CN115286670A - 一种异秦皮苷原料药的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种异秦皮苷原料药的制备方法，以中华猕猴桃的干燥根为原料经过溶剂提取、有机溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析、聚酰胺树脂柱层析、有机溶剂萃取、重结晶和干燥等步骤获得异秦皮苷。本发明的方法工艺流程简单实用，且由于在各步骤中采用特定的工艺条件，从而获得了高得率、高纯度的异秦皮苷，因此产生了更适于工业化生产的效果。
Description
技术领域
本发明涉及天然有机化学领域，尤其是涉及一种异秦皮苷原料药的制备方法。
背景技术
目前，异秦皮苷(isofraxoside)是猕猴桃科植物中华猕猴桃(ActinidiachinensisPlanch)的干燥根中所含的一种香豆素类化合物，其结构式如下：
【CAS】24778-11-8
【分子式及分子量】C16H18O10；370
【化学分类】香豆素类
【理化性质】白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、沸水、碱性水溶液，微溶于乙醚，难溶于石油醚、冷水。mp 217-218℃；UVλmax/nm：208,226(sh),255,303；IRυmax/cm-1：3350,1725,1580,1495。
异秦皮苷(isofraxoside)为香豆素类化合物，是中药藤梨根的主要成分之一。作为藤梨根的主要活性成分，异秦皮苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药理活性。为了对异秦皮苷进行成药性评价，亟需简单实用、稳定可控的异秦皮苷原料药富集方法，而现有文献中关于异秦皮苷高效专一的制备方法未见报道。迄今异秦皮苷简便效廉的原料药制备工艺亦未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异秦皮苷原料药的制备方法，该工艺以富含异秦皮苷的藤梨根为原料；生产成本低廉，工艺流程简单，产品得率和纯度均高等特点。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种异秦皮苷原料药的制备方法，包括如下步骤：
步骤S10：将中药藤梨根的干燥根粉碎，加入提取溶剂回流提取，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；
步骤S20：利用有机溶剂对浓缩液进程萃取处理，合并有机相，回收有机溶剂，获得第一萃取物；
步骤S30：将第一萃取物用第一溶剂溶解，依次经大孔吸附树脂柱层析和聚酰胺树脂柱层析；后再次利用第一溶剂进行梯度洗脱，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩，得富含异秦皮苷浓缩液；
步骤S40：将富含异秦皮苷的浓缩液，用选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯或正丁醇的有机溶剂萃取，合并有机相，回收有机溶剂，获得第二萃取物；
步骤S50：利用第二溶剂对第二萃取物进行重结晶处理，随后干燥，制得异秦皮苷。
进一步地，步骤S10中，所述提取溶剂的质量为中药藤梨根的8-15倍；回流提取2-3次，每次提取时间为2-3小时。
进一步地，步骤S10中，所述提取溶剂选自水、甲醇、乙醇或其混合物。
进一步地，步骤S10中，所述提取溶剂为水和乙醇的混合物，乙醇浓度为10-95％；提取温度大于等于70℃，小于提取溶剂的沸点温度。更为优选地，乙醇浓度为60-95％；提取溶剂的用量为中药藤梨根原料质量的10倍。
进一步地，步骤S10中，所制得的浓缩液的相对密度为1.05-1.20。
进一步地，步骤S20中，所述有机溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丙酯。优选地，有机溶剂为乙酸乙酯。
进一步地，步骤S20中，所述有机溶剂的用量为浓缩液体积的1-3倍。
进一步地，步骤S20中，萃取处理3-5次。
进一步地，步骤S30中，所述第一溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮或其混合物。优选地，步骤S30中，第一溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为20-50％。
进一步地，步骤S30中，大孔吸附树脂选自AB-8、D101、HP-20、ADS-17、HPD100、NKA-9或DM-301；聚酰胺树脂选自醇溶性聚酰胺树脂或苯溶性聚酰胺树脂。
进一步地，步骤S30中，用于梯度洗脱的洗脱溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为10-95％。
优选地，步骤S40中，有机溶剂为乙酸乙酯。
