BR112012024826B1 - processo para purificação de pneumocandina - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAÇÃO DE PNEUMOCANDINA. O processo descrito pela presente patente revela o processo de purificação de um metabolito secundário produzido via de fermentação. O processo envolve renovação seletiva de impurezas em vários estágios de lavagens, aquecido com carvão seguido pela cristalização. O produto está muito relacionado à classe das equinocandinas e é considerado ser um composto antifúngico potente e um ingrediente-chave na síntese de medicamentos antifúngicos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO:

A presente invenção está relacionada ao processo de purificação de um metabolito secundário produzido pela via de fermentação. O processo envolve renovação seletiva de impurezas em vários estágios das lavagens, aquecido com carvão seguido pela cristalização. O produto está relacionado á classe das equinocandinas e possui composto antifúngico potente e um ingrediente chave na síntese dos medicamentos antifúngicos.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO:

A invenção instantânea descreve um novo processo para a purificação de um metabolito secundário ocorrido naturalmente, obtido via de fermentação. O produto está relacionado à equinocandinas e é conhecido como sendo um intermediário- chave na produção de agentes antifúngicos. Em particular, as pneumocandinas são discutidas em detalhes aqui. Trata-se de um hexapeptido cíclico com múltiplos grupos hidroxilas e uma ligação miristato de metila hidrofóbica conectada à via uma ligação de amido ao grupo de alfa-amino de resíduos de omitina hidroxiladas. De acordo com RE. Schwartz, D.F. Sesin, H. Joshua, K.E. Wilson, A.J. Kempf, K.E. Golden, D. Kuehner, P. Gailliot, C. Gleason, R. White, E. Inamine, G. Bills, P. Salmon, L. Zitano, Pneumo candins from Zalehon arboricola. I. Discovery and isolation, J. Antibiotics 45 (1992) 1853 e G.F. Bills, G. Platas, F. Pelaez, P. Masurekar, Reclassification of a pneumocandina-producing anamorph, Glarea lozoyensis gen. et sp. nov., previously identified as Zalehon narboricola, Mycological Research 102 (1998), Pneumocandina - Bo pode ser produzida pela fermentação de Glarea lozoyensis (Zalehon arboricola). De acordo com O.D. Hensens, J.M. Liesch, D.L. Zink, J.L. Smith, C.F. Wichman, R E. Schwartz, J. Antibiotics 45 (1992) 1875 e A. Adeferati, O. Hensens, E.T.T. Jones, J. Tkacz, J. Antibiotics 45 (1992) 1953, o organismo pode produzir outras equinocandinas em adição ao produto de pneumocandina B0 desejado, incluindo pneumocandina Ao e Co de isômeros. As estruturas das Pneumocandinas são apresentadas abaixo.

Estruturas de Pneumocandina - Bo e seus isômeros

O seguinte processo para a purificação de Pneumocandina-Bo não processada e os compostos relacionados envolve as extrações de solventes-solventes, cristalizações e purificações de coluna repetida, nas quais são cansativas e necessárias para investigar o processo simples e grande. O processo instantâneo é simples e eficaz ao operar. O processo de reivindicação envolve uma nova via de purificação, considerando as lavagens com solventes imiscíveis ou água, remoção de Impurezas coloridas inativas UV e cristalização seletiva do produto. Foi verificado que o processo - 1 apresenta maior rendimento, melhor pureza e menor despesa com matéria prima. O processo instantâneo resulta em pureza de mais de 90%.

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um processo para purificação de pneumocandina apresentando uma ou mais impurezas polares e uma ou mais não impurezas polares compreendendo a extração do produto a partir do caldo da fermentação utilizando solvente adequado e parcialmente concentrado, lavagem com solvente imiscível, aquecido com carvão, concentração e filtração, carregando os sólidos obtidos a partir da etapa (d) em uma coluna com um adsorvente, eluindo com solventes adequados, concentração de frações ricas de produto e cristalização.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO ANEXO:

FIGURA 1: XRD de Pneumocandina - Bo

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada a um processo para purificação de pneumocandina apresentando uma ou mais impurezas polares e uma ou mais não impurezas polares compreendendo; a) extração do produto a partir do caldo da fermentação utilizando solvente adequado e parcialmente concentrado, b) lavagem com solvente imiscível, c) aquecido com carvão, d) concentração e filtração, e) carregamento de sólidos obtidos a partir da etapa (d) em uma coluna com um adsorvente, f) eluição com solvente adequados, g) concentração de frações ricas do produto e h) cristalização.

