CN104894182A - 一种异烟棒曲霉素c的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种异烟棒曲霉素C的制备方法，步骤：1）复苏固体培养基的配制；2）液体发酵培养基的配制；3）菌种复苏；4）发酵培养；5）过滤、萃取；6）粗制；7）精制，即得异烟棒曲霉素C。其优点是：1、本发明的培养基(复苏固体培养基、液体发酵培养基的配制)简单易得、成本低；真菌生长速度快、孢子活力高；提高了工作效率；2、污染小、效率高、产率高、纯度高，可操作性强。具体为：采用二氯甲烷取代氯仿，洗脱剂毒性减小；粗制仅需三种体系洗脱剂，步骤大大简化，精制采用恒梯度以甲醇-水洗脱，操作简单，减少了样品损失，提高了制备效率；产率提高了约5倍，即由6.8μg/mL提高到33μg/mL；结合高效液相色谱制备，目标产物的纯度高达99.3%。

Description

一种异烟棒曲霉素C的制备方法

技术领域

本发明属于生物碱类化合物的制备技术领域，具体涉及一种异烟棒曲霉素C的制备方法。 

背景技术

据世界卫生组织（WTO）估计，每天约5万人死于感染性疾病。革兰阳性菌（如葡萄球菌和链球菌）是引起人类感染甚至导致死亡的主要致病菌。其中葡萄球菌可引起轻度皮肤脓疱症、呼吸道感染和脓毒症等多种疾病，严重者可导致死亡。肺炎链球菌主要引起急性呼吸道感染, 如中耳炎、咽炎、鼻窦炎和肺炎等。此外, 肺炎链球菌和其他链球菌也可引起皮肤感染、脑膜炎和脓毒症，这些感染性疾病给人类带来了极大的痛苦。目前针对革兰氏阳性菌感染的药物主要为抗生素类药物，如青霉素、头孢类、红霉素、喹诺酮类等药物。近年来致病菌的多重耐药性已严重影响抗菌药的临床疗效，革兰氏阳性菌耐药性问题尤为突出, 以葡萄球菌、链球菌和肠球菌的耐药性最为常见和严重。如何克服抗生素耐药性，成为人们关注和研究的热点之一。如何更有效地解决这个问题，当务之急就是寻找并开发新型有效的抗菌药。本发明旨在提供一种具有抗革兰氏阳性菌活性的异烟棒曲霉素C（Roquefortine C），其结构如式如下：

它是一种具有较强的革兰氏阳性菌抑制活性的生物碱类化合物，可作为革兰氏阳性菌抑制剂用于由革兰氏阳性菌感染所导致的疾病的治疗，还可作为抑制革兰氏阳性菌的低分子生物探针，用于生命科学研究，为进一步研发新型抗菌药提供了备选药物。本发明从印度洋深海沉积物来源的青霉菌Penicillium sp. Y32中，分离得到了异烟棒曲霉素C，通过反复实验、探索，得到了规模化生产异烟棒曲霉素C较佳的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种操作方便、产率高、产品纯度高的异烟棒曲霉素C的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）复苏固体培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%、琼脂 1.8~2.3%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；在生物安全柜中，将经过灭菌后的复苏培养基在温度大于40℃时，倒入经过灭菌的培养皿中，自然冷却备用；

2）液体发酵培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；将该培养基倒入烧瓶中，封口、灭菌备用；

3）菌种复苏: 取一定量的青霉菌Penicillium sp.Y32，将其接种到步骤1所述的复苏固体培养基上，放入25℃～30℃恒温培养箱中，培养一至两天；

4）发酵培养：在生物安全柜中，将步骤3中在复苏固体培养基上培养出的菌种孢子，接种到步骤2 所述的含有液体培养基的烧瓶中，在温度为25℃～30℃恒温静置培养25-35天；

5）过滤、萃取：将步骤4所得的菌液与菌丝体进行过滤、分离；

取菌液，用1~2倍体积的乙酸乙酯，超声萃取三次；

取菌丝体，先用80%丙酮水溶液浸泡2～4小时，超声、机械破碎，过滤后的混合液蒸发掉丙酮后，采用1~2倍体积的乙酸乙酯超声萃取三次；

合并两者的乙酸乙酯萃取物；

6）粗制：将步骤5所得的乙酸乙酯萃取物进行浓缩，与100-300目的硅胶拌样；将拌样硅胶加到3倍体积的300-400目的硅胶柱层析上，依次使用二氯甲烷、60:1的二氯甲烷-甲醇、30:1的二氯甲烷-甲醇三种溶剂进行系统洗脱；将使用30:1的二氯甲烷-甲醇所得的洗脱液进行收集，并浓缩至固态，得到粗品；