进一步地，步骤S50中，第二溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇或其混合物。更为优选地，第二溶剂为乙酸乙酯或丙酮或二者混合物。
进一步地，步骤S50中，干燥方式为减压干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明提供的一种异秦皮苷原料药的制备方法，以中华猕猴桃(Actinidiachinensis Planch)的干燥根为原料经过溶剂提取、有机溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析、聚酰胺树脂柱层析、有机溶剂萃取、重结晶和干燥等步骤获得异秦皮苷。
在提取时，由于本申请特定的溶剂，即如上所述的选自水、甲醇、乙醇或其混合物来提取，具有提取率高的特点；特别地，优选特定的提取溶剂(即60-95％乙醇-水的混合物)提取，因乙醇和水均为人体所能耐受的毒性较小的溶剂，60％的乙醇-水混合物即可得到富含异秦皮苷的提取液，且随着乙醇浓度的增加，提取率亦增加，优选60-95％乙醇-水的混合物为提取溶剂。
在步骤S20的萃取的时候，充分考虑了异秦皮苷与有机溶剂的相容性，因为异秦皮苷为连糖的香豆素类化合物，根据相似相溶原理特定地采用有机溶剂二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯或正丁醇；特别是优选乙酸乙酯来萃取。在大孔吸附树脂柱层析前用上述特定的有机溶剂萃取是优于传统柱层析的关键环节，该步骤可除去非极性及小极性的杂质，以便简化后续的柱层析步骤。
采用大孔吸附树脂柱层析结合聚酰胺树脂柱层析后二次萃取与重结晶的方法，有利于异秦皮苷的逐步富集与纯化。聚酰胺树脂柱层析后异秦皮苷进一步得到富集，但亦有其它杂质，为进一步纯化除杂，选用正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷等对异秦皮苷浓缩液进行萃取，考虑到乙酸乙酯对异秦皮苷的萃取效果最好，故在此次萃取中为优选溶剂。
萃取后为进一步纯化除杂，采用重结晶的方法，通过前期实验筛选出异秦皮苷在乙酸乙酯、乙醇或其混合物中易于重结晶且晶型较好，同样考虑到乙酸乙酯和乙醇在大生产中应用较多、毒性较小，故优选这二者。
总之，本发明的方法采用了工业化常用的溶剂提取、有机溶剂萃取、色谱分离、重结晶和干燥等步骤，工艺流程简单实用，且由于在各步骤中采用特定的工艺条件，从而获得了高得率、高纯度的异秦皮苷，因此产生了更适于工业化生产的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本实施例中异秦皮苷原料药的高效液相色谱图。
测定方法为：检测系统：LC-10A型HPLC仪；色谱柱：Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-1％乙酸溶液(8∶92，V/V)；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；检测波长：350nm；柱温：25℃。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
(1)将藤梨根粉碎成粗粉，加60％乙醇进行回流提取3次，每次3h，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，获得相对密度为1.14的浓缩液；
(2)将上述浓缩液加少量水分散后，用2倍体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，回收乙酸乙酯，得第一萃取物；
(3)将第一萃取物用20％乙醇溶解后上于HP-20大孔吸附树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:3)，先用20％乙醇洗脱5BV，弃去；再以50％乙醇洗脱6BV，洗脱液以三分之一或四分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩得浓缩液(相对密度为1.10)；将浓缩液上于60-100目醇溶性聚酰胺树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:5)，先用20％乙醇洗脱3BV，弃去；再以60％乙醇洗脱5BV，洗脱液以二分之一或三分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩至至无醇味，得富含异秦皮苷浓缩液；
其中，图1为本实施例中异秦皮苷原料药的高效液相色谱图。测定方法为：检测系统：LC-10A型HPLC仪；色谱柱：Kromasil C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-1％乙酸溶液(8∶92，V/V)；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；检测波长：350nm；柱温：25℃。