Pneumocandina é Pneumocandina-B0.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a cristalização é realizada pelo método solvente-antissolvente.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o solvente é selecionado a partir de um grupo compreendendo metanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, see- butanol, tert-butanol e misturas destes.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o antissolvente é selecionado a partir de um grupo compreendendo acetona, acetonitrila, pet-éter, cicloexano, acetato de etila, água e eptano.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o solvente é n-butanol.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o antissolvente é acetona.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o adsorvente é selecionado a partir de um grupo compreendendo alumina e gel de sílica.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o adsorvente é alumina

Ainda em outra configuração da presente invenção, o solvente para eluição é selecionado a partir de um grupo compreendendo metanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, sec-butanol, t-butanol, pentano, hexano, eptano, octano, acetato de etila, água e a mistura destes.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o poliformo obtido é amorfo conforme mostrado na figura-1.

Ainda em outra configuração da presente invenção, caracterizada pelo fato de que a pureza é maior que 90%.

A invenção descrita na presente patente revela o processo de purificação das moléculas do tipo de lipopéptido cíclico, por exemplo, a família de equinocandina apresentando uma ou mais impurezas polares e uma ou mais não impurezas polares, compreendendo as seguintes etapas: a) extração do produto a partir do caldo da fermentação utilizando o solvente adequado e parcialmente concentrado, b) lavagem com solvente imiscível, c) aquecido com carvão, d) concentração e filtração, e) carregamento de sólidos obtidos a partir da etapa (d) a uma coluna pré- carregada com um adsorvente, f) eluição com solvente adequados, g) concentração das frações ricas de produto e h) cristalização.

O processo descrito pela presente patente tem por objetivo na purificação de metabolito secundário ocorrida naturalmente obtida a partir da via de fermentação. O processo pode ser utilizado, em geral, para o ciclo - moléculas do tipo peptideo, por exemplo, equinocandinas. Em particular, o processo tem por objetivo na purificação de pneumocandina - Bo. na qual é um produto chave para obter acetato de caspofungina, um agente antifúngico conhecido, por meio de via sintética. O processo instantâneo envolve a renovação seletiva de impurezas, onde o produto permanece em um solvente e é tratado com solventes imiscíveis para a retrolavagem, e adicionalmente, é tratado com carvão ativado para remover uma quantidade significativa de impurezas coloridas inativas UV presentes desde o inicio. Este é seguido pela cristalização seletiva do produto, enquanto as impurezas permanecem amplamente no licor-mãe e o produto se precipita. A primeira cristalização do processo resulta na forma amorfa de pneumocandina-B0 com pureza moderada (7585%).

Além disso, estes cristais envolvem a ligação do produto junto com as impurezas em um adsorvente. Normalmente, a N-alumina é utilizada, porém outras variantes de alumina ou sílica podem ser utilizadas. Após disto, a eluição é realizada com a composição do solvente, que é mais seletiva em direção das impurezas. Esta purificação resulta na remoção de outras impurezas e, principalmente, Ao nesta etapa.

Esta etapa é seguida pela composição do solvente, que elui o produto de pureza moderada, onde algumas das impurezas remanescentes são removidas. Além disso, a eluição é realizada com solvente seletivo do produto, que elui o produto de alta pureza. Essas frações de alta pureza são unidas, concentradas e cristalizadas para 5 obter Pneumocandina-B0 de alta pureza em forma sólida (>90%).

Em particular, a purificação de Pneumocandina - Bo da estrutura mostrada acima é discutida.

