CN107311866B - 用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，分离步骤为：使II区内部液相的洗脱能力强于III区内部液相的洗脱能力，从而将EPA酯、DHA酯和中杂截留在II区和III区内部，而前杂跟随液相前移而从萃余液出口流出，后杂跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出；调整流入II区和III区的液相流量和组成，或者调整切换时间，使中杂仍被截留在系统内，而EPA酯跟随液相前移而从萃余液出口流出，DHA酯跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出；将截留在模拟移动床内部的目标组分冲洗出模拟移动床进行回收。本发明的模拟移动床色谱分离系统能够从一次性从酯型鱼油中分离出EPA酯和DHA酯，从而节约能耗，降低生产成本。

Description

用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯 酸酯的方法

技术领域

本发明涉及一种用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸(EPA)酯和二十二碳六烯酸(DHA)酯的方法。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是存在于深海鱼油中的两种重要活性物质，对人体健康有着多种生理功效。例如，EPA能够抑制血栓的形成，降低甘油三酯，从而避免心脑血管疾病的发生；DHA则能促使脑细胞突起再度延伸，提高脑细胞间的信息传递能力，故可促进婴幼儿大脑发育，亦可预防老年性痴呆。

鱼油中的EPA和DHA主要以甘油酯的形式，一般先对鱼油进行甲酯化或乙酯化处理，将其中EPA和DHA的甘油酯转化为EPA和DHA的甲酯或乙酯，然后再分离纯化。目前已报道了多种从酯型鱼油中富集EPA和DHA甲酯或乙酯的工艺技术，如分子蒸馏、尿素包合、低温结晶、萃取等，但这类初级分离方法所得EPA和DHA的纯度有限，故还需进一步精制方能制得高纯EPA和DHA。

综合文献报道，制备高纯EPA酯和高纯DHA酯的方法有硝酸银涂敷硅胶层析法、阴离子交换树脂层析法、高效液相色谱法和超临界色谱法等。但这些方法属间歇操作，有机溶剂消耗大，而固定相利用率低，为克服这些缺点，巴斯夫公司开发了模拟移动床色谱连续分离EPA酯和DHA酯的工艺，这种工艺循环使用洗脱剂，故溶剂消耗少，且固定相利用率高，因而能够降低生产成本。

酯型鱼油中，除了EPA酯和DHA酯外，还含有其它至少三种组分，如按反相C18 硅胶色谱柱上的出峰顺序分类，这些组分可分为：前杂，即比EPA酯出峰早的组分；中杂，即出峰介于EPA酯和DHA酯之间的组分；后杂，即比DHA酯出峰晚的组分。而常规模拟移动床一次只能将一个混合物分成两个馏分，故共需4次模拟移动床操作才能酯型鱼油中制得EPA酯和DHA酯。例如，一次SMB操作将酯型鱼油分成两个馏分：馏分 1含EPA酯和前杂，馏分2含中杂、DHA酯和后杂；然后再分别经一次和二次SMB操作分离出EPA酯和DHA酯，这无疑使得SMB分离纯化工艺较为复杂，同时还增加了设备成本和溶剂消耗，有必要开发更为实用、合理的分离工艺。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种更加简化、设备成本低和溶剂消耗量少的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸(EPA)酯和二十二碳六烯酸(DHA)酯的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：一种用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法：采用的模拟移动床色谱由I区、II区和III区构成，每个区均由一根以上的色谱柱串联而成；I区位于洗脱液入口与萃取液出口之间，II区位于萃取液出口与进料口之间，III区位于进料口与萃余液出口之间；

(1)去除前杂和后杂：配制溶液1和溶液2，其中溶液2中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于溶液1中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量，然后将原料溶于溶液1配制成原料液；分别将原料液从进料口、溶液2从洗脱液入口流入模拟移动床；进料一段时间后，用溶液1替换原料液从进料口流入模拟移动床，溶液2仍然从洗脱液入口流入模拟移动床，与此同时，分别从萃余液出口收集前杂，从萃取液出口收集后杂；

(2)回收EPA酯和DHA酯：调整流入II区和III区的液相流量和组成，或者调整切换时间，使中杂仍被截留在系统内，而EPA酯跟随液相前移而从萃余液出口流出， DHA酯跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出；