(4)将异秦皮苷浓缩液加少量水分散后，用2倍体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，回收乙酸乙酯，得第二萃取物，将第二萃取物用适量乙酸乙酯-丙酮(3:7)溶解，静置待其析晶，用适量丙酮洗去晶体表面杂质，重结晶3次后异秦皮苷的纯度99.0％，再经过减压干燥得异秦皮苷原料药，得率为0.11％。
实施例2
(1)将藤梨根粉碎成粉，加80％乙醇进行回流提取3次，每次3h，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，密度1.11，得浓缩液；
(2)将上述浓缩液加少量水分散后，用3倍体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，回收乙酸乙酯，得第一萃取物；
(3)将浓缩液用20％乙醇溶解后上于D101大孔吸附树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:3)，先用20％乙醇洗脱5BV，弃去；再以50％乙醇洗脱6BV，洗脱液以三分之一或四分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩得浓缩液(密度为1.09)；将浓缩液上于60-100目醇溶性聚酰胺树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:5)，先用20％乙醇洗脱3BV，弃去；再以60％乙醇洗脱5BV洗脱液以二分之一或三分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩至无醇味，得富含异秦皮苷的浓缩液；
(4)将异秦皮苷浓缩液加少量水分散后，用2倍体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，回收乙酸乙酯，得第二萃取物，将第二萃取物用适量乙酸乙酯-丙酮(4:6)溶解，静置待其析晶，用适量丙酮洗去晶体表面杂质，重结晶2次后异秦皮苷的纯度98.8％，再经过冷冻干燥得异秦皮苷原料药，得率为0.10％。
实施例3
(1)将藤梨根粉碎成粗粉，加95％乙醇进行回流提取3次，每次3h，合并提取液，过滤，减压浓缩至无醇味，密度1.10，得浓缩液；
(2)将上述浓缩液加少量水分散后，用3倍体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，回收乙酸乙酯，得第一萃取物；
(3)将第一萃取物用20％乙醇溶解后上于AB-8大孔吸附树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:3)，先用20％乙醇洗脱5BV，弃去；再以80％乙醇洗脱6BV，洗脱液以三分之一或四分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩得浓缩液(密度为1.08)；将浓缩液上于100-120目醇溶性聚酰胺树脂柱中，湿法装柱(样品量和装柱树脂量比例为1:5)，先用20％乙醇洗脱3BV，弃去；再以60％乙醇洗脱5BV，洗脱液以二分之一或三分之一收集为一个流分，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩至至无醇味，得富含异秦皮苷浓缩液；
(4)将异秦皮苷浓缩液加少量水分散后，用2倍体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，回收乙酸乙酯，得第二萃取物，将第二萃取物用适量乙酸乙酯-丙酮(2:8)溶解，静置待其析晶，用适量丙酮洗去晶体表面杂质，重结晶3次后马钱苷的纯度98.5％，再经过喷雾干燥得异秦皮苷原料药，得率为0.09％。
此外，为了进一步对比本发明选择特定的制备方法的效果，因实施例1异秦皮苷得率高达0.11％，纯度高达99.0％，特设置如下对比例来与本申请实施例1进行对比，具体结果也见下表1。
对比例1：除大孔吸附树脂柱前不采用有机溶剂萃取外，其余同实施例1。该对比例表明大孔吸附树脂柱前不采用有机溶剂萃取最终获得的异秦皮苷纯度仅为80.3％，效果不如本发明制备的异秦皮苷原料药纯度。
对比例2：除不采用大孔吸附树脂柱来进行层析外，其余同实施例1；该对比例表明不采用大孔吸附树脂柱层析最终获得的异秦皮苷的纯度仅为82.7％，效果不如本发明制备的异秦皮苷原料药纯度。
对比例3：除不采用聚酰胺树脂柱来进行层析外，其余同实施例1；该对比例表明不采用聚酰胺树脂柱层析最终获得的异秦皮苷的纯度仅为84.5％，效果不如本发明制备的异秦皮苷原料药纯度。
对比例4：在聚酰胺树脂柱层析后，除不采用有机溶剂萃取外，其余同实施例1；该对比例表明在聚酰胺树脂柱层析后不采用有机溶剂萃取最终获得的异秦皮苷的纯度仅为89.5％，效果不如本发明制备的异秦皮苷原料药纯度。
对比例5：除不采用重结晶外，其余同实施例1；该对比例表明不采用重结晶最终获得的异秦皮苷的纯度仅为91.8％，效果不如本发明制备的异秦皮苷原料药纯度。