O processo de purificação envolve extração do produto a partir do caldo de fermentação utilizando o solvente adequado, principalmente alcoóis, isto é, propanol, 10 iso-butanol, t-butanol, n-butanol. A camada de extrato unida está concentrada em aproximadamente 30-50 g/kg do estágio sob vácuo em 45-50 °C. A próxima etapa é para remover as impurezas polares e várias outras impurezas presentes no extrato do concentrado. Esta é acompanhada do uso de um solvente ou composição do solvente, que é imiscivel. Quando o n-butanol estiver presente nos extratos 15 parcialmente concentrados, a água pode ser retirada por retrolavagem. Normalmente, ~2-3 de volume de água com relação ao extrato unido concentrado que é adicionado e é misturado muito bem e permitindo para o depósito. A camada de n-butanol se separa da camada aquosa junto com o produto enquanto grandes quantidades de impurezas são retidas na camada aquosa. Pode-se obter aproximadamente de 10 a 20 35% de aumento das impurezas dependendo das impurezas no caldo da fermentação. A lavagem com água pode ser repetida visando atingir a melhor pureza possível. Esta camada de n-butanol é diluída ao adicionar uma quantidade a mais de n-butanol visando concentrar o produto aproximadamente de 5 a 10 g/kg e tratada com carvão ativado. Normalmente, 0.5:1 - 5:1 (w/w) de carvão é utilizado. A 25 suspensão é mexida muito bem e filtrada por meio de camada de celita seguida por lavagem da camada. As impurezas coloridas inativas UV são absorvidas no carvão ativado, que são adsorvidas na camada de celita provendo a remoção de não impurezas UV. Também, algumas impurezas ativas UV são adsorvidas pela celita proporcionando o aumento de pureza cromatográfica de aproximadamente 10%. A camada de produto de n-butanol está concentrada em aproximadamente 30 g/kg do estágio.

A próxima etapa de purificação envolve a cristalização. A cristalização descrita, pela presente patente, utiliza adição de antissolvente e resfriamento. O solvente pode ser qualquer um entre o metanol, propanol, iso-propanol, n-butanol, t- butanol, iso-butanol etc. e o antissolvente pode ser qualquer um entre a acetona, acetonitrila, acetato de etila, água etc., enquanto que, preferencialmente, a acetona é utilizada.

A camada de produto unido concentrado após as etapas de purificação conforme discutida acima é levada a um recipiente revestido para a cristalização. A adição lenta de antissolvente é iniciada em temperatura ambiente. A taxa de fluxo é ajustada utilizando uma bomba, de tal modo que os 5 volumes de antissolvente sejam adicionados durante 4 a 6 horas. Após a adição de 2-3 volumes de antissolvente, a solução quase atinge o ponto de saturação em temperatura ambiente TA. Neste momento, o resfriamento é iniciado e a temperatura é diminuída a 0-10 °C durante a adição de antissolvente. A etapa de cristalização é sensível à concentração inicial do produto, à taxa de adição do antissolvente e ao resfriamento. A adição rápida pode render para precipitar as impurezas também, enquanto uma adição lenta pode render para secar a massa em vez do pó sólido. A filtragem a vácuo é utilizada para separar os sólidos do licor-mãe. O produto sólido é seco à vácuo em 40 °C por 24 horas. Dependendo da impureza inserida de material, a cristalização sucessiva pode ser realizada ao atingir a purificação, porém é observado que a purificação entre 75-85% se tornará extremamente difícil.

Os sólidos obtidos a partir da etapa acima com a pureza de 75-85% de Pneumocandina - Bo coexiste com seus isômeros Aoe Co e outros muito relacionados às impurezas. A separação destas impurezas é difícil ao utilizar operações de unidade simples como a cristalização. A cristalização repetitiva oferece um aumento muito rápido na pureza em uma perda significativa de produto. De modo convencional, é requerido ter execuções de preparativos cromatográficos para isolar a Bo. Também, sabe-se que apenas a cromatografia de fase normal com fase móvel muito específica proporcionará resolução entre Ao, Bo, Co e outras impurezas relacionadas. O processo instantâneo ainda envolve um método novo para a purificação visando obter alta pureza (maior que 90%) de Pneumocandina Bo. O processo envolve o carregamento de pureza moderada (-75-80%) Pneumocandina - Bo em um adsorvente. O adsorvente pode ser escolhido entre as variantes de Alumina ou gel de sílica. A alumina neutra é particularmente discutida em detalhes aqui. Nesta etapa, o produto junto com as impurezas liga-se à camada de adsorvente. Após disto, a renovação seletiva de impurezas é realizada pela variação de composição de solventes. A primeira composição de seleção de solvente por meio das impurezas é escolhida para eluir de modo seletivo as frações de impurezas ricas, e, em seguida, a seleção da composição para o produto é escolhida de modo seletivo para eluir o produto de frações de alta pureza.