7）精制：将上述粗品使用甲醇进行溶解、用滤膜过滤，滤液加载于高效液相色谱仪以一定的流速，进行分离纯化，洗脱溶剂使用80:20的甲醇-水，从而得到异烟棒曲霉素C。

优选的，步骤2）中，所述复苏固体培养基中，上述麦芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨0.2%、琼脂2% 。

优选的，步骤2）中，所述液体发酵培养基中，上述麦芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨0.2%。

优选的，步骤6）中，所述拌样硅胶为200目。

优选的，步骤7）中，所述高效液相色谱的流速为2~3 mL/min 。

优选的，步骤7）中，所述滤膜为0.45mm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明的培养基简单易得、成本低，青霉菌Penicillium sp. Y32复苏所需的时间仅需一、二天，比传统培养基的复苏时间至少缩短两天；配合较高的培养温度（28℃），真菌生长速度快、孢子活力高；在发酵培养中，选用直接接种到液体培养基中，相比传统的种子液培养，传代的时间极大缩短，提高了工作效率；本发明提供的发酵方法，简单易行。2、本发明相比文献报道的普通分离方法，污染小、效率高、产率高、纯度高，可操作性强。具体为：（1） 采用二氯甲烷取代氯仿，洗脱剂毒性减小。（2） 粗制仅需三种体系洗脱剂，步骤大大简化，精制采用恒梯度以甲醇-水（80：20）洗脱，促使操作简单，减少由于步骤繁琐造成的样品损失，提高了制备效率。（3） 结合高效发酵培养与简易分离步骤，比现有技术的产率提高了约5倍，即由6.8 μg/mL提高到33 μg/mL。（4）结合高效液相色谱制备，目标产物的纯度高达99.3%。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步描述：

实施例一

按照水：麦芽浸膏：大豆蛋白胨：琼脂=100：1.6：0.2：2的重量百分比，配制复苏固体培养基，使得其 pH值为5.5；将一定量的青霉菌Penicillium sp. Y32接种到上述复苏固体培养基上，在28℃培养箱中恒温培养2天；按照水：麦芽浸膏：大豆蛋白胨=100：1.6：0.2的重量百分比，配制液体培养液，使得其 pH值为5.5；取复苏固体培养基上的青霉菌Penicillium sp.Y32适量，将其接种到装有上述液体培养液的三角瓶中，进行为期30天的恒温28℃的静置培养。

30天后，经过过滤，先将与菌丝体相分离的发酵液亦即菌液，采用等体积的乙酸乙酯将发酵液萃取三次，合并萃取液，获得发酵液的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至固态；

再将菌丝体先用80%丙酮水溶液浸泡4小时、机械破碎、水浴超声提取60分钟；经三次提取后，合并三次所得的菌丝体提取液；将该菌丝体提取液减压浓缩至不含丙酮，得到的菌丝体提取物，使用等体积的乙酸乙酯萃取三次，得到菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液；再将该萃取液减压浓缩至固态；

合并前述两种萃取物（即浓缩至固态的发酵液的乙酸乙酯萃取液、菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液）经甲醇溶解后， 与200目的硅胶拌样后加到3倍体积的300目的硅胶柱层析上，依次使用纯二氯甲烷、体积百分比为60:1的二氯甲烷-甲醇、体积百分比为30:1的二氯甲烷-甲醇的溶剂进行三次系统洗脱；只收集其中最后一次---即使用30:1的二氯甲烷-甲醇得到的洗脱液，减压浓缩得到粗品；将粗品先用甲醇溶解，再以流速为2mL/min、体积百分比为80:20的甲醇-水进行洗脱，经高效液相色谱HPLC分离，制得异烟棒曲霉素C。