对比例6：除步骤一的提取溶剂为丙酮外，其余同实施例1；该对比例表明不采用优选的提取溶剂提取最终获得的马钱苷的得率仅为0.07％，效果差于本申请的效果；
对比例7：除步骤一的提取溶剂为30％的乙醇外，其余同实施例1；该对比例表明采用高于优选提取溶剂比例范围的溶剂提取最终获得的异秦皮苷的得率仅为0.06％，效果差于本申请的效果。
对比例8：除步骤二的萃取有机溶剂为正丁醇外，其余同实施例二；该对比例表明不采用乙酸乙酯萃取最终获得的异秦皮苷的得率仅为0.05％，效果差于本申请的效果。
对比例9：除步骤三的萃取有机溶剂为二氯甲烷外，其余同实施例三；该对比例表明不采用乙酸乙酯萃取最终获得的异秦皮苷的得率仅为0.06％，效果差于本申请的效果。
对比例10：除大孔吸附树脂柱为DA201外，其余同实施例1；该对比例表明不采用优选的大孔吸附树脂进行柱层析最终获得的异秦皮苷的得率仅为0.04％，纯度仅为95.0％，效果差于本申请的效果。
从下面的表1中可以看出，本发明申请工艺流程简单，样品损耗少，节约溶剂和时间，异秦皮苷原料药得率、纯度均高，更适合工业化生产；此外，与对比例1-10相比，本发明特定选择溶剂提取-有机溶剂萃取-大孔吸附树脂-聚酰胺树脂-有机溶剂萃取-重结晶等分离步骤，以及对制备过程中的工艺条件进行特定的选择等，这些对最终产物的得率和纯度有重要的影响。
表1对比实验结果表
本发明的一种异秦皮苷的制备方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S10：将中药藤梨根的干燥根粉碎，加入提取溶剂回流提取，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；
步骤S20：利用有机溶剂对浓缩液进程萃取处理，合并有机相，回收有机溶剂，获得第一萃取物；
步骤S30：将第一萃取物用第一溶剂溶解，依次经大孔吸附树脂柱层析和聚酰胺树脂柱层析；后再次利用第一溶剂进行梯度洗脱，以硅胶薄层层析或HPLC检查，收集合并含有异秦皮苷的洗脱液，减压浓缩，得富含异秦皮苷浓缩液；
步骤S40：将富含异秦皮苷的浓缩液，用选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯或正丁醇的有机溶剂萃取，合并有机相，回收有机溶剂，获得第二萃取物；
步骤S50：利用第二溶剂对第二萃取物进行重结晶处理，随后干燥，制得异秦皮苷。
2.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S10中，所述提取溶剂的质量为中药藤梨根的8-15倍；回流提取2-3次，每次提取时间为2-3小时。
3.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S10中，所述提取溶剂选自水、甲醇、乙醇或其混合物。
4.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S10中，所述提取溶剂为水和乙醇的混合物，乙醇浓度为10-95％；提取温度大于等于70℃，小于提取溶剂的沸点温度。
5.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S20中，所述有机溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丙酯。优选地，有机溶剂为乙酸乙酯。
6.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S20中，所述有机溶剂的用量为浓缩液体积的1-3倍；萃取处理3-5次。
7.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S30中，所述第一溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮或其混合物；
优选地，步骤S30中，第一溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为20-50％。
8.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S30中，大孔吸附树脂选自AB-8、D101、HP-20、ADS-17、HPD100、NKA-9或DM-301；聚酰胺树脂选自醇溶性聚酰胺树脂或苯溶性聚酰胺树脂。
9.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S30中，用于梯度洗脱的洗脱溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为10-95％。
10.根据权利要求1所述的异秦皮苷原料药的制备方法，其特征在于，步骤S50中，第二溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇或其混合物。更为优选地，第二溶剂为乙酸乙酯或丙酮或二者混合物。
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