Os solventes para a eluição escolhida entre metanol, n-propanol, iso-propanol, n- butanol, t-butanol, sec-butanol, acetato de etila, hexano, eptano e água etc. O estudo apresentou que o eluente rico em água é altamente seletivo às impurezas relacionadas. Foi observado que o eluente rico em água com pequenas quantidades de metanol é mais seletivo para o isômero Ao e o solvente rico em iso-propanol com hexano, (normalmente, 80/20 v/v); é mais seletivo para Co. Apesar de ter sido encontrada tal composição de acetato de etila, metanol, água foi mais seletiva com relação às impurezas.

Diferentes taxas de N-alumina com relação ao produto foram tentadas e a taxa de 5 30:1 (w Aiumina/w produto) foi considerada como sendo ótima para um melhor rendimento e pureza. A taxa maior de alumina requer mais quantidade de solventes para eluir. A mesma porcentagem de produto, como o caso de 30:1. As taxas menores de N- alumina resultam em perda de produto.

Para iniciar com, a N-alumina (30:1 w/w) é acondicionada em uma coluna de vidro 10 visando fazer uma camada uniforme. Na escala de produção, o filtro nutsche pode ser utilizado para o acondicionamento da camada. Os cristais obtidos a partir da etapa anterior são dissolvidos em metanol para fazer a concentração de produto de aproximadamente de 15-40 g/L. Estes estão localizados na camada de N-alumina. Pequenas quantidades de fluxo são obtidas, que mostram apenas 1-2% do produto 15 carregado.

Após disto, a eluição seletiva de impurezas é inicializada Normalmente, um volume da coluna de água é passado através da camada, que retira principalmente as impurezas relacionadas e algumas Ao. Esta é seguida pela eluição seletiva de outras impurezas. Normalmente, a mistura gradiente de metanol-água é utilizada para os 20 volumes da coluna de 5-8, que retira quase todas as impurezas relacionadas e uma grande parte de Ao. Finalmente, o produto -Bo com a pureza moderada (-80-84%) elui e é coletada separadamente. Após a eluição seletiva destas impurezas, 100% metanol é utilizado para eluição. É mais seletivo para o produto como para quase todas as impurezas relacionadas e a quantidade significativa de Ao já está eluida, o 25 produto inicia a eluição com alta pureza. De 10 a 15, tal como frações são eluídas e coletadas separadamente. A pureza de frações iniciais varia entre 88-90%, enquanto frações anteriores variam entre 90-95%. Estas frações de alta pureza são unidas e concentradas aproximadamente 60-100 g/kg do estágio. Então, este concentrado é cristalizado utilizando uma adição lenta de acetona como antissolvente na temperatura de 0-10 °C conforme discutido anteriormente.

Os detalhes do método estão exemplificados com a ajuda de exemplos dados abaixo. No entanto, não se deve achar que a revelação do escopo limita-se aos exemplos.

EXEMPLOS:

20 kg do caldo da fermentação contendo aproximadamente 31 gm do produto - Pneumocandina Bo foi extraída utilizando 8 Kg de n-butonal.