(3)回收中杂：将截留在模拟移动床内部的目标组分冲洗出模拟移动床进行回收。

本发明上述的前杂，即比EPA酯出峰早的组分；中杂，即出峰介于EPA酯和DHA 酯之间的组分；后杂，即比DHA酯出峰晚的组分。

溶剂相对于待测组分的溶解能力强的话,更容易将吸附在固定相上的待测组分溶解并带走，加快了待测组分在色谱柱中的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程,也就使待测组分能更快流出,这在色谱分析中被称为溶剂的洗脱能力强。

本发明溶液2中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于溶液1中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量；其中构成溶液1和2的成分或组分可以相同，而溶液2中强洗脱能力的组分体积百分比含量高于溶液1中强洗脱能力的组分体积百分比含量。

本发明步骤(1)中II区内部液相的洗脱能力强于III区内部液相的洗脱能力，使得II区内部的EPA酯和DHA酯跟随液相前移，而III区内部的EPA酯、DHA酯和中杂(先于DHA酯但后于EPA酯出峰的物质)则跟随柱子切换往II区逆向移动，这三个组分由此而被截留在II区和III区内部并逐步积累，与此同时，II区和III区内部的前杂(先于 EPA酯出峰的物质)则跟随液相前移而从萃余液出口流出，III区和II区内部的后杂(后于DHA酯出峰的物质)则跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出。

上述步骤(1)～(3)步骤完成后，重新开始第二批次的分离，即进料—纯化—回收—进料—纯化—回收，如此轮回操作。

上述分离方法的要点在于步骤(1)和步骤(2)中，使II区液相的洗脱能力强于III区液相的洗脱能力，只有这样才能够有选择地使相应的分离组分在II区内部的迁移速率大于其在III区内部的迁移速率，然后选择合适的切换时间，使相关组分在II区跟随液相前进，而在III区则跟随柱子切换后退，从而将相关组分截留在系统内。例如，在步骤 (1)中，DHA酯、EPA酯和中杂全部被截留在系统内；在步骤(2)中，仅将中杂截留，DHA 酯和EPA酯则分别从萃取口和萃余口流出系统。而在常规模拟移动床的常规分离方法中，因II区和III区内部液相的洗脱能力相同，故所有分离组分在II区的迁移速率必定小于其在III区的迁移速率，这无法将相关组分截留在II区和III区内部。

本发明上述分离方法所采用的模拟移动床色谱，每隔一定时间，洗脱液入口和进料口均沿液体流动方向切换至下一根柱子入口，而萃余液出口和萃取液出口沿液体流动方向切换至下一根柱子出口。

根据上述分析，只要能够使II区液相洗脱能力比III区液相洗脱能力强，就能将目标组分截留在II区和III区内部，从而与其他组分分离。因此，本发明还可以将上述模拟移动床的I区与II区断开，其他结构不变，同样可以采用上述分离方法；此时，将溶液2从II区入口直接流入模拟移动床，使II区内部液相的洗脱能力强于III区内部液相的洗脱能力；用另外一个溶液3从洗脱液入口流入模拟移动床，并将I区流出液全部收集为萃取液；其它操作同上述I区与II区未断开的模拟移动床色谱分离方法，也可实现一次分离三组分混合物的目的。

本发明上述溶液3的组成并无严格要求，只要能够将I区内部的溶质冲洗完全即可。

在上述分离方法步骤(1)中，随着原料液的加入，DHA酯、中杂和EPA酯必然在 II区和III区内部不断积累，最终II区和III区内部的色谱柱会达到吸附饱和，以至于目标组分从萃余液中泄漏，此时色谱柱利用率达到最大，如果继续进料，并不能增加色谱柱的利用率，反而只是浪费时间和动力；反过来，如II区和III区内部色谱柱尚未达到饱和即停止进料，则未能充分利用色谱柱。故应尽可能让II区和III区内部的色谱柱刚好达到吸附饱和，这可通过检测萃余液出口组成来予以判断，此时目标组分刚好开始从萃余液中泄露。因此，作为优选，当目标组分在II区和III区内部不断积累，直到色谱柱吸附饱和以至于目标组分刚开始从萃余液中泄漏时，用溶液1替换进料液。

在上述分离方法步骤(1)的纯化操作中，随着前杂不断流出III区和后杂不断地流出II区，II区和III区内部的DHA和EPA被不断纯化。作为优选，当前杂和后杂都去除干净，直到萃余液中的前杂和萃取液中的后杂含量都为0时，停止步骤(1)操作，这十分有利于接下来的回收操作----步骤(2)。

