JPS6393797A - 塩基性ペプチドの精製法 - Google Patents
塩基性ペプチドの精製法Info
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- JPS6393797A JPS6393797A JP24012186A JP24012186A JPS6393797A JP S6393797 A JPS6393797 A JP S6393797A JP 24012186 A JP24012186 A JP 24012186A JP 24012186 A JP24012186 A JP 24012186A JP S6393797 A JPS6393797 A JP S6393797A
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- aqueous
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は医薬として有用なペプチド、詳しくはセクレチ
ン（５ｅｃｒｅｔｉｎ）７７ミリーに関連する塩基性ペ
プチドの精製法に関する。
ン（５ｅｃｒｅｔｉｎ）７７ミリーに関連する塩基性ペ
プチドの精製法に関する。
（従来の技術及びその問題点）
最近のペプチドホルモンに関する研究の進歩により、消
化管に存在する４ゾチドホルモンの多くは、脳にも存在
し、逆に脳で発見されたホルモンの多数が消化管にも認
められることが判９、これらのホルモンは脳−腸管ペプ
チド（Ｂｒａｉｎ−ｇｕｔｐｅｐｔｉｄｅ）と呼称され
、これらホルモンに関する研究が神経内分易学として脚
光を浴びている。
化管に存在する４ゾチドホルモンの多くは、脳にも存在
し、逆に脳で発見されたホルモンの多数が消化管にも認
められることが判９、これらのホルモンは脳−腸管ペプ
チド（Ｂｒａｉｎ−ｇｕｔｐｅｐｔｉｄｅ）と呼称され
、これらホルモンに関する研究が神経内分易学として脚
光を浴びている。
従来よりセクレチンファミリーに属するペプチドホルモ
ンとしては、セクレチン、ムットブイらヨーロピアンノ
ヤーナルノぐイオケミストリー（Ｍｕｔｔ、Ｖ。
ンとしては、セクレチン、ムットブイらヨーロピアンノ
ヤーナルノぐイオケミストリー（Ｍｕｔｔ、Ｖ。
ｅｔ ａ）、、 Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
） １５．５１３（１９７０）、ＶＩＰ、ヨーロピアン
ツヤ−ナルバイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、）４２ 、５８１ （１９７４）、ＰＨ
Ｉ。
） １５．５１３（１９７０）、ＶＩＰ、ヨーロピアン
ツヤ−ナルバイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、）４２ 、５８１ （１９７４）、ＰＨ
Ｉ。
（ペプチドヒスチジンイソロイシン）タケモトらプロシ
ーデングナショナルアカデミーサイエンスユーエスエイ
（Ｔａｋｅｍｏｔｏ、に、 ｅｔ ａＪｌ、、 Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
ーデングナショナルアカデミーサイエンスユーエスエイ
（Ｔａｋｅｍｏｔｏ、に、 ｅｔ ａＪｌ、、 Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、）Ｖｏｌ、 ７８．４１
１ 、６６０３（１９８１）及びＰＨＭ （ペプチドヒ
スチノンメチオニン入ノブユキアイらネイチ−？ −（
Ｎｏｂｕｙｕｋｉ、 １． ｅｔ ａｉ、、Ｎａｔｕｒ
ｅ、）Ｖｏｌ、３０４．５４７（１９８３）が知られて
いる。
１ 、６６０３（１９８１）及びＰＨＭ （ペプチドヒ
スチノンメチオニン入ノブユキアイらネイチ−？ −（
Ｎｏｂｕｙｕｋｉ、 １． ｅｔ ａｉ、、Ｎａｔｕｒ
ｅ、）Ｖｏｌ、３０４．５４７（１９８３）が知られて
いる。
これら塩基性ペプチドの精製法としては「被ゾチド合厄
」（泉屋信夫ら著、２４０頁（１９７５年〕、丸善株式
会社〕、［ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著
、１７６頁（１９８５年）、丸善株式会社）などに一般
的手法という形式で記載されているが、いずれも少量で
の精製法であり、本発明者等の意図する大量の塩基性ペ
プチドの精製法としてはその利用が困難である。
」（泉屋信夫ら著、２４０頁（１９７５年〕、丸善株式