Exemplo-1

853 gm de camada de extrato de n-butanol consistindo de 4.3 gm de produto na pureza de 22.8% foi levado e concentrado a 30 g/kg do estágio. Este concentrado foi lavado com água 1:1 (w/w) de base. A camada de n-butanol obtida apresentou 4.1 gm do produto com pureza 44.9%. Esta camada de n-butanol estava unida com outra camada de n-butanol (344 gm) com 4.93 gm de produto na pureza 26.7%. Esta camada de n-butanol unida estava concentrada aproximadamente a 30 g/kg do estágio seguida pelo segundo estágio de lavagem com água em 3:1 (w/w) de base. A camada de n-butanol separada após a lavagem com água pesava 252 gm com o produto 8.4 gm (92.8%) na pureza 60%. A camada aquosa pesava 923 gm com 0.407 gm (4.5%) do produto na pureza de 2.7%.

A camada de 35 gm de n-butanol foi retirada de 252 gm de n-butanol obtido acima. A análise mostrou 1.15 gm do produto em concentração de aproximadamente 33g/kg e pureza em aproximadamente 60%. 0.5 gm de carvão ativado foi adicionado a este e foi mexido por 1 hora. Separadamente, 15 gm de celita foi levada e a mistura foi feita utilizando n-butanol. A camada de celita foi acondicionada no funil Buchner e a suspensão de carvão foi carregada nesta camada de celita, deste modo o carvão junto com as impurezas inativas UV é adsorvido na superficie de celita. O filtrado (140 ml) consistindo de 1.1 gm (95%) com pureza 70.1%. A camada ainda foi dada na lavagem com n-butanol (50ml), que apresentou 0.078 gm (aproximadamente 5%) na pureza 68.5%. Estes dois foram unidos (190ml) e utilizados para a cristalização.

O filtrado unido e a lavagem da camada conforme obtido acima (1.15 gm de produto na pureza -69%) foi concentrado em aproximadamente 30 g/kg do estágio, ou seja, aproximadamente 40 ml. A acetona foi adicionada gota a gota na solução do produto n-butanol. A taxa de fluxo de acetona foi mantida em 0.66 ml/min. Após 3 volumes de adição de acetona, o resfriamento da massa de reação foi iniciado. A temperatura foi mantida entre 8-10 °C. Neste estágio, a solução tornou-se supersaturada e o produto iniciou a precipitação. A adição de acetona foi continuada até 320 ml de acetona ser adicionada. Finalmente, o produto foi filtrado. O produto final é branco amarelado. A análise HPLC apresentou 1.017 gm (88%) do produto com pureza 78.6%. A análise XRD mostrou-o sendo uma forma amorfa completa.

Exemplo -2

Para realizar um processo de purificação grande, a cristalização de pureza menor de material iniciado foi estudada. A menor impureza no estágio de cristalização pode aumentar devido à grande presença de maior porcentagem de impurezas no estágio de extrato ou devido ao tratamento impróprio na lavagem e/ou outra etapa de purificação. Tem-se observado, em tal caso, que a cristalização pode ser requerida. 240 gm de camada de extrato de n-butanol consistindo de 4.97 gm de produto na pureza de 22.8% foi considerada. Este foi concentrado à concentração do produto de aproximadamente 30g/kg do estágio e foi dado à lavagem com água com 1:1 (w/w) de base. A camada de N-butanol pós-lavagem com água apresentou 4.85 gm (97.6%) de produto com pureza de 38%. Esta foi diluída a 395 gm com n-butanol para fazer a concentração do produto ~10g/kg.

Para aquecer com carvão, 0.5:1 (w/w) de carvão foi utilizado e misturado com o produto por aproximadamente 1 hora. Este foi filtrado na cada de celita utilizando 15:1 (w/w) de celita. 95% produto foi obtido no filtrado e 5% na lavagem da camada.

O filtrado e a lavagem da camada foram unidos e cristalizados do mesmo modo que o Exemplo-1. O produto (sólido) obtido após 1' cristalização apresentou 3.56 gm do produto com pureza 58 5%. Após a segunda cristalização, 2.84 gm do produto foi obtido com 67 % de pureza. É requerida a terceira cristalização para atingir 81.23 % da pureza com 1.98 gm de produto final.

