CN110831953B

CN110831953B - 从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法

Info

Publication number: CN110831953B
Application number: CN201880038007.9A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 刘立辉; 郭杏林; 陈小春
Original assignee: Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd
Current assignee: Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2038-06-21
Also published as: WO2019241947A1; CN110831953A

Abstract

从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法，涉及植物提取物中单体的分离纯化的技术领域，旨在解决现有方法存在的工艺复杂、制备成本高、污染环境等技术问题。该方法包括：1）用体积分数88%‑96%丙酮水溶液对淫羊藿提取物进行打浆；2）过滤，收集滤饼，用体积分数50%‑75%乙醇水溶液溶解滤饼；3）溶解完毕后，过滤，收集滤液，将滤液浓缩去除乙醇后得浓缩液；4）在第一温度下，向浓缩液中加入丙酮均匀混合，待充分溶解后，将温度降低至第二温度，进行结晶；5）待结晶完毕后，过滤，收集滤饼，滤饼经干燥处理后即得淫羊藿苷粗品。应用该方法可获得含量高达98%以上的淫羊藿苷单体，足以满足注射剂的高纯度要求。

Description

从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法

技术领域

本发明涉及植物提取物中单体的分离纯化的技术领域，具体涉及从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法。

背景技术

淫羊藿提取物是指采用现代中药提取技术将主要有效成分黄酮类化合物从淫羊藿药材中提取出来而得到的产物，包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、宝藿苷等200多种成分，又名淫羊藿总黄酮。

淫羊藿苷是淫羊藿提取物中含量占比最多的成分，也是淫羊藿药材中极为重要的药效成分，具有增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，以及补肾壮阳、抗衰老等功效，其结构式如下图所示。

淫羊藿苷单体的制备多采用从淫羊藿提取物中分离纯化的途径，目前现有技术中公开的分离纯化方法较为常见的有大孔树脂吸附法、柱层析法、色谱仪制备法和溶剂萃取法，但是这些方法具有工艺复杂、制备成本高、污染环境等缺点。如中国专利申请CN103288902A公开了一种从淫羊藿中提取淫羊藿苷的制备方法，该方法中采用大孔树脂对淫羊藿提取物进行分离纯化，过程中使用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，操作繁琐，且产生大量洗脱液，浓缩过程耗时耗能，同时会产生大量废水。再如中国专利申请CN101607976A公开了一种淫羊藿苷的制备方法，该方法先依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇反复萃取淫羊藿提取物至近无色，回收萃取溶剂后再依次进行硅胶柱色谱分离和聚酰胺柱色谱分离，工艺极其复杂，且使用了多种毒性强的有机溶剂，不利于环保。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法，旨在解决现有方法存在的工艺复杂、制备成本高、污染环境等技术问题。

为实现上述目的，发明人进行了大量的实验探索，研究发现，虽然淫羊藿苷与淫羊藿提取物中的其他很多成分的结构和极性十分相近，不易分离，但是这些成分在不同溶剂中的溶解性却有着挺大差异。譬如，朝藿定A、B、C等在水中的溶解性比淫羊藿苷要好，宝藿苷等在丙酮中的溶解性较好，而淫羊藿苷在70％丙酮水溶液、70％乙醇水溶液中的溶解度最大，等等。于是利用这个发现，发明人开发了一种从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的新方法，包括如下步骤：1)用体积分数88％-96％丙酮水溶液对淫羊藿提取物进行打浆；2)过滤，滤去宝藿苷Ⅰ等杂质，收集滤饼，用体积分数50％-75％乙醇水溶液溶解滤饼；3)溶解完毕后，过滤，滤去不溶物，收集滤液，将滤液浓缩去除乙醇后得浓缩液；4)在第一温度下，向浓缩液中加入丙酮均匀混合，待充分溶解后，将温度降低至第二温度，进行结晶；5)待结晶完毕后，过滤，收集滤饼，滤饼经干燥处理后即得淫羊藿苷粗品。

本发明提供的分离纯化方法适用于从淫羊藿苷的含量范围≥10％的淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷。

上述步骤1)中的打浆具体是指向固体物质中加入某种对目标物质溶解度较低而对其他物质有较高溶解度的溶剂，通过搅拌使其他不需要的物质溶解在溶剂中，而目标物质与溶剂呈悬浊状态的过程。

