FI91067B - Alkaloididimeerien valmistus käyttäen ferri-ionia - Google Patents

Description

91067

Alkaloididimeerien valmistus käyttäen ferri-ionia Keksinnön ala Tämä keksintö koskee alkaloidiyhdisteitä, jotka 5 ovat hyödyllisiä kasvaimia estävinä aineina ja kasvaimia estävien aineiden edeltäjäyhdisteinä. Tarkemmin sanoen se koskee 3',4'-anhydrobinblastiinin ja vinblastiinin valmistusta, jotka molemmat ovat dimeerisiä indolialkaloideja, joita luonnossa tuottaa Catharanthus roseus -kasvi.

10 Keksinnön tausta

Lukuisat luonnossa esiintyvät alkaloidit, joita tavataan madagaskarilaisessa talvikkikasvissa Catharanthus roseus (tunnetaan myös nimillä Vinca rosea ja Lochnera rosea), ovat hyväksyttäjä kasvaimia estäviä lääkkeitä.

15 Suurin kaupallinen mielenkiinto on vinkristiinillä ja vinblastiinilla, jotka on hyväksytty syöpien hoitoon. Vinkristiini on aktiivinen aine leukemian, imukudoskasvaimien ja kiinteiden kasvaimien hoidossa. Vinblastiinilla on vastaavaa aktiivisuutta ja se on myös aktiivinen aine 20 Hodgkinin taudin hoidossa.

Sekä vinblastiinia että vinkristiiniä saadaan nykyään uuttamalla kasveista, jotka on korjattava talteen ja kuivattava ennen kuin lääkkeet voidaan uuttaa. Kasviuutteen monimutkaisuus (sen sisältäessä vähintään 200 25 eri alkaloidia) ja haluttujen alkaloidien pienet pitoisuudet (kuivapainosta 0,0003 % vinblastiinia) tekevät uuttoprosessin sekä pitkäksi että kalliiksi. Uuttomenet-telylle luontaiset ongelmat tekevät vinkristiinin ja vinblastiinin tuotannon vaihtoehtoisten menetelmien kehittä-30 misen houkuttelevaksi.

Vinkristiiniä voidaan valmistaa kemiallisesti vin-blastiinista. Vinblastiinia voidaan puolestaan valmistaa kemiallisesti katarantiinista ja vindoliinista, jotka molemmat ovat luonnon indolialkaloideja, joita esiintyy 35 Catharanthus roseus -kasvissa, välituotemateriaalin, 31,41-anhydrovinblastiinin (A-VLB) kautta. Katarantiini 2 ja vindoliini voidaan kemiallisesti yhdistää käyttäen perhappoa (esim. m-klooriperbentsoehappoa) katarantiinin konvertoimiseksi N-oksidikseen, mitä seuraa N-oksidin Polonovski-tyyppinen fragmentointi, joka initioidaan li-5 säämällä trifluorietikkahappoa luonnon dimeerin muodostamiseksi. Pelkistävää ainetta, kuten natriumboorihydridiä lisätään sitten seokseen 31,41-anhydrovinblastiinin (A-VLB) tuottamiseksi, joka voidaan konvertoida vinblastiiniksi ja edelleen vinkristiiniksi edelleen hapettamalla. Kelo miallinen kokonaisreaktiokaavio voidaan näin ollen esittää seuraavasti:

Katarantiini-N-oksidi + vindoliini 15 v 3',4'-anhydrovinblastiini

Vinblastiini -> Vinkristiini 20 3',4'-anhydrovinblastiinilla (A-VLB) on itsellään ilmoitettu olevan voimakasta solun kasvua estävää aktiivisuutta ja se osoittaa itse asiassa pienempää myrkyllisyyttä kuin kumpikaan vinkristiinistä ja vinblastiinista.

Se on olennainen vinblastiini- ja vinkristiinisynteesin 25 edeltäjäyhdiste. Kutney, "Pure and Applied Chemistry", 54, 2523 (1982) ja Scott et ai., "Heterocycles" 9, 1419 (1978) ovat osoittaneet, että A-VLB voidaan muodostaa entsymaattisesti vindoliinista ja katarantiinista käyttäen C. roseus -kasvin lehdistä saatuja soluttomia uuttei-30 ta. Ilmoitetut saannot ovat kuitenkin erittäin pieniä.

Katarantiinin ja vindoliinin kemiallinen yhdistä-misreaktio voidaan yksinkertaisessa muodossa esittää seuraavasti : 91067 3

Reaktiokaavio co2ch3 ch3 0 25 0020¾ 10

Katarantiini Vindoliini H ✓ ^ / r=co2ch5 20 .