会社〕、［ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著
、１７６頁（１９８５年）、丸善株式会社）などに一般
的手法という形式で記載されているが、いずれも少量で
の精製法であり、本発明者等の意図する大量の塩基性ペ
プチドの精製法としてはその利用が困難である。
（問題を解決するための手段）
本発明者らは塩基性ペプチドの精製に関し鋭意研究の結
果、陽イオン交換樹脂によるからムクロマトグラフを行
なうことにより塩基性ペプチドを高度に純化することを
見出し、さらに、該塩基性ペプチドを高速液体クロマト
グラフィにかけることにより微量の不純物を除去するこ
とができることを見出し、本発明を完成するに至った。
果、陽イオン交換樹脂によるからムクロマトグラフを行
なうことにより塩基性ペプチドを高度に純化することを
見出し、さらに、該塩基性ペプチドを高速液体クロマト
グラフィにかけることにより微量の不純物を除去するこ
とができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は種々の合成法により合成された塩基性ペプチド
の精製法に使用することが出来るが、その代衣例として
固相合成法によシ合成されたＶＩＰの精製法について述
べるが、これらについて限定するものではない。
の精製法に使用することが出来るが、その代衣例として
固相合成法によシ合成されたＶＩＰの精製法について述
べるが、これらについて限定するものではない。
本発明での精製の対象として塩基性アミノ酸の一種であ
るＶＩＰは２８個のアミノ酸残基からなる分子量３３２
５．８の塩基性ペプチドで次に示すようなアミノ酸配列
を有する。
るＶＩＰは２８個のアミノ酸残基からなる分子量３３２
５．８の塩基性ペプチドで次に示すようなアミノ酸配列
を有する。
本ＶＩＰは血流増加、血圧低下作用を有する塩基性に７
°チドである（特開昭５６−１２８７２１参照〕。
°チドである（特開昭５６−１２８７２１参照〕。
本発明に使用したＶＩＰはメリフィールド（Ｍｅｒｒｉ
ｆ １ｅｌｄ、Ｒ，Ｂ）固相合成方法〔ジャーナルオブ
アメリカンケミカルンサイティ（Ｊ、ｏｆ Ａｍｅｒ＊
Ｃｈｅｍ。
ｆ １ｅｌｄ、Ｒ，Ｂ）固相合成方法〔ジャーナルオブ
アメリカンケミカルンサイティ（Ｊ、ｏｆ Ａｍｅｒ＊
Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、、）８５．２１４９（１９６３））に従い、以
下の如くして合成した。即ち、Ｃ末端アミノ酸（アミノ
基を保護したもの〕をそのカルボキシル基によって、不
溶性担体に結合させ、次いでアミン保護基を除去した後
、アミノ酸配列に従い順次アミン基保護アミノ酸を、そ
の反応性アミン基及び反応性カルボキシル基との縮合反
応により結合させ、一段階ずつ合成し、全配列を合成し
た後、ペプチドを不溶性担体からはずすことによ５Ｗ造
される。ここで用いられる不溶性担体としてはベンズヒ
ドリルアミン系樹脂を用いることができる。
下の如くして合成した。即ち、Ｃ末端アミノ酸（アミノ
基を保護したもの〕をそのカルボキシル基によって、不
溶性担体に結合させ、次いでアミン保護基を除去した後
、アミノ酸配列に従い順次アミン基保護アミノ酸を、そ
の反応性アミン基及び反応性カルボキシル基との縮合反
応により結合させ、一段階ずつ合成し、全配列を合成し
た後、ペプチドを不溶性担体からはずすことによ５Ｗ造
される。ここで用いられる不溶性担体としてはベンズヒ
ドリルアミン系樹脂を用いることができる。
ペプチド合成において側鎖官能基を有する各アミノ酸、
例えばＨｉｓ 、 Ｓｅｒ 、 Ａｓｐ 、 Ｔｈｒ
、 Ａｒｇ及びＬｙｓは、その側鎖官能基を保護してお
くのが好ましく、これは通常の保護基により保護され、
反応終了後肢保護基は脱離される。また反応に関与する
官能基は、通常活性化される。これら各反応方法は、公
知であり、それらに用いられる試薬等も公知のものから
適宜選択される７オーニアーらペゾメイド（Ｆｏｕｒｎ
ｉｅｒ、 Ａ、 ｅｔ ａ）、 Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、）
Ｖｏｌ ５゜１６９（１９８４年）、コイらインターナ
ショナルジャ〔 −ナルオブペグタイト リサーチ）Ｃｏｙ、 Ｄ、Ｈ，
、ａｔ ＢＪ、。
例えばＨｉｓ 、 Ｓｅｒ 、 Ａｓｐ 、 Ｔｈｒ
、 Ａｒｇ及びＬｙｓは、その側鎖官能基を保護してお
くのが好ましく、これは通常の保護基により保護され、