本发明中的过滤是指采用物理方法将溶液中的固体和液体进行分离的过程，常见的过滤方法均适用于本发明，包括常压过滤、减压过滤、离心过滤等。

本发明中的浓缩是指采用物理方法使溶剂蒸发而提高溶液的浓度的过程，包括减压蒸馏法、超过滤法、透析法、吸附法、冷冻干燥法等。

优选地，所述步骤1)中的丙酮水溶液的浓度为体积分数89％-92％。

更优选地，所述步骤1)中的丙酮水溶液的浓度为体积分数90％。

优选地，所述步骤1)中的丙酮水溶液的用量为2-10ml/g淫羊藿提取物。

更优选地，所述步骤1)中的丙酮水溶液的用量为5ml/g淫羊藿提取物。

优选地，控制所述步骤2)的溶解过程在50-70℃温度下进行。

更优选地，控制所述步骤2)的溶解过程在55-65℃温度下进行。

更优选地，控制所述步骤2)的溶解过程在60℃温度下进行。

为加速溶解，优选所述步骤2)的溶解过程在搅拌下进行。

优选地，所述步骤2)中的乙醇水溶液的浓度为体积分数60％-75％。

更优选地，所述步骤2)中的乙醇水溶液的浓度为体积分数70％。

优选地，所述步骤2)中的乙醇水溶液的用量为3-10ml/g滤饼干重。

更优选地，所述步骤2)中的乙醇水溶液的用量为5ml/g滤饼干重。

优选地，所述步骤3)中，溶解完毕后，趁热过滤。

优选地，所述步骤3)中，浓缩液的体积是滤液体积的1/5。

优选地，所述步骤3)的浓缩过程采用减压蒸馏法浓缩。

优选地，控制所述步骤3)的浓缩过程在80℃以下温度下进行。

为了提高浓缩效率，更优选地，控制所述步骤3)的浓缩过程在60-80℃温度下进行。

优选地，所述步骤4)中丙酮的加入量按体积比计为，丙酮：浓缩液＝3：7～3:2。

更优选地，所述步骤4)中丙酮的加入量按体积比计为，丙酮：浓缩液＝1:1～3：2。

优选地，所述第一温度是50-70℃。

更优选地，所述第一温度是55-65℃。

更优选地，所述第一温度是60℃。

优选地，所述第二温度是室温。

更优选地，所述第二温度是20-25℃。

更优选地，所述步骤4)的结晶过程在搅拌下进行，并且保持在第二温度下搅拌结晶的时间至少为1h。

进一步地，上述方法还包括如下步骤：6)在第三温度下，将步骤5)所得淫羊藿苷粗品溶解于体积分数30％-100％丙酮水溶液中；7)待充分溶解后，将温度降低至第四温度，进行结晶；8)待结晶完毕后，过滤，收集滤饼，滤饼经干燥处理后即得淫羊藿苷纯品。

优选地，所述步骤6)中的丙酮水溶液的浓度为体积分数30％-60％。

更优选地，所述步骤6)中的丙酮水溶液的浓度为体积分数50％-60％。

优选地，所述步骤6)中的丙酮水溶液的用量为25-35ml/g淫羊藿苷粗品干重。

更优选地，所述步骤6)中的丙酮水溶液的用量为29-32ml/g淫羊藿苷粗品干重。

更优选地，所述步骤6)中的丙酮水溶液的用量为30ml/g淫羊藿苷粗品干重。

为加速溶解，优选所述步骤6)的溶解过程在搅拌下进行。

优选地，所述第三温度是50-70℃。

更优选地，所述第三温度是55-65℃。

更优选地，所述第三温度是60℃。

优选地，所述第四温度是室温。

更优选地，所述第四温度是20-25℃。

更优选地，所述步骤7)的结晶过程在搅拌下进行，并且保持在第四温度下搅拌结晶的时间至少为1h。

本发明中所称的室温即2015版《中国药典》的凡例中记载的室温，也即常温，系指10-30℃。

本发明中的干燥处理包括常压干燥、减压干燥、冷冻干燥和喷雾干燥等。

有益效果：

与现有的从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法相比，本发明提供的方法具有如下优点：

1、工艺简单易操作，成本低廉，绿色无污染；

2、应用本发明方法获得的淫羊藿苷单体的纯度至少在90％以上；

3、应用本发明方法的较优选工艺可获得含量高达98％以上的淫羊藿苷单体，足以满足注射剂的高纯度要求，且其收率不低于80％。

附图说明

图1是本发明实施例1和2中使用的淫羊藿提取物的HPLC图谱；

图2是本发明实施例2得到的淫羊藿苷纯品的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明提供的方法的优选工艺包括如下步骤：