Foi observado que a cristalização é uma das etapas mais criticas do processo de purificação-1. A taxa de adição de antissolvente, quantidade, introdução do resfriamento, concentração do resfriamento inicial e a pureza, natureza das impurezas, todos impactam no desempenho e, então, resultam na cristalização. Por exemplo, em uma taxa muito elevada de antissolvente, o produto junto com as impurezas se precipita, então a purificação não acontece de forma adequada. Além disso, a adição rápida de antissolvente, não mais precipita as impurezas UV, que não podem ser detectadas na pureza HPLC, mas visivelmente parecem muito escuras. De modo similar, se o resfriamento é iniciado em um estágio muito precoce quando o produto está concentrado, a precipitação inicia-se muito rapidamente, resultando em um fenômeno similar conforme discutido com adição rápida de antissolvente. Além disso, se a taxa de adição é pouca, esta não cristaliza de um modo adequado e o rendimento na formação do bolo ou massa macia na filtragem ao invés de pó fino. Foi estudado que a cristalização em 0-3 °C proporciona maiores rendimentos como comparados em 8-10 °C devido à diminuição de solubilidade do produto.

EXEMPLO: PROCESSO 2

O produto Pneumocandina-Bo obtido a partir do processo-1 foi utilizado para purificação a fim de obter alta pureza (>90%) de Pneumocandina - Bo. 1.5 gm de produto sólido foi retirado e dissolvido em metanol, tal como a concentração do produto se tornou ~25g/L. O carregamento foi analisado pelo HPLC e a % da área do produto e as impurezas estavam conforme segue: - Impureza T (RRT 0.33): 0.68%, Ao: 5.57%, Bo: 77.99%, Impureza relacionada- R(RRT 1.05): 4.42%, Co: 5.97%%. 45 gm de N-alumina foi retirada e a camada foi acondicionada em uma coluna de vidro. As dimensões da camada são - diâmetro: 4 cm, altura: 3.5 cm. O produto foi carregado nesta camada e o fluxo foi coletado. O fluxo mostrado de 1.3% do produto com pureza de 76.92%.

Agora, a eluição seletiva de impurezas foi realizada conforme mostrada na FIGURA- 2. Primeiramente, volume eluição 1 da coluna com 100% de água é realizado. Isto leva, principalmente, impurezas T (RRT 0.33) e impurezas Ao, enquanto pouco de produto. A análise HPLC apresentou 5.57% de T, 26.23% de Ao e 41.5% of Bc enquanto a perda de produto foi apenas 4.6%. A % da área de R e C0 foi de 1.2% e 2.5%, respectivamente.

Esta foi seguida pela eluição com metanol/água 25/75% (v/v). A composição tradicional de uma fração foi de aproximadamente 8% T, aproximadamente 12% Ao, aproximadamente 60% Bo, aproximadamente 2% R e aproximadamente 4% Co, enquanto a perda total do produto foi apenas de 1.5% nos volumes da coluna 6.

Próximo a uma coluna de volume foi eluído com metanol-água 50/50% (v/v). Isto favorece a eluição de outras impurezas junto com o produto, resultando em pureza moderada do produto. A análise de fração pela HPLC mostrou aproximadamente 8% Ao, 83.88% Bo e 3% R, enquanto T e Co estavam quase ausentes. A perda do produto nesta fração foi somente de 0.51%.

Próximo aos volumes de coluna 15 foram eluídos com 100% metanol e foram coletados separadamente. A primeira fração possui 85.08% de pureza e a segunda fração possui 86.5% de pureza As frações 3-5 possuem pureza de aproximadamente 88.3%, as frações 6-10 possuem pureza de aproximadamente 90-91.8% enquanto 11-14 possuem 92-93.7% de pureza Após disto, a tendência de diminuição de pureza foi observada. A fração 15 apresentou 91.99% de pureza.

As frações unidas 1-14 apresentaram no total 54.6% do produto com pureza 90.21%. Essas frações unidas estavam concentradas em aproximadamente 25 ml e o concentrado foi transferido a um recipiente revestido. A acetona foi utilizada como antissolvente e a cristalização foram realizadas conforme descrita anteriormente. O produto final foi filtrado e seco à vácuo conforme descrito acima. O produto final ficou branco e completamente amorfo. A análise HPLC apresentou 91.37% de pureza do produto - Pneumocandina Bo.

