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고,
    상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구에 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림의 흡착기 섹션의 상기 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되는,
    방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법의 정제된 생성물 용리가 없는 배치 단계에서,
    상기 이전 업스트림의 흡착기는, 바람직하게는 상기 선행의 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 또는 상이한 개질제 또는 세정액으로 세정되고 재생되며, 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액은 상기 이전 다운스트림의 흡착기 유입구에 로딩되고/되거나,
    상기 방법의 정제된 생성물 용리가 있는 배치 단계에서, 상기 이전 업스트림의 흡착기는 상기 업스트림의 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되는,
    방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 상호 연결된 재순환 단계(IC-R)의 상기 재순환 페이스에서, 상기 업스트림의 흡착기 섹션은 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고,
    상기 업스트림의 흡착기 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림의 흡착기 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림의 흡착기 섹션의 상기 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고/되거나,
    상기 선택적인 배치 재순환 단계(B-R)에서, 선행 단계 a.의 상기 이전 업스트림의 흡착기 섹션은, 바람직하게는 상기 선행 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로, 또는 상이한 개질제로, 또는 세정 용액으로 세정되고, 재생되며 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액은 단계 a.의 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩되어 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리하는,
    방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 상호 연결된 정제 단계(IC1)에서의 상기 정제 페이스에서, 상기 업스트림의 흡착기 섹션은 상기 업스트림의 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림의 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림의 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고/되거나;
    상기 제1 배치 정제 단계(B1)에서, 생성물(P)이 그의 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩함으로써 용리되고/되거나;
    상기 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2)에서, 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유입구는 상기 업스트림의 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림의 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고/되거나;
    상기 제2 배치 정제 단계(B2)에서, 상기 이전 업스트림의 흡착기는, 바람직하게는 상기 선행의 상호 연결된 재순환 단계의 종료시에서 보다 높은 개질제 농도를 갖는 용리액으로 또는 상이한 개질제으로 또는 세정액으로 세정되고 재생되고, 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액이 상기 이전 다운스트림의 흡착기 유입구에 로딩되는,
    방법.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 개질제는 상기 용리액의 베이스 용매(base solvent) 또는 그들의 혼합물과 상이한 유기 또는 무기 용매 또는 그들의 혼합물, 상기 유기 또는 무기 용매(또는 그들의 혼합물) 중의 전해질로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 용해된 염 또는 pH 또는 그들의 조합으로부터 선택되되,
    바람직하게는 상기 베이스 용매는 물 또는 물과 적어도 하나의 유기 용매의 혼합물 또는 물과 비교하여 적은 비율의 하나 이상의 염 및/또는 유기 용매 하나 또는 둘 다의 혼합물 중의 물이며,
    더욱 바람직하게는, 상기 개질제는 유기 용매 또는 적어도 하나의 유기 용매의 농도가 상기 베이스 용매 보다 높은 상기 적어도 하나의 유기 용매와 물의 혼합물, 물 또는 상기 베이스 용매 보다 상이한 염 또는 H+ 농도를 갖는 적어도 하나의 유기 용매와 물의 혼합물인,
    방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    바람직하게는 선형, 용리액 구배가 상기 페이스들 중 적어도 하나 또는 모두에서 일시적으로 변화하는 개질제 농도 증가의 형태의 구배로 사용되는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계를 수행하기 전에, 스타트-업 페이스(Start-up Phase)가 수행되되, 여기서
    상기 흡착기들(1,2)은 제1 배치 스타트-업 기간(tB-SU-F) 동안 분리되고
    공급물 혼합물(F)은 상기 제1 재순환 페이스의 상기 제1 상호 연결된 재순환 단계의 상기 업스트림의 흡착기 섹션이 되도록 상기 흡착기 섹션(1)의 유입구에 공급되는 한편,
    상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계의 상기 다운스트림의 흡착기 섹션이 되는 상기 흡착기 섹션(2)은 평형화되고 있거나 또는 이미 평형화되고 불활성(inactive)이며,
    바람직하게는 후속적으로, 상기 흡착기들(1,2)은 제2 배치 스타트-업 기간(tB-SU-W) 동안 분리되고, 약하게 흡착하는 불순물(W)이 다른 흡착기(2)가 평형화되고 있거나 또는 이미 평형화되고 불활성인 동안 상기 선행 제1 배치 스타트-업 단계에서 공급물 혼합물(F)이 공급된 상기 흡착기 섹션(1)으로부터 용리되는,
    방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 제1 배치 스타트-업 기간(tB-SU-F) 후에 및 상기 제2 배치 스타트-업 기간(tB-SU-W) 전에, 용리액이 상기 제1 재순환 페이스의 제1 상호 연결된 재순환 단계의 상기 업스트림 흡착기 섹션이 되도록 상기 흡착기 섹션의 유입구에 공급되고, 상기 용리액은 개질제가 없거나 또는 상기 제1 배치 스타트-업 기간 동안 또는 상기 제1 상호 연결된 재순환 단계의 제2 배치 스타트-업 기간의 부재 시에 적용되는 출발 개질제 농도에 본질적으로 대응하는 개질제 농도를 갖고/갖거나;
    상기 제2 배치 스타트-업 기간 동안 공급물 혼합물(F)이 공급된 상기 흡착기 섹션(1)의 유입구에는 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되는,
    방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 베이스 시퀀스, 바람직하게는 하나 초과의 베이스 시퀀스의 종결 후에, 셧다운 페이스가 수행되되, 상기 셧다운 페이스는 하기 단계들:
    a'. 상기 선행 및 마지막 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2)의 상기 업스트림 흡착기 섹션이 상기 다운스트림 위치를 취하고 상기 다른 흡착기 섹션은 상기 업스트림 위치를 취하되, 상기 흡착기 섹션은 상호 연결되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구는 셧다운 재순환 상호 연결된 기간(tIC'-R-SD) 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되는, 상호 연결된 셧다운 재순환 단계(IC'-R),
    여기서 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 약하게 흡착하는 불순물(W), 상기 생성물(P), 및 적어도 생성물(P)과 중첩될 때까지 상기 강하게 흡착하는 불순물(S)을 함유하는 분획은 상기 업스트림 흡착기 섹션으로부터 상기 다운스트림 흡착기 섹션으로 용리되며,