当前杂和后杂都被去除后，开始步骤(2)回收DHA酯和EPA酯。此时可以采用多种方案：先回收DHA酯，再回收EPA酯；或先回收EPA酯，再回收DHA酯；或同时回收DHA酯和EPA酯。无论采用何种方案，均保证中杂仍被截留在系统内而不流出，这可通过调整切换时间、II区和III区流量等措施来实现。当DHA酯和EPA酯的回收率达到要求后，转入步骤(3)。

步骤(3)的主要目的是回收中杂，并为下一批次分离作准备，最简单的方法是依次单独冲洗各根柱子。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明采用三区结构的模拟移动床从含有五种及以上组分的酯型鱼油中同时分离出EPA酯和DHA酯，采用II区内部液相的洗脱能力强于III区内部液相的洗脱能力这一措施，使EPA酯和DHA酯以及中杂在II区内部跟随液相往III区移动，而在III区内部则跟随柱子切换往II区逆向移动，从而能够将EPA酯和DHA酯截留在II区和III区内部，然后调整操作条件有选择地释放出EPA酯和DHA酯，实现使用模拟移动床一次性分离出两种目标组分的目的，且节省溶剂和设备消耗，降低了成本。

2.本发明的方法也可如附图2所示，将模拟移动床的I区与II区断开，洗脱液2直接从II区入口流入模拟移动床，而用另一个可将I区内部的溶质洗脱完全的溶液冲洗I 区，并将I区流出液全部收集为萃取液。

3.本发明的方法分离对象相当于一个五元混合物(A+B+C+D+E)；其先将(B+C+D)截留在系统内而分离出前杂A和后杂E，然后通过改变操作条件，使目标物B和D分别从萃余和萃取口流出，而中杂C则仍留在系统内，最后回收中杂，重新开始下一轮操作；相较于传统分离三元混合物(A+B+E)，采用的先将B截留在系统内而分离出前杂A和后杂E，然后将目标物B回收的方法完全不同；本申请需要分离的组分更加复杂，具体实现分离获得目标组分采用的技术方案也相较于传统三组分分离的方法更具有创造性。

附图说明

图1为本发明采用三个区的模拟移动床色谱同步DHA酯和EPA酯的工艺流程示意图。

图2为本发明采用三个区的模拟移动床色谱，且I区与II区断开的同步分离DHA 酯和EPA酯的工艺流程示意图。

图3为传统模拟移动床设备结构示意图。

如图1至3所示：1-洗脱液入口，2-萃取液出口，3-进料口(原料液进口或溶液1进口)，4-萃余液出口，5-II区入口。

具体实施方式

下面详细说明本发明的技术方案。酯型鱼油购自北京创新通恒科技有限公司。在反相硅胶柱上，出峰顺序依次为前杂、EPA酯、中杂、DHA酯和后杂，用本发明提出的模拟移动床分离方法从酯型鱼油中分离出EPA酯和DHA酯。

色谱柱装填C18硅胶，流动相选用乙醇、甲醇或乙腈的水溶液；原料为混合多不饱和脂肪酸甲酯或混合多不饱和酸乙酯，其中EPA酯和DHA酯的总质量分数1％～30％。

1.模拟移动床色谱分离系统

模拟移动床色谱分离系统为德国Knauer公司产CSP9116，包括洗脱液泵P1、II区内部循环泵P2、进料泵P3和IV区内部循环泵P4和色谱柱。如图3所示，II区和IV区内部流量分别由II区和IV区内部的循环泵P2和P4控制，而I区流量则由IV区内部循环泵P4与洗脱液泵P1共同控制，III区内部流量由II区内部循环泵P2和进料泵P3共同控制，操作温度35℃。每隔一定时间，洗脱液入口和进料口均沿液体流动方向切换至下一根柱子入口，而萃余液出口和萃取液出口沿液体流动方向移动至下一根柱子出口。该分离系统采取适当措施，可实现本发明提出的从酯型鱼油中分离EPA酯和DHA酯的模拟移动床分离方法，例如关闭IV区内部循环泵，即可实现图1或图2所示的相当于三个区模拟移动床的分离方法。

