JPH10507355A

JPH10507355A - シクロスポリンａの製造方法

Info

Publication number: JPH10507355A
Application number: JP8513109A
Authority: JP
Inventors: キム，ジュング，ウー; チョイ，ナム，ヘー; リー，サング，チュル; チョイ，ガング，スン; ハム，ユン，ベオム; リー，ドン，ワ; ミン，キェオング，ボク
Original assignee: チョングクンダングシーオウアールピー．
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 1998-07-21
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: EP0801686A1; KR100304324B1; US5874572A; JP2980689B2; KR960014356A; WO1996012031A1; EP0801686B1; AU3121895A

Abstract

(57)【要約】本発明によれば、トリポクラジウムインフラチュム（Tolypocladium inflatum）の変異株の培養液に低ルカノール溶媒を加えてこの混合物を抽出する工程；その抽出液を低級ハロゲン化炭化水素の溶媒に移す工程；必要ならば、得られた溶液を活性炭処理する工程；およびシリカゲルのクロマトグラフィにかける工程からなる、シクロスポリンＡの製造方法が提供される。本発明の方法は従来技術に比べ、培養液をろ過せずに直接溶媒抽出し、乾燥処理が省略され、クロマトグラフィ工程がシリカゲルを使用する単一工程に単純化されるので、工程の経済性および環境保護の側面から有利である。