    상기 업스트림 흡착기 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
    b'. 상기 흡착기 섹션이 분리되되, 상기 흡착기 섹션은 셧다운 재순환 배치 기간(tB'-R) 동안 분리되는, 선택적 배치 셧다운 재순환 단계(B'-R);
    여기서 선행 단계 a'.의 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션이 세정되고 재생되며, 용리액은 단계 a의 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩되어 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리시킴;
    를 순서대로 포함하되,
    이어서 하기 단계들:
    c'. 상기 흡착기 섹션이 상호 연결되되, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구는 제1 상호 연결된 셧다운 정제 기간(tIC1') 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되는, 제1 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC1-SD),
    여기서 상기 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고 약하게 흡착하는 불순물(W) 및 생성물(P)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기 섹션으로 용리되고,
    상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
    d'. 상기 흡착기 섹션이 제1 배치 정제 기간(tB1') 동안 분리되고 생성물(P)은 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션으로부터 용리되고 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션은 유휴 상태(idle)이거나 또는 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기에 공급되는, 제1 배치 셧다운 정제 단계(B1-SD);
    e'. 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구가 제2 상호 연결된 셧다운 정제 기간(tIC2') 동안 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구에 연결되는, 제2 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC2-SD),
    여기서 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 용리액으로 로딩되고 생성물(P) 및 강하게 흡착하는 불순물(S)을 중첩으로 함유하는 생성물 분획은 상기 업스트림 흡착기로부터 상기 다운스트림 흡착기로 용리되고,
    상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 인라인으로 희석됨;
    f'. 상기 흡착기가 제2 정제 배치 기간(tB2') 동안 분리되고 상기 이전 업스트림 흡착기는 세정되고 재생되며 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩되는, 제2 배치 셧다운 정제 단계(B2-SD);
    가 순서대로 이어지되,
    상기 상호 연결된 셧다운 재순환 단계의 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 다운스트림 흡착기 섹션의 기능을 취하고 상기 상호 연결된 셧다운 재순환 단계의 상기 다운스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션의 기능을 취하며,
    이어서 하기 단계들:
    g'. 상기 제1 및 제2 흡착기가 제1 최종 셧다운 배치 기간(tB-SD-P) 동안 분리되고 생성물(P)은 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리되고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생되는, 제1 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-P);
    h'. 선택적이지만 바람직하게는, 상기 제1 및 제2 흡착기가 제2 최종 셧다운 배치 기간(tB-SD-S) 동안 분리되고 강하게 흡착하는 불순물(S)은 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리되고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생되는, 제2 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-S);
    가 순서대로 이어지는,
    방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 상호 연결된 셧다운 재순환 단계(IC'-R)에서, 상기 선행 및 마지막 제2 상호 연결된 정제 단계(IC2)의 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 일정한 조성 또는 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되되, 상기 업스트림 흡착기 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고/되거나;
    상기 배치 셧다운 재순환 단계(B'-R)에서, 선행 단계 a.의 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션은 세정되고 재생되며 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액이 단계 a'.의 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션의 유입구에 로딩되어 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 약하게 흡착하는 불순물(W)을 용리하고/하거나;
    상기 제1 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC1-SD)에서, 상기 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고/되거나;
    상기 제1 배치 셧다운 정제 단계(B1-SD)에서, 생성물(P)은 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩함으로써 상기 이전 업스트림 흡착기 섹션으로부터 용리되고, 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션은 유휴 상태이거나 또는 용리액이 상기 이전 다운스트림 흡착기 섹션 유입구, 바람직하게는 상기 베이스 용매의 형태의 용리액에 공급되고/되거나;
    상기 제2 상호 연결된 셧다운 정제 단계(IC2-SD)에서, 상기 업스트림 흡착기 섹션은 상기 업스트림 흡착기 섹션 유입구를 통해 일정한 조성 또는 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩될 수 있고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 상기 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고/되거나;
    상기 제2 배치 셧다운 정제 단계(B2-SD)에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 세정되고 재생되며 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩되고/되거나;
    상기 제1 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-P)에서, 생성물(P)은 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리되고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 재생되고/되거나;
    상기 제1 최종 및 제2 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-S)에서, 강하게 흡착하는 불순물(S)은 상기 이전 다운스트림 흡착기로부터 용리되고 상기 다른 흡착기는 유휴 상태이거나 또는 재생되는,
    방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상이한 기울기 및/또는 유량을 갖는 선형 구배가 상기 재순환 페이스 및/또는 상기 정제 페이스에 사용되는, 방법.