Embora o Processo-1 e Processo-2 forem descritos para o produto Pneumocandina-Bo, mas entende-se que tais técnicas podem ser utilizadas para purificação de outras moléculas obtidas a partir da fermentação que são similares ao lipopeptidios, particularmente a família de equinocandinas. As “chaves" de uma invenção no Processo-1 e Processo-2 são a renovação seletiva de impurezas, enquanto o produto permanece em um solvente do começo ao fim. O Processo-1 tem vantagens sobre o processo relatado de purificações em termos de evitar a extração de retorno repetitivo e as etapas de concentração com ou sem extração de líquido- líquido, que envolve alta operação e altos custos com matéria prima junto com perdas significantes de produto. O Processo-1 revela cristalização controlada de produto, que seletivamente precipita o produto. O Processo-1 revela um novo modo de purificação onde o produto permanece em um solvente do começo ao fim, que melhora o rendimento, facilita a recuperação de solventes, bem como reduz os custos com a matéria prima. Considera-se que o processo-1 possui um rendimento geral de 5 55-70% (com relação ao caldo) com a pureza do produto final de 75-82%. O Processo-2 possui um rendimento geral de 45-55% com pureza do produto final de 90-93%.

Enquanto vários aspectos e configurações foram revelados na presente invenção, outros aspectos e configurações serão evidentes aos especialistas na técnica. Os 10 diversos aspectos e configurações revelados na presente invenção são apenas para fins de ilustração e não se pretende que sejam limitativos, com o verdadeiro âmbito e espírito sendo indicado pelas reivindicações que se seguem.

Claims (13)

1. Processo para purificação de pneumocandina, tendo uma ou mais impurezas polares e uma ou mais impurezas não polares, compreendendo: a) extração do produto do caldo de fermentação por extração do mesmo com um solvente adequado e concentração parcial, caracterizado pelo fato de que o solvente adequado é um álcool selecionado de n-butanol, sec-butanol, butanol terciário e n- propanol; b) lavagem com solvente imiscível, c) aquecimento com carvão, d) concentração e filtragem, e) cristalizar o filtrado para obter um sólido; f) carregar o sólido em uma coluna com um adsorvente selecionado de alumina ou sílica gel; g) eluir impurezas passando um volume de coluna de água através da coluna; h) eluir o produto da coluna com um ou mais solvente (s) para obter pneumocandina B0 eluída; e i) concentração e cristalização da pneumocandina B0 eluída para obter a pneumocandina B0.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente imiscível é selecionado de um grupo que compreende água, éter de petróleo e ciclohexano.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o solvente é água.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cristalização é realizada pelo método solvente/antissolvente.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o solvente utilizado no método solvente / antissolvente é selecionado a partir de um grupo que compreende metanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, sec-butanol, butanol terciário e quaisquer combinações disso.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anti- solvente utilizado no método solvente / antissolvente é selecionado de um grupo que compreende acetona, acetonitrila, éter de petróleo, ciclohexano, acetato de etila, água e heptano.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adsorvente é alumina.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais solventes para eluição do produto é / são selecionados de um grupo que compreende metanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, sec-butanol, butanol terciário, pentano, hexano, heptano, octano, acetato de etila e qualquer combinação de n-propanol, iso-propanol, n-butanol, sec-butanol, butanol terciário, pentano, hexano, heptano, octano, acetato de etila e água.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente adequado é n-butanol, em que a lavagem com solvente imiscível compreende a adição de n-butanol para obter uma concentração de produto de 5-10 g/kg, o aquecimento com carvão compreende a agitação e a filtragem é feita através de uma camada de celita.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma mistura gradiente de água/metanol para volumes de coluna de 5-8 após passar um volume de coluna de água através da coluna.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende a eluição da pneumocandina B0 da coluna com metanol.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o metanol é 100% metanol.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pneumocandina B0 é pneumocandina B0 amorfa.

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