反応終了後肢保護基は脱離される。また反応に関与する
官能基は、通常活性化される。これら各反応方法は、公
知であり、それらに用いられる試薬等も公知のものから
適宜選択される７オーニアーらペゾメイド（Ｆｏｕｒｎ
ｉｅｒ、 Ａ、 ｅｔ ａ）、 Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、）
Ｖｏｌ ５゜１６９（１９８４年）、コイらインターナ
ショナルジャ〔 −ナルオブペグタイト リサーチ）Ｃｏｙ、 Ｄ、Ｈ，
、ａｔ ＢＪ、。
Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ、、）■、７
３（１９８０年ン参照。
３（１９８０年ン参照。
本発明によるＶＩＰの精製法はまず不溶性担体からはす
されたペプチドを酸性水溶液で抽出し、不溶性担体から
分離する。酸性水溶液としては酢酸ギ酸、トリフロロ酢
酸もしくは塩酸等の水溶液である。続いて酸を減圧下に
除去後、残査に水又は有機酸アンモニウム塩水溶液を加
えて溶解させる。
されたペプチドを酸性水溶液で抽出し、不溶性担体から
分離する。酸性水溶液としては酢酸ギ酸、トリフロロ酢
酸もしくは塩酸等の水溶液である。続いて酸を減圧下に
除去後、残査に水又は有機酸アンモニウム塩水溶液を加
えて溶解させる。
有機酸アンモニウムとしては酢酸アンモニウム、ギ酸ア
ンモニウムなどがある。該水溶液を弱陽イオン父換樹脂
にかけて吸着させる。弱陽イオン交換樹脂としてはセル
ロースに解離基としてカルボキシメチル基を導入したイ
オン交換体であるＣＭ−セルロースや、架橋デキストラ
ンに解離基としてカルぎキシメチル基を導入したイオン
交換体であるＣＭ−セファディックスや親水性水酸基を
多数持つポリビニール系の合成ポリマーグルに解離基と
してカルボキシメチル基を導入したイオン交換体である
ＣＭ−）ヨパールなどがある。
ンモニウムなどがある。該水溶液を弱陽イオン父換樹脂
にかけて吸着させる。弱陽イオン交換樹脂としてはセル
ロースに解離基としてカルボキシメチル基を導入したイ
オン交換体であるＣＭ−セルロースや、架橋デキストラ
ンに解離基としてカルぎキシメチル基を導入したイオン
交換体であるＣＭ−セファディックスや親水性水酸基を
多数持つポリビニール系の合成ポリマーグルに解離基と
してカルボキシメチル基を導入したイオン交換体である
ＣＭ−）ヨパールなどがある。
次いで吸着した物質を有機酸アンモニウム塩水溶液で溶
出せしめる。次に溶出物より減圧下に、ギ酸及び酢酸な
どの有機酸およびアンモニアを除く。これらの一連の操
作により目的とする塩基性ペプチドが得られるが、この
ものは純粋に精製されるが微量の不純物は除かれていな
い。必要に応じて微量に含まれる不純物を除きより精製
度を上げるためには逆相系のからムであるＯＤＳ −１
２０Ｔからムを用いた高速液体クロマトグラクイ（以下
ＨＰＬＣと略）を用いることによりこの不純物を除くこ
とができる。
出せしめる。次に溶出物より減圧下に、ギ酸及び酢酸な
どの有機酸およびアンモニアを除く。これらの一連の操
作により目的とする塩基性ペプチドが得られるが、この
ものは純粋に精製されるが微量の不純物は除かれていな
い。必要に応じて微量に含まれる不純物を除きより精製
度を上げるためには逆相系のからムであるＯＤＳ −１
２０Ｔからムを用いた高速液体クロマトグラクイ（以下
ＨＰＬＣと略）を用いることによりこの不純物を除くこ
とができる。
（実施例）
以下具体的実施例によって本発明をさらに説明する。
実施例
１、不溶性担体からＶＩＰ画分の抽出（第１図参照〕側
鎖官能基が保護されたＶＩＰを結合した不溶性担体（５
，Ｏｊ’）を公知の方法〔「ペプチド合成の基礎と実験
」（泉屋信夫ら著、２２５頁（１９８５年）、丸善株式
会社〕〕で処理し、０．１モル酢酸水溶液（１７０ｍｌ
）で抽出した。抽出液を減圧下に凍結乾燥しＶＩＰ画分
（１） ２．２９を得た（斜称部ＶＩＰ、）。
鎖官能基が保護されたＶＩＰを結合した不溶性担体（５
，Ｏｊ’）を公知の方法〔「ペプチド合成の基礎と実験
」（泉屋信夫ら著、２２５頁（１９８５年）、丸善株式
会社〕〕で処理し、０．１モル酢酸水溶液（１７０ｍｌ
）で抽出した。抽出液を減圧下に凍結乾燥しＶＩＰ画分
（１） ２．２９を得た（斜称部ＶＩＰ、）。
２、イオン交換クロマトグラフィー（第２図参照）約２
６０ＰのＣＭ−）：ｌパール−６５ＯＳ （東洋曹達製
）を水で膨潤させた後、０．１モル酢酸アンモニウム水
溶液にて平衡化し、３．２ｃｒｎφＸ３３ｃｎ１のから