2.分离步骤

1)去除前杂和后杂：用不同比例的甲醇和水配制溶液1和溶液2(溶液2中具有强洗脱能力的甲醇的体积百分比高于溶液1中甲醇的体积百分比)，将原料溶于溶液1配制成原料液，然后将原料液和溶液2分别从进料口3和洗脱液入口1流入模拟移动床，与此同时，从萃余液出口4收集前杂，从萃取液出口2收集后杂，当萃余液中刚开始出现目标组分时，停止进料，并将原料液换成溶液1从进料口流入模拟移动床，溶液2仍从洗脱液入口流入模拟移动床，与此同时，分别从萃余液出口4收集前杂、萃取液出口 2收集后杂，当模拟移动床内部的前杂和后杂全部去除干净直到萃余液和萃取液中的前杂和后杂含量均为0时，停止去除前杂和后杂的操作；

2)回收EPA酯和DHA酯：调整II区和III区的流量或切换时间，使中杂仍被截留在系统内，EPA酯跟随液相前移而从萃余液出口流出，DHA酯跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出。

3)回收中杂：将截留在模拟移动床内部的目标组分冲洗出模拟移动床进行回收。

上述步骤1～3完成后，重新开始第二批次的分离，即去除前、后杂--回收EPA和DHA-- 回收中杂--去除前、后杂--回收EPA和DHA--回收中杂，如此轮回操作。

3.成品检验

高效液相色谱分析产品纯度。高效液相色谱系统组成：Knauer K501泵，AgilentTC-C18柱(4.6×150mm，5μm)，Knauer K2501检测器；液相色谱分析条件：流动相为甲醇/水(体积比90/10)，流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温：30℃。

下面通过具体实施例对本发明给予进一步说明。实施例中，模拟移动床色谱使用的色谱柱直径1cm，长度10cm，填料为日本富士公司产C18硅胶，粒径10～20μm。分别配制两种溶液，其中溶液1为甲醇/水(体积比88/12)，溶液2为甲醇/水(体积比95/5)，溶液3为纯甲醇。将酯型鱼油溶于溶液1至饱和，制得浓度约25mg/mL的原料液。

实施例1(见图1所示)

I区、II区、III区各安排2根柱子。并停用如图3所示的传统模拟移动床设备的IV区循环泵P4(相当于IV区不使用，仅为具有三个区的开环模拟移动床)。

步骤1—去除前杂和后杂进料：将原料液和溶液2分别以1mL/min和4mL/min的流量从进料口3和洗脱液入口1同时泵入模拟移动床分离系统；II区流量控制为3mL/min，每隔5分钟，洗脱液入口1和进料口3均沿液体流动方向切换至下一根柱子入口，而萃余液出口4和萃取液出口2沿液体流动方向移动至下一根柱子出口。分别用高效液相色谱分析萃余液和萃取液组成，结果表明萃余液和萃取液中分别含有前杂和后杂，但均不含EPA酯和DHA酯以及中杂，表明这三个组分已被有效地截留在系统的II区和III区内部。当运行17次切换(即85分钟)后，萃余液中开始有目标组分流出，表明色谱柱已达到吸附饱和，此时停止进料，将原料液换为溶液1，流速仍为1mL/min，其余条件不变，分别用高效液相色谱分析萃余液和萃取液组成，发现到第22次切换时(即110分钟)，萃余液和萃取液中前杂和后杂含量为0，表明前杂和后杂已去除完全。

步骤2----回收DHA和EPA：将切换时间缩短至4分钟，并将溶液1的流量从1mL/min降至0.3mL/min。分别用高效液相色谱分析萃取液和萃余液组成，经8次切换(即40分钟)即可将截留在II区和III区内部的DHA酯和EPA酯分别从萃取液和萃余液中回收。液相分析结果显示，萃取液和萃余液中的DHA酯和EPA酯纯度按面积归一法计算，分别为99.8％和99.9％。

步骤3----回收中杂：停止泵3和泵2，溶液2经泵1流入I区，流量5mL/min，切换时间2min，依次回收各根柱内的中杂，再生色谱柱。

色谱柱再生完毕后，重新开始步骤1--步骤2--步骤3，如此轮回操作。

实施例2(见图2所示)

采用实施例1中的模拟移动床，但断开其中的I区和II区，将溶液2通过II区入口 5直接流入II区，而用纯甲醇冲洗I区，并将I区流出液全部收集为萃取液。其余操作条件与操作步骤与实施例1相同。实验结果表明，产品分离纯度不变化。