  14. 제 2 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법의 대부분 또는 모든 상호 연결된 단계에서, 상기 업스트림 섹션 유입구는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고, 상기 업스트림 흡착기 섹션 유출구를 빠져나오는 상기 스트림은 상기 다운스트림 흡착기 섹션 유입구로 들어가기 전에 개질제 없이 또는 업스트림 흡착기 섹션의 유입구에서 보다 상이한 개질제 농도를 갖는 용리액으로 인라인으로 희석되고,
    여기서
    정제된 생성물 용리가 없는 상기 방법의 배치 단계에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 용리액으로 세정되고 재생되며, 적용 가능한 경우, 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액은 상기 이전 다운스트림 흡착기 유입구에 로딩되거나,
    또는 정제된 생성물 용리가 있는 상기 방법의 배치 단계에서, 상기 이전 업스트림 흡착기는 상기 업스트림 흡착기 유입구를 통해 일시적으로 변화하는 개질제 농도의 형태로 구배를 갖는 용리액으로 로딩되고,
    상기 개질제는 상기 용리액의 베이스 용매 또는 그들의 혼합물과 상이한 용매 또는 그들의 혼합물, 상기 용매 또는 그들의 혼합물 중의 전해질로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 용해된 염 또는 pH 또는 그들의 조합으로부터 선택되되, 바람직하게는 상기 베이스 용매는 물 또는 물과 적어도 하나의 유기 용매의 혼합물 또는 물과 비교하여 적은 비율의 하나 이상의 염 및/또는 유기 용매의 혼합물 중의 물이며, 여기서 더욱 바람직하게는, 상기 개질제는 유기 용매 또는 물과 상기 베이스 용매 보다 높은 농도의 상기 적어도 하나의 유기 용매를 갖는 적어도 하나의 유기 용매의 혼합물, 물 또는 물과 상기 베이스 용매 보다 상이한 염 또는 H+ 농도를 갖는 것의 혼합물이고,
    상기 개질제 농도는 하기 단계들:
    하기 최종 셧다운 배치 단계(B-SD-P)의 경우를 제외한, 재순환(IC-R, IC'-R, IC1, IC1-SD) 및
    적용 가능한 경우, 생성물 용리(B1, B1-SD, B-SD-P) 및,
    적용 가능한 경우, 추가 재순환(IC2, IC2-SD) - 상기 재순환(IC2, IC2-SD) 동안, 상기 개질제 농도는 변경될 수 있거나 또는 상기 재순환(IC2, IC2-SD)에서만 일정하게 유지될 수 있음 - ,
    에 걸쳐서 생성물(P)과 중첩되지 않을 때까지 상기 약하게 흡착하는 불순물(W)의 용리(B-SU-W, B-R, B'-R, B2, B2-SD)의 시작 시 최저 농도로부터 상기 강하게 흡착된 불순물(S)의 상기 용리(B-R, B'-R, B2, B2-SD, B-SD-S)의 시작 전에 최고 농도로 상기 공정에서 증가되고, 바람직하게는 선형으로 증가되는,
    방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 따르는 방법의 용도로서,
    바람직하게는 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자; 항체를 포함한 단백질; 펩티드, 탄수화물, 지질뿐만 아니라 그들의 조합물 및 변형물 및 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 천연 또는 합성 기원의 생체 분자의 정제를 위한 것인, 용도.
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