1)用体积分数88％-96％丙酮水溶液对淫羊藿提取物进行打浆，88％-96％丙酮水溶液的用量为2-10ml/g淫羊藿提取物；2)过滤，收集滤饼，用体积分数50％-75％乙醇水溶液50-70℃温度下溶解滤饼，边溶解边搅拌，50％-75％乙醇水溶液的用量为3-10ml/g滤饼干重；3)溶解完毕后，趁热过滤，收集滤液，将滤液于80℃以下温度下进行减压蒸馏浓缩至原体积的1/5后得浓缩液；4)在50-70℃温度下，按照体积比为丙酮：浓缩液＝3:7～3:2的量向浓缩液中加入丙酮，搅拌使两者均匀混合，待充分溶解后，将温度降低至室温，进行结晶，保持室温下搅拌结晶的时间至少为1h；5)待结晶完毕后，过滤，收集滤饼，滤饼经干燥处理后即得淫羊藿苷粗品。

如果要获得含量进一步提高的淫羊藿苷产品，本发明方法还包括如下步骤：6)将步骤5)所得淫羊藿苷粗品于50-70℃温度下溶解于体积分数30％-100％丙酮水溶液中，边溶解边搅拌，丙酮水溶液的用量为25-35ml/g淫羊藿苷粗品干重；7)待充分溶解后，将温度降低至室温，进行结晶，保持室温下搅拌结晶的时间至少为1h；8)待结晶完毕后，过滤，收集滤饼，滤饼经干燥处理后即得淫羊藿苷纯品。

上述工艺中的过滤均采用抽滤的方式，具体操作为：先将不低于400目的滤布或滤纸垫入布氏漏斗中，再将布氏漏斗与连接有真空泵的抽滤瓶紧密连接，然后将待过滤溶液倒入布氏漏斗中打开真空泵进行抽滤，直至滤液和滤饼充分分离。

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。

以下实施例中所使用的原料及试剂，除特别指明的以外，均为从市场中购入。

实施例1

对本发明方法的工艺条件优化实验

1、打浆用丙酮水溶液的浓度确定

(1)分别配制体积分数0-100％的等梯度浓度的丙酮水溶液，室温下，分别测试每种浓度的丙酮水溶液对淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ的溶解度，测试结果见表1。

表1

丙酮水溶液浓度	淫羊藿苷溶解度(mg/ml)	宝藿苷Ⅰ溶解度(mg/ml)
			0	0.49527	1.057788
10％	0.75283	0.145435
			20％	1.15249	0.681134
30％	1.89396	3.482554
			40％	2.68629	12.61701
50％	6.44322	27.04883
			60％	9.08015	101.0067
70％	9.29089	167.6433
			80％	8.84707	190.8692
90％	2.74241	272.0951
			100％	0.93333	64.83548

(2)用体积分数88.6％-96.5％丙酮水溶液对淫羊藿提取物进行打浆，该淫羊藿提取物选用西安惠博生物科技有限公司生产的淫羊藿提取物，其含有20％重量的淫羊藿苷，纯度为40％，其HPLC图谱如图1所示，打浆后过滤，所得滤饼中淫羊藿苷的含量、纯度和收率的数值见表2。

表2

丙酮水溶液浓度	纯度	含量	收率
				88.6％	92.44％	73.11％	74.0％
88.9％	91.99％	78.71％	80.2％
				89.9％	91.84％	77.65％	86.5％
90.8％	90.76％	77.13％	88.4％
				92.7％	89.90％	65.32％	86.2％
94.6％	87.89％	58.09％	83.8％
				96.5％	84.43％	59.55％	77.4％

讨论：打浆的目的在于保留淫羊藿苷，尽可能多的除去杂质，而宝藿苷Ⅰ是杂质中占比最高且较难除去的物质，故丙酮水溶液应选择对淫羊藿苷溶解度低且对宝藿苷Ⅰ溶解度高的浓度。同时，还应兼顾考虑打浆过滤后所得滤饼中淫羊藿苷的纯度、含量以及收率不能太低。综合表1和表2的数据，最终确定打浆用丙酮水溶液的浓度范围为体积分数88％-96％，优选为89％-92％，最优选为90％。

2、溶解滤饼用乙醇水溶液的浓度确定

室温下，分别配制体积分数0-100％的等梯度浓度的乙醇水溶液，分别测试每种浓度溶液对淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ的溶解度，测试结果见表3。

表3

讨论：用乙醇水溶液溶解滤饼的目的在于进一步除杂，便于提高后续结晶时的含量，故乙醇水溶液应选择对淫羊藿苷溶解度高且对宝藿苷Ⅰ溶解度低的浓度。同时，还应兼顾考虑后续结晶时的收率不能太低。综合表3数据，最终确定溶解滤饼用乙醇水溶液的浓度范围为体积分数50％-75％，优选为60％-75％，最优选为70％。