以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：采用的模拟移动床色谱由I区、II区和III区依次串联构成，每个区均由一根以上的色谱柱串联而成；I区位于洗脱液入口与萃取液出口之间，II区位于萃取液出口与进料口之间，III区位于进料口与萃余液出口之间；

(1)去除前杂和后杂：配制溶液1和溶液2，其中溶液2中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于溶液1中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量，然后将原料溶于溶液1配制成原料液；分别将原料液从进料口、溶液2从洗脱液入口流入模拟移动床；进料一段时间后，用溶液1替换原料液从进料口流入模拟移动床，溶液2仍然从洗脱液入口流入模拟移动床，与此同时，分别从萃余液出口收集前杂，从萃取液出口收集后杂；

(2)回收EPA酯和DHA酯：调整流入II区和III区的液相流量和组成，或者调整切换时间，使中杂仍被截留在系统内，而EPA酯跟随液相前移而从萃余液出口流出，DHA酯跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出；

(3)回收中杂：将截留在模拟移动床内部的目标组分冲洗出模拟移动床进行回收；

步骤(1)中II区内部液相的洗脱能力强于III区内部液相的洗脱 能力，使II区内部的EPA酯和DHA酯跟随液相前移，而III区内部的EPA酯、DHA酯和中杂则跟随柱子切换往II区逆向移动，这三个组分由此而被截留在II区和III区内部并逐步积累；与此同时，II区和III区内部的前杂则跟随液相前移而从萃余液出口流出，III区和II区内部的后杂则跟随柱子切换后退而从萃取液出口流出；

所述的前杂，即比EPA酯出峰早的组分；中杂，即出峰介于EPA酯和 DHA酯之间的组分；后杂，即比DHA酯出峰晚的组分；

所述的溶液2中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量高于溶液1中具有强洗脱能力的溶剂的体积百分含量，其中溶液1为体积比88/12的甲醇/水，其中溶液2为体积比为95/5的甲醇/水。

2.根据权利要求1所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：所述的步骤(1)～(3)步骤完成后，重新开始第二批次的分离，即进料去除前杂和后杂—纯化回收EPA酯和DHA酯—回收中杂—进料去除前杂和后杂—纯化回收EPA酯和DHA酯—回收中杂，如此轮回操作。

3.根据权利要求1所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：所采用的模拟移动床色谱，每隔一定时间，洗脱液入口和进料口均沿液体流动方向切换至下一根柱子入口，而萃余液出口和萃取液出口沿液体流动方向切换至下一根柱子出口。

4.根据权利要求1所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：所采用的模拟移动床色谱I区与II区断开、II区与III区连接，其它结构不变；此时， 将溶液2从II区入口直接流入模拟移动床，使II区内部液相的洗脱能力强于III区内部液相 的洗脱能力；用溶液3从洗脱液入口流入模拟移动床，并将I区流出液全部收集为萃取液；其 它操作同I区与II区未断开的模拟移动床色谱分离方法。

5.根据权利要求4所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：所述溶液3为能够将I区内部的溶质冲洗完全即可。

6.根据权利要求1或4所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：所述的在去除前杂和后杂阶段，当目标组分在II区和III区内部不断积累直到色谱柱吸附饱和以至于目标组分刚开始从萃余液中泄漏时，将原料液更换成溶液1；

或

在去除前杂和后杂阶段，当目标组分在II区和III区内部色谱柱上尚未达到饱和时，将原料液更换成溶液1；

在去除前杂和后杂阶段，当目标组分在II区和III区内部色谱柱上已经过饱和时，将原料液更换成溶液1。

7.根据权利要求6所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：当前杂和后杂都去除干净，直到萃余液中的前杂和萃取液中的后杂含量都为0时，停止步骤(1)操作。

8.根据权利要求7所述的用模拟移动床色谱分离纯化二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于：当前杂和后杂都被去除后，开始步骤(2)回收DHA酯和EPA酯，采用的方案：先回收DHA酯，再回收EPA酯；或先回收EPA酯，再回收DHA酯；或同时回收DHA酯和EPA酯；当模拟移动床内部EPA酯和DHA酯全部流出系统时，停止操作；步骤(3)回收中杂，并为下一批次分离作准备，采用依次单独冲洗各根柱子的方式。

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