ムに充填した。このからムに上記画分（１） ２．２２
の０．１モル酢酸アンモニウム水溶液（２０ｍＡ’）を
ロード後、６０ｒｎｌ！の０．１モル酢酸アンモニウム
水溶液で洗滌した。次に０．２モル酢酸アンモニウム水
溶液５００ｍＪ、続いて０．２５モル酢酸アンモニウム
水溶液２０００ｍ／で溶出した。溶出液は約９ ｒｎｌ
ずつ分取した。各分画は２５４ ｎｍおよび２８０ｎｍ
における吸光度と、各分画から１０μｊを取シ、ＨＰＬ
Ｃにより下記の条件で分析し、ＶＩＰ量を測定した。か
らムはＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ −１２０Ｔ （０，４
６Ｘ２５ｃｒＩｔ）（東洋曹達製）を用い、アセトニト
リル−０，１％トリフロロ酢酸水溶液（混合比２８ニア
２）にて分析定量した。この様にして分析した結果を第
３図に示した。
６０ＰのＣＭ−）：ｌパール−６５ＯＳ （東洋曹達製
）を水で膨潤させた後、０．１モル酢酸アンモニウム水
溶液にて平衡化し、３．２ｃｒｎφＸ３３ｃｎ１のから
ムに充填した。このからムに上記画分（１） ２．２２
の０．１モル酢酸アンモニウム水溶液（２０ｍＡ’）を
ロード後、６０ｒｎｌ！の０．１モル酢酸アンモニウム
水溶液で洗滌した。次に０．２モル酢酸アンモニウム水
溶液５００ｍＪ、続いて０．２５モル酢酸アンモニウム
水溶液２０００ｍ／で溶出した。溶出液は約９ ｒｎｌ
ずつ分取した。各分画は２５４ ｎｍおよび２８０ｎｍ
における吸光度と、各分画から１０μｊを取シ、ＨＰＬ
Ｃにより下記の条件で分析し、ＶＩＰ量を測定した。か
らムはＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ −１２０Ｔ （０，４
６Ｘ２５ｃｒＩｔ）（東洋曹達製）を用い、アセトニト
リル−０，１％トリフロロ酢酸水溶液（混合比２８ニア
２）にて分析定量した。この様にして分析した結果を第
３図に示した。
上記の分析に従い画分１８０〜２５９（７２０ｍ／）ｆ
集め減圧下に凍結乾燥し有効画分（■） ４２０ ｍ９
を得た。
集め減圧下に凍結乾燥し有効画分（■） ４２０ ｍ９
を得た。
３、 ＨＰＬＣによる不純物の除去
分収用からムとしてＴＳＫ ｇｅｌ−ＯＤＳ −１２０
Ｔ（２，１５Ｘ３０ｃｍ）（東洋曹達製〕を用い、高速
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、ベックマンシステム
３３２）による微量不純物の除去を行なった。
Ｔ（２，１５Ｘ３０ｃｍ）（東洋曹達製〕を用い、高速
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、ベックマンシステム
３３２）による微量不純物の除去を行なった。
０、１ ％ ） ＋） ７０口酢酸水溶液４．２ ｍｌ
に上記有効画分（Ｉｔ）（４２０７りを溶解した。この
溶液約０．２ｍｌを上記分取用からムにロードし、アセ
トニトリル−０，１％トリフロロ酢酸水溶液（混合比３
ニア）で溶出した（流速８ ｍｌ ／分〕。メインのピ
ークを分取し、減圧下にアセトニトリル、０．１％トリ
フ０口酢酸水溶液を除き、精製ＶＩＰ ２２１ ｍ９を
得た。
に上記有効画分（Ｉｔ）（４２０７りを溶解した。この
溶液約０．２ｍｌを上記分取用からムにロードし、アセ
トニトリル−０，１％トリフロロ酢酸水溶液（混合比３
ニア）で溶出した（流速８ ｍｌ ／分〕。メインのピ
ークを分取し、減圧下にアセトニトリル、０．１％トリ
フ０口酢酸水溶液を除き、精製ＶＩＰ ２２１ ｍ９を
得た。
この精製ＶＩＰの純度をアミノ酸分析およびＨＰＬＣで
測定したところ９８％以上であった。ＨＰＬＣでの測定
結果を第４図に示す。
測定したところ９８％以上であった。ＨＰＬＣでの測定
結果を第４図に示す。
（発明の効果〕
本発明に記載された方法を用いる事により、これまで塩
基性ペプチドの精製法としてグル濾過クロマトグラフィ
ー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィ及び高速液体クロマトグラフィーのうちから数種の
クロマトグラフィーを併用して行なっていた精製法に比
較し、著しく簡便で、かつ大量の塩基性ペプチドの精製
が容易に行なえることが明確にされた。
基性ペプチドの精製法としてグル濾過クロマトグラフィ
ー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィ及び高速液体クロマトグラフィーのうちから数種の