ΓθΤ ^ OhJ^ 25 ch3o^-^n^P^oc-ch3 CH3 r 0

Iminiunvälituote t 3',4'-anhydrovinblastiini Vinblastiini 4 Tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusi menetelmä katarantiinin ja vindoliinin yhdistämiseksi di-meeristen alkaloidien muodostamiseksi.

Muuna tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan 5 menetelmä vinblastiinin ja 3',4'-anhydrovinblastiinin valmistamiseksi.

Keksinnön yhteenveto Tässä keksinnössä monomeeriset alkaloidit vindo-liini ja katarantiini yhdistetään, kun läsnä on katalyytit) tisesti tehokas määrä ferri-ionia. Reaktiotuotteet sisältävät 3',41-anhydrovinblastiinia ja vinblastiinia pääkom-ponentteina. Vähemmän merkittävät määrät katariinia ja leurosiinia voi myös olla seurauksena reaktiosta. Määrää, jossa kutakin eri reaktiotuotteista muodostuu, voidaan 15 manipuloida jossain määrin muuttamalla reaktio-olosuhteita, mitä selostetaan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.

Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus

Jokaista vaadituista reagensseista on nykyään saatavissa kaupallisesti. Monomeeriset alkaloidit vindoliini 20 ja katarantiini ovat saatavissa suolamuodossa, esim. vin-doliini-HCl:na ja katarantiinisulfaattina ja voidaan käyttää sellaisenaan reaktioon. Vaihtoehtoisesti monomeerit voidaan uuttaa C. roseus -kudoksesta alalla kuvatuilla menetelmillä: ks. esimerkiksi US-patentti 1 094 552, jul-25 kaistu 27.1.1981.

Ferri-ionin lähde voi vaihdella edellyttäen, että ferri-ioni vapautuu reaktioväliaineessa ja tämän vuoksi on käytettävissä osallistumaan reaktioon. Yhdisteitä, joissa ferri-ioni on kelatoituneena voimakkaasti, kuten 30 Fe^+:EDTA-kompleksia ja ferripyrofosfaattia tulee välttää. Sopivampia Fe^+-lähteitä ovat sulfaatti-, ammoniumsulfaat-ti-, monofosfaatti-, kloridi- ja nitraattisuolat.

Reaktio suoritetaan yksinkertaisesti lisäämällä katalyyttisesti tehokas määrä ferri-ionia reaktioväliai-35 neeseen, joka sisältää vindoliinia ja katarantiinia. Vaikka reaktio tapahtuu puskuroimattomassa, vesipitoisessa I! 91067 5 väliaineessa huoneen lämpötilassa, on toivottavaa säätää reaktion kulkua haluttujen dimeeristen alkaloidien tuotannon maksimoimiseksi. Esimerkiksi reaktio kykenee tapahtumaan muodostamalla A-VLB ja vinblastiinia alun alkaen.

5 Näiden dimeerien jatkuva hapettuminen johtaa muihin tuotteisiin, kuten vinblastiiniin, katariiniin, leurosiiniin, vinamidiiniin ja 3-R-hydroksivinamidiiniin, suhteellisten määrien riippuessa reaktio-olosuhteista. Näin ollen A-VLB:n ja vinblastiinin tuotanto voidaan optimoida mui-10 den dimeerien muodostuksen rajoittamiseksi ja saantojen maksimoimiseksi. Tässä tarkoituksessa sellaisia tekijöitä kuin pH-arvoa, reaktiolämpötilaa, ferri-ionipitoisuutta, reaktioväliainetta ja reaktioaikaa voidaan manipuloida ottaen erityisesti huomioon A-VLB:n ja/tai vinblastiinin 15 tuottamisen taloudellisesti merkittävillä saannoilla niiden toivotun farmaseuttisen hyödyn ollessa annettu.

Reaktioväliaine voidaan valita useista eri liuottimista. Vesipitoista väliainetta voidaan käyttää. Vaikka vettä sellaisenaan voidaan käyttää, laimeat mineraalihap-20 pojen, kuten HCl:n, HjSO^sn, ΗΝΟ^:η, H^PO^sn yms. vesi-liuokset ovat yhtä hyödyllisiä ja itse asiassa ne ovat joissakin tapauksissa edullisia, koska ne myötävaikuttavat kykyyn säätää reaktionopeuksia. Vesipitoisia orgaanisia happoja, kuten etikkahappoa, voidaan myös käyttää.