Description

【発明の詳細な説明】シクロスポリンＡの製造方法技術分野本発明は、下記の構造式（I）で示されるシクロスポリンＡを製造する新規の方法に関するものである。前記構造式のシクロスポリンＡは、11個のアミノ酸からなる、分子量1202、分子式C₆₂H₁₁₁N₁₁O₁₂の環式ペプチドであり、シクロスポリンＡを生産する菌株であるトリポクラジウムインフラチュム（Tolypocladium inflatum）の培養液から得られる。アミノ酸の種類により25個のシクロスポリンＡの誘導体がある[Tra ber R.，HELVETICA ACTA，70，13(1987)]。シクロスポリンＡの化学名は、シクロ［｛(E)-(2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-4- メチル-2-(メチルアミノ)-6-オクテノイル｝-L-2-アミノブチリル-N-メチル-グリシル-N-メチル-L-ロイシル-L-バリル-N-メチル-L-ロイシル-L-アラニル-O-アラニル-N-メチル-L-ロイシル-N-メチル-L-ロイシル-N-メチル-L-バリル］である。シクロスポリンＡは、非常に強い免疫抑制効果を示すため、移植組織に対する免疫反応の症状の抑制および自己免疫症の治療に用いられている。また、抗真菌、殺菌および抗炎症効果も有することも知られている[Borel J．F.，Pr og．Allergy，38，9(1986)]。背景技術シクロスポリンＡを製造する方法に関する先行技術として、カビ菌の種であるシンリンドロカルボンルシジル（Cylindrocarpon lucidum）およびトリポクラジウムインフラチュム（Tolypocladium inflatum）による発酵を用いる方法が、英国特許第1,491,509号と、米国特許第4,117,118号と、米国特許第4,215,199 号に記載されている。また、これら特許には培養液からシクロスポリンＡを回収するための各種の方法が開示されている。前記特許において、先ず培養液から単離される菌糸体を溶媒抽出してから、抽出物をセファデックス(Sephadex)、酸化アルミニウムおよびシリカゲル等のクロマトグラフィ媒体を順次に使用して回収する方法が、培養液からシクロスポリンＡを回収するための方法として用いられている。これらの方法によれば、培養液をろ過することにより得られた単離固体物である菌糸体に溶媒を加え；この混合物を遠心抽出機により溶媒抽出し；得られた抽出物を水またはヘキサン等を用いて前処理し；セファデックス、酸化アルミニウムおよびシリカゲル等のクロマトグラフィ媒体により精製してシクロスポリンＡを得る。しかし、この工程は、培養液をろ過することにより得られた単離固体物である菌糸体を溶媒抽出して、セファデックスを含めて２または３種のクロマトグラフィ媒体を使用するので、複雑である。さらに、この工程は、各々のクロマトグラフィ媒体処理に別途の展開溶媒を使用しなければならないので、工程経済上の問題および環境問題を招くおそれがある。従って、このような工程の複雑さを克服するためおよび経済的な負担を軽減するために、シクロスポリンＡの様々な精製方法が研究されてきた。例えば、米国特許第5,256,547号と欧州特許第057,968（A1）号によれば、培養液をろ過することにより得られた単離固体物である菌糸体を乾燥し、溶媒抽出し、粗シクロスポリンＡを得て；生成物を水等で洗浄することなく前処理し、高価なセファデックスの使用を避けて酸化アルミニウムおよびシリカゲルを用いたクロマトグフラフィにより精製してシクロスポリンＡを得る。また、米国特許第5, 156,960号の教示内容によれば、培養液に溶媒を直接加えることで抽出し、その抽出液をより高い溶解度を有する溶媒に移し、その溶液を無水硫酸マグネシウムなどの乾燥剤で乾燥させ、セファデックスおよびシリカゲル等によるクロマトグフラフィにより精製してシクロスポリンＡを得る。しかし、前記米国特許第5,256,547号に記載された技術は、溶媒抽出により色素量が減少すること、およびこの処理が溶媒の前処理工程とクロマトグラフィ工程において単純化されるという長所があるが、それは菌糸体を乾燥させる追加工程が必要になる短所も有している。一方、米国特許第5,156,960号に記載された技術は、ろ過後培養液から分離した菌糸体から溶媒抽出する代わりに、単に直接溶媒を加えて培養液から溶媒抽出すること、および溶媒を前処理せずにクロマトグラフィ媒体による処理を行うといった長所がある。しかし、その工程短縮により転移溶媒に多量の水分が含まれているので、高価な無水硫酸マグネシウムで乾燥させる更なる工程がなければならず、セファデックスおよびシリカゲルのクロマトグラフィ媒体を使用することで、産業化させるには、それは、複雑さおよび経済的短所をなお含んでいる。発明の開示本発明者等は、上記の先行技術の問題点を解決すべく努力した結果、培養液をろ過することで単離した菌糸体の溶媒抽出の代わりに、培養液に直接溶媒を加えて溶媒抽出する工程；無水硫酸マグネシウムの乾燥工程なしでシリカゲルを用いた単一のクロマトグラフィの工程からなる、シクロスポリンＡを製造するための新規で経済的な方法を完成した。本発明は、トリポクラジウムインフラチュム（Tolypocladium inflatum）の変異株の培養液にアルカノール溶媒を加えてこの混合物を抽出する工程；その抽出物をより高い溶解度を有する低級塩化炭化水素溶媒に移す工程；その溶液を活性炭で処理する工程；および得られた生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィにかける工程からなる、シクロスポリンＡの製造方法に関するものである。前記培養液の抽出過程では、アルカノール溶媒が使用される。