3、结晶条件确定

(1)通过对甲醇、乙醇和丙酮的水溶液进行淫羊藿苷的溶解度测试，最终选定丙酮的水溶液作为结晶过程的最佳有机溶剂。

(2)在丙酮水溶液中，溶液温度对淫羊藿苷的溶解度有较大影响，本发明方法的思路在于，在溶解度较大的温度范围内使淫羊藿苷溶解于丙酮水溶液中，然后通过将温度调整为具有较低溶解度的范围内，以使淫羊藿苷晶体从丙酮水溶液中析出，同时又确保杂质尽可能不析出，从而达到分离提纯的效果。经实验测定，淫羊藿苷在丙酮水溶液中的溶解度随着温度的升高而增大，随着温度的降低而减小，其中，溶解度在30℃时开始小幅增加，在50℃时开始显著增加。在50℃以下的温度范围内，溶解度普遍相对较小，溶解时对丙酮水溶液的需求量较大，不利于成本控制；而温度过高时则丙酮水溶液易沸腾，需要使用回流设备。因此最终确定：溶解淫羊藿苷的温度为50-70℃，优选为55-65℃，最优选为60℃；析晶时的温度为室温，即10-30℃，优选为20-25℃。

(3)结晶用丙酮水溶液的浓度确定

分别配制体积分数30％-100％的等梯度浓度的丙酮水溶液，并取等量的淫羊藿苷干燥品于55-65℃下分别搅拌溶解于前述配制好的各浓度的丙酮水溶液中，待充分溶解后降温至20～25℃，保持20～25℃下搅拌使晶体析出，1h后过滤，收集滤饼，分别测定每种浓度的丙酮水溶液中所获得的淫羊藿苷的含量及收率，结果见表4。

表4

丙酮水溶液浓度	含量	收率
			30％	96.92％	86.4％
40％	97.78％	84.7％
			50％	98.27％	82.2％
60％	98.93％	80.8％
			70％	99.08％	74.6％
80％	97.96％	76.3％
			90％	96.32％	83.8％
100％	94.85％	87.3％

讨论：结晶的目的在于尽可能提高产品含量，同时尽可能减少产品损失，综合表4数据，最终确定结晶用丙酮水溶液的浓度范围为体积分数30％-100％，优选为30％-60％，最优选为50％-60％。

实施例2

取西安惠博生物科技有限公司生产的淫羊藿提取物1000g(其中，淫羊藿苷含量为20％，纯度为40％，其HPLC图谱如图1所示)，用5000mL 90％丙酮水溶液常温打浆30min，过滤，滤饼用1000mL 70％乙醇水溶液60℃溶解1h，滤去不溶物，滤液减压浓缩除去乙醇，浓缩后溶液为200mL，加入200mL丙酮，保持温度60℃1h，降温至20-25℃结晶，搅拌保持1h，过滤，70℃干燥8h，称重为178.91g；滤饼再次用5400mL 50％丙酮水溶液60℃搅拌溶解1h，降温至20-25℃结晶，搅拌保持1h，过滤，滤饼50℃真空干燥，得到164.72g淫羊藿苷产品，检测其纯度为98.22％，含量98.08％，摩尔收率为82.36％。

实施例3

取西安惠博生物科技有限公司生产的淫羊藿提取物1000g(其中，淫羊藿苷含量为10％，纯度为40％)，用5000mL 90％丙酮水溶液常温打浆30min，过滤，滤饼用500mL 70％乙醇水溶液60℃溶解1h，滤去不溶物，滤液减压浓缩除去乙醇，浓缩后溶液为100mL，加入150mL丙酮，保持温度60℃1h，降温至20-25℃结晶，搅拌保持1h，过滤，70℃干燥8h，称重88.7g；滤饼再次用2600ml 60％丙酮水溶液60℃搅拌溶解1h，降温至20-25℃结晶，搅拌保持1h，过滤，滤饼50℃真空干燥，得到80.12g淫羊藿苷产品，检测其纯度为98.67％，含量98.49％，摩尔收率为80.12％。

Claims

1.从淫羊藿提取物中分离纯化淫羊藿苷的方法，其特征在于包括如下步骤：取淫羊藿提取物1000g，该提取物中淫羊藿苷含量为10%，纯度为40% ，用5000mL 体积分数为90%丙酮水溶液常温打浆30min，过滤，滤饼用500mL体积分数为70%乙醇水溶液60℃溶解1h，滤去不溶物，滤液减压浓缩除去乙醇，浓缩后溶液为100mL，加入150mL丙酮，保持温度60℃1h，降温至20-25℃结晶，搅拌保持1h，过滤，70℃干燥8h，称重88.7g；滤饼再次用2600ml体积分数为60%丙酮水溶液60℃搅拌溶解1h，降温至20-25℃结晶，搅拌保持1h，过滤，滤饼50℃真空干燥，得到80.12g淫羊藿苷产品。