25 Lisäksi veteen sekoittuvia, aproottisia liuottimia, kuten dimetyyliformamidia ja tetrahydrofuraania voidaan haluttaessa käyttää. Edelleen voidaan käyttää liuotinsys-teemiä, joka auttaa ajamaan reaktiota kohti tuotteen muodostusta. Tällainen liuotinsysteemi sallii dimeeristen 30 tuotteiden erottumisen katalyytistä dimeerimuodossa. Sopivia systeemejä voivat olla kaksifaasiset liuotinsystee-mit, jotka sisältävät hydrofobisen komponentin, kuten me-tyleenikloridia, hiilitetrakloridia, kloroformia ja muita halogenoituja alempia hiilivetyjä, etyyliasetaattia ja 35 eettereitä, kuten dietyylieetteriä tms. ja hydrofiilisen, ts. veteen sekoittuvan komponentin, kuten edellä kuvattuja 6 vesipitoisia liuottimia. Liuotinseoksen jatkuvalla sekoituksella dimeeriset tuotteet ajetaan hydrofobiseen faasiin, josta ne voidaan uuttaa tunnetulla tekniikalla. Katalyytti voidaan haluttaessa ottaa talteen vesifaasista.

5 pH-arvo, jossa reaktio tulee suorittaa, vaihte- lee riippuen halutusta tuotteesta. pH-arvolla on huomattava vaikutus muodostuneen tuotteen tyyppiin ja sitä voidaan säätää suoraan, kun mineraalihappojen ja/tai orgaanisten happojen vesiliuokset muodostavat reaktioväliai-10 neen yksinkertaisesti seuraamalla pH-arvoa hapon lisäyksen aikana tai määräämällä kvantitatiivisesti vaadittu hapon vahvuus tai tilavuus ennen reaktion aloittamista 3+

Fe :n lisäyksellä. Kun vettä käytetään liuottimena, reak-tioväliaine voidaan sopivasti puskuroida esim. glysiinil-15 lä halutun pH-alueen ylläpitämiseksi. On pidettävä mielessä, että Fe^+:n lisääminen väliaineeseen alentaa itsessään väliaineen pH-arvoa, tuloksena olevan pH-arvon 3 + heijastaessa Fe :n lopullista pitoisuutta väliaineessa.

Tässä yhteydessä edullisimmissa olosuhteissa 20 A-VLB:n tuotanto on maksimissaan pH-arvolla n. 1,50 ja alle sen. Korkeampi pH-arvo esim. välillä 1,50 - 40 parantaa selvästi suhteellista vinblastiinin saantoa verrattuna alempiin pH-tasoihin, vaikka A-VLB on yhä vallitseva dimeeri reaktiotuotteissa. Nämä alemmat pH-alueet 25 heijastavat A-VLB:n ja vinblastiinin suhteellisia saantoja, kuten havaitaan 4°C:ssa, mutta tämä ei välttämättä pidä tarkasti paikkaansa.

Lämpötila, jossa reaktio on suoritettava, voi vaihdella laajalla alueella. Koska lämpötila on tehokas 30 tapa säätää reaktionopeutta, se on parametri, jolla reaktiotuotteiden muodostusta on edullista manipuloida. Korkeammissa lämpötiloissa, esim. huoneen lämpötilasta n. 40°C:seen, reaktio tapahtuu hyvin nopeasti, mikä vaatii tarkasti ajoitettua pelkistysaineen lisäystä reaktion 35 etenemisen pysäyttämiseksi, kun halutun dimeerin esiintyminen on maksimissaan. Edelleen korkeisiin lämpötiloihin 91067 7 liittyy tavallisesti kasvanut reaktiivisuus ilmakehän hapen kanssa, joka voi hapettaa A-VLB:n ja vinblastiinin epämieluisiksi dimeereiksi. Näin ollen kun halutaan saada A-VLB ja vinblastiinia ja reaktio suoritetaan korkeam-5 missä lämpötiloissa, reagenssit tulee saattaa inerttiin atmosfääriin, esim. N2:een paremman hallinnan aikaansaamiseksi muodostuneen tuotteen tyypin suhteen. Voidaan suorittaa hapen skrubbaus.

Suorittamalla reaktio alemmissa lämpötiloissa reak-10 tionopeutta säädetään tehokkaammin ja pelkistysaineen lisäyksen tarkasta ajoituksesta reaktion pysäyttämiseksi tulee joustavampi. Reaktio 10°C:ssa ja alempana, esim.