クロマトグラフィーを併用して行なっていた精製法に比
較し、著しく簡便で、かつ大量の塩基性ペプチドの精製
が容易に行なえることが明確にされた。
第１図は未精製のＶＩＰのＨＰＬＣのスペクトルである
。 第２図は未精製のＶＩＰのイオン交換クロマトグラフで
ある。 第３図は粗Ｗ ＶＩＰのイオン交換クロマト処理後（７
） ＨＰＬＣ分析スペクトルである。 第４図は精ｗ ｖｒｐのＨＰＬＣ分析スペクトルである
。
。 第２図は未精製のＶＩＰのイオン交換クロマトグラフで
ある。 第３図は粗Ｗ ＶＩＰのイオン交換クロマト処理後（７
） ＨＰＬＣ分析スペクトルである。 第４図は精ｗ ｖｒｐのＨＰＬＣ分析スペクトルである
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、合成法により合成された塩基性ペプチドを分離・精
製するに当り、 （ア）未精製塩基性ペプチドを酸性水溶液で抽出し、（
イ）酸性水溶液抽出物を弱陽イオン交換樹脂に吸着させ
た後、有機酸アンモニウム塩の水溶液で溶出し、 （ウ）必要に応じて、高速液体クロマトグラフィにより
微量の不純物を除去する、 （ア）、（イ）、（ウ）の工程から成る塩基性ペプチド
の分離・精製方法。 ２、塩基性ペプチドの分子量が３００から５，０００の
範囲である特許請求の範囲第１項記載の精製法。 ３、塩基性ペプチドがセクレチンファミリーに属するＶ
ＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）である特許請求の範囲第１項
記載の精製法。 ４、工程（ア）の抽出用酸性水溶液が酢酸、ギ酸、トリ
クロロ酢酸、もしくは塩酸の水溶液である特許請求の範
囲第１項、第２項、第３項記載の精製法。 ５、工程（イ）の弱陽イオン交換樹脂がＣＭセルロース
、ＣＭセファデックスもしくはＣＭ−トヨパールである
特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項記載の
精製法。 ６、工程（イ）の有機酸アンモニウム塩がギ酸アンモニ
ウムもしくは酢酸アンモニウムである特許請求の範囲第
１項、第２項、第３項、第４項、第５項記載の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24012186A JPS6393797A (ja) | 1986-10-08 | 1986-10-08 | 塩基性ペプチドの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24012186A JPS6393797A (ja) | 1986-10-08 | 1986-10-08 | 塩基性ペプチドの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6393797A true JPS6393797A (ja) | 1988-04-25 |
Family
ID=17054805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24012186A Pending JPS6393797A (ja) | 1986-10-08 | 1986-10-08 | 塩基性ペプチドの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6393797A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008001837A1 (en) * | 2006-06-28 | 2008-01-03 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for purification of oligopeptide |
-
1986
- 1986-10-08 JP JP24012186A patent/JPS6393797A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008001837A1 (en) * | 2006-06-28 | 2008-01-03 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for purification of oligopeptide |
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