实施例二

按照水：麦芽浸膏：大豆蛋白胨：琼脂=100：1.7：0.3：2.1的重量百分比，配制复苏固体培养基，使得其 pH值为6；将一定量的青霉菌Penicillium sp. Y32接种到上述复苏固体培养基上，在28℃培养箱中恒温培养2天；按照水：麦芽浸膏：大豆蛋白胨=100：1.7：0.3的重量百分比，配制液体培养液，使得其 pH值为6；取复苏固体培养基上的青霉菌Penicillium sp.Y32适量，将其接种到装有上述液体培养液的三角瓶中，进行为期28天的恒温28℃的静置培养。

28天后，经过过滤，先将与菌丝体相分离的发酵液亦即菌液，采用等体积的乙酸乙酯将发酵液萃取三次，合并萃取液，获得发酵液的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至固态；

再将菌丝体先用80%丙酮水溶液浸泡3小时、机械破碎、水浴超声提取70分钟；经三次提取后，合并三次所得的菌丝体提取液；将该菌丝体提取液减压浓缩至不含丙酮，得到的菌丝体提取物，使用等体积的乙酸乙酯萃取三次，得到菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液；再将该萃取液减压浓缩至固态；

合并前述两种萃取物（即浓缩至固态的发酵液的乙酸乙酯萃取液、菌丝体提取物的乙酸乙酯萃取液）经甲醇溶解后，与200目的硅胶拌样后加到3倍体积的300目的硅胶柱层析上，依次使用纯二氯甲烷、体积百分比为60:1的二氯甲烷-甲醇、体积百分比为30:1的二氯甲烷-甲醇的溶剂进行三次系统洗脱；只收集其中最后一次---即使用30:1的二氯甲烷-甲醇得到的洗脱液，减压浓缩得到粗品；将粗品先用甲醇溶解，再以流速为3mL/min、体积百分比为80:20的甲醇-水进行洗脱，经高效液相色谱HPLC分离，制得异烟棒曲霉素C。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）复苏固体培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%、琼脂 1.8~2.3%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；在生物安全柜中，将经过灭菌后的复苏培养基在温度大于40℃时，倒入经过灭菌的培养皿中，自然冷却备用；

2）液体发酵培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；将该培养基倒入烧瓶中，封口、灭菌备用；

3）菌种复苏: 取一定量的青霉菌Penicillium sp.Y32，将其接种到步骤1所述的复苏固体培养基上，放入25℃～30℃恒温培养箱中，培养一至两天；

4）发酵培养：在生物安全柜中，将步骤3中在复苏固体培养基上培养出的菌种孢子，接种到步骤2 所述的含有液体培养基的烧瓶中，在温度为25℃～30℃恒温静置培养25-35天；

5）过滤、萃取：将步骤4所得的菌液与菌丝体进行过滤、分离；

取菌液，用1~2倍体积的乙酸乙酯，超声萃取三次；

取菌丝体，先用80%丙酮水溶液浸泡2～4小时，超声、机械破碎，过滤后的混合液蒸发掉丙酮后，采用1~2倍体积的乙酸乙酯超声萃取三次；

合并两者的乙酸乙酯萃取物；

6）粗制：将步骤5所得的乙酸乙酯萃取物进行浓缩，与100-300目的硅胶拌样；将拌样硅胶加到3倍体积的300-400目的硅胶柱层析上，依次使用二氯甲烷、60:1的二氯甲烷-甲醇、30:1的二氯甲烷-甲醇三种溶剂进行系统洗脱；将使用30:1的二氯甲烷-甲醇所得的洗脱液进行收集，并浓缩至固态，得到粗品；

7）精制：将上述粗品使用甲醇进行溶解、用滤膜过滤，滤液加载于高效液相色谱仪以一定的流速，进行分离纯化，洗脱溶剂使用80:20的甲醇-水，从而得到异烟棒曲霉素C。

2.根据权利要求1所述的异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述复苏固体培养基中，上述麦芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨0.2%、琼脂2% 。

3.根据权利要求2所述的异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述液体发酵培养基中，上述麦芽浸膏1.6%、大豆蛋白胨0.2%。

4.根据权利要求1至3任一所述的异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：步骤6）中，所述拌样硅胶为200目。

5.根据权利要求4所述的异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：步骤7）中，所述高效液相色谱的流速为2~3 mL/min 。

6.根据权利要求5所述的异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：步骤7）中，所述滤膜为0.45mm。