添加されるアルカノールの量は培養液のかさの約２倍が望ましく、抽出は約30分間撹拌しながら、行うことが望ましい。また、生成物が移される先の低級塩化炭化水素溶媒としては、塩化メチレン、塩化エチレン、クロロホルム等を用いることができる。これら溶媒の中でも、塩化メチレンが好ましく用いられる。また、クロマトグラフィ媒体による処理の前に、有色不純物を除去するために、生成物を活性炭で処理することが望ましい。本発明に係る製法において、先行技術の、産業化するための大きな問題点を有する乾燥工程が省略され、かつ、非極性の低級塩化炭化水素を使用することで、抽出溶液の水分含量を大きく低減する。また、シクロスポリンＡの純度は、転移溶媒としての低級塩化炭化水素の選択および活性炭の処理により改善され、クロマトグラフィ処理の単純化によりかなりの量の溶媒が節約され、経済的負担が低減される。発明の最良の実施形態ここで、本発明を以下の実施例によりさらに説明する。しかしながら、本発明はその実施例によって限定されることではない。実施例１３リットルのメタノールを、1.5リットルのシクロスポリンＡ（7,115μg/ml）を含む培養液に加え、この混合物をろ過し、抽出されたシクロスポリンＡを回収した。得られた抽出物を、２リットルのヘキサンで洗浄し、２リットルの塩化メチレンを加えることでさらに生成物を抽出した。有色不純物を除去するために、 30ｇの活性炭をこの混合物に添加した。ろ過後、この混合物を蒸発乾固させた。得られた生成物を、50mlの酢酸エチルに溶解し、この溶液をシリカゲルカラムの上方にのせた。酢酸エチルで生成物を溶離した後、ひとまとめにした所望の生成物を含んだフラクション(3,000ml)を、蒸発乾固させた。３リットルのエチルエーテルを添加し、生成物を溶解し、150mlのメトキシメタンをこの混合物に添加した。沈殿した生成物を単離し、シクロスポリンＡを得た(6.4g，含量：98.5 〜100.0%)。実施例２３リットルのメタノールを、1.5リットルのシクロスポリンＡ（6,757μg/ml）を含む培養液（1.5L）に加え、この混合物をろ過し、抽出されたシクロスポリンＡを回収した。この抽出物を1.1リットルのかさまで濃縮した後、この濃縮物を、1.1リットルのメトキシメタンで洗浄し、得られた生成物を1.1リットルの塩化メチレンで２回抽出した。実施例１に従って、生成物を活性炭処理し、シリカゲルのクロマトグラフィを行い、シクロスポリンＡを得た(7.09g，含量：98.5〜100.0%)。実施例３メタノール抽出物を、２リットルのメトキシメタンで清浄したことを除いては、実施例１と同じような方法を反復してシクロスポリンＡを得た(含量：98.5〜1 00.0%)。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１０月７日【補正内容】補正の内容 (1) 明細書の特許請求の範囲を以下のとおり補正する。「請求の範囲１．トリポクラジウムインフラチュム（Tolypocladium inflatum）の変異株の培養液に低級アルカノール溶媒を加えてこの混合物を抽出する工程；その抽出物を低級ハロゲン化炭化水素溶媒に移す工程；および得られた生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィにかける工程からなるシクロスポリンＡの製造方法。２．転移されたハロゲン化炭化水素溶液を、活性炭で処理することを特徴とする請求項１に記載のシクロスポリンＡの製造方法。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645）Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＣ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リー，サング，チュル大韓民国キェオングギ−ドー 463− 020，セオングナム、ブンダング−グ，スナエ−ドング，34 (72)発明者チョイ，ガング，スン大韓民国キェオングギ−ドー 441− 090，スウェオン，クウェオンスン−グ, ゴデウング−ドング，198−22，ロッテアパートメント，１−401 (72)発明者ハム，ユン，ベオム大韓民国キェオングギ−ドー 402− 022，インチェオン，ナム−グ，ヨングヒュン２−ドング，ドンガービラ，２− 302 (72)発明者リー，ドン，ワ大韓民国キェオングギ−ドー 403− 013，インチェオン，ブグ−グ，プピェオング３−ドング，182，バイグンビラ, ８−301 (72)発明者ミン，キェオング，ボク大韓民国ソウル 151−057，クワナグ− グ，ボングチュン７−ドング，1626−23

Claims

【特許請求の範囲】１．トリポクラジウムインフラチュム（Tolypocladium inflatum）の変異株の培養液に低級アルカノール溶媒を加えてこの混合物を抽出する工程；その抽出物を低級ハロゲン化炭化水素溶媒に移す工程；および得られた生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィにかける工程からなるシクロスポリンＡの製造方法。２．転移されたハロゲン化炭化水素溶液を、活性炭で処理することを特徴とする請求項１に記載のシクロスポリンＡの製造方法。３．上記低級ハロゲン化炭化水素が、塩化メチレン、塩化エチレンおよびクロロホルムからなるグループより選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のシスポリンＡの製造方法。４．上記低級ハロゲン化炭化水素が、塩化メチレンであることを特徴とする請求項３に記載のシクロスポリンＡの製造方法。