4°C:ssa pienentää A-VLB:n ja vinblastiinin hapettumisno-peutta niin, että tarve operoida inertissä atmosfäärissä 15 voidaan eliminoida käytännön syistä. Glysiinipuskuri näyttää aikaansaavan parantuneen vinblastiinin tuotannon ja sen käyttö on tämän vuoksi edullista, kun puskuria käytetään matalissa lämpötiloissa. Muita puskureita, kuten fosfaattia, Tris-tuotetta yms. voidaan käyttää, mutta on 20 huolellisesti valittava puskuri, joka ei sido ferri-ionia.

Reaktion eteneminen riippuu myös ferri-ioniväke-vyydestä väliaineessa. Edulliset, katalyyttisesti tehokkaat määrät ferri-ionia ilmoitettuna loppuväkevyyksinä 4 3+ vaihtelevat välillä 1-10 mol Fe moolia kohti kata-25 rantiinia. Vielä edullisemmat Fe^+:n loppuväkevyydet vaihtelevat välillä n. 400:1 - 1 000:1. Moolisuhteen vertaaminen katarantiiniin heijastelee sitä, minkä katsotaan nykyään teoreettisesti olevan reaktiomekanismi. Arvellaan, että ferri-ioni muodostaa kompleksin katarantiinin kanssa 30 aiheuttaen elektronin siirron, mikä edistää sopivaa liit- 3+ tyrnistä vindoliiniin. Näin ollen Fe -väkevyys yhdessä suhteellisen katarantiiniväkevyyden kanssa on todennäköisesti ensimmäinen säätötekijä reaktiossa.

Riippumatta valituista reaktio-olosuhteista, reak-35 tion eteneminen tulee pysäyttää lisäämällä pelkistysai-netta, kuten natriumboorihydridiä hetkellä, jolloin 8 halutun dimeerin väkevyys on huipussaan. Aikaisempi pel-kistysaineen lisäys estää dimeerin. A-VLB:n tai vinblas-tiinin talteenoton maksimisaannolla. Myöhäisempi pelkis-tysaineen lisäys sallii reaktion edetä yli vaiheen, jossa 5 A-VLB on vallitsevana ja jossa vinblastiinin muodostus on maksimissaan. Aikaväli, jona pelkistysaine lisätään, vaihtelee riippuen reaktio-olosuhteista, ferri-ioniväke-vyydestä jne. Esimerkiksi käytettäessä 100 mM ferriklori-dia ferri-ionilähteenä initioimaan 0,5 mg:n katarantiini-10 ja vindoliinimäärien yhteenliittyminen HCl:n vesiliuoksessa 4°C:ssa, maksimi A-VLB-saanto saadaan kolmen tunnin kuluttua. Käyttäen 20 mM FeCl^ia puskuroimattomassa vesi-väliaineessa, mutta muuten vastaavissa olosuhteissa, maksimi A-VLB toteutuu n. neljässä tunnissa. Maksimi vin-15 blastiinisaannot toteutuivat, kun vindoliinin ja kataran-tiinin 0,5 mg:n määrien reaktio, joka suoritettiin glysii-nipuskurissa, joka sisälsi 40 mM ferrikloridia, pysäytettiin kahden tunnin kuluttua. Näin ollen saattaa olla tarpeen analysoida reaktio kvantitatiivisesti ennen mittakaa-20 van suurentamista sopivan ajankohdan määrittämiseksi reaktion etenemisessä pelkistysaineen lisäykselle. Seuraavis-sa esimerkeissä hahmotellun kaltaiset kokeet ovat sopivia, vaikka vastaavien tällaisten kokeiden suunnittelu on täysin alaan perehtyneen hallinnassa.

25 Kun reaktio on lopetettu, dimeerit voidaan uuttaa polaarisiin orgaanisiin aineisiin, kuten etyyliasetaattiin ja puhdistaa käyttäen standardi kemian tekniikkaa.

Tämän keksinnön toteutusmuodoista esitetään esimerkkejä jäljempänä. Jokaisessa esimerkissä vinblastii-30 nin ja A-VLB:n läsnäolo varmistettiin massaspektrianalyy-sillä, ympyrädikroismianalyysillä ja UV-spektrillä. UV-spektri oli yhdenmukainen ensimmäisen derivaatan kanssa verrattaessa sitä tunnettuihin standardeihin. Ympyrädi-kroismi varmisti oc-liittymisen C-18-hiileen.

91067 9

Esimerkki 1

Tuoreet näytteet, jotka sisälsivät 0,5 mg kataran-tiinia (sulfaattisuolana) ja 0,5 mg vindoliinia (HCl-suo-lana) 0,1 M glysiinipuskurissa (pH 2,0 4°C:ssa), esijääh- 5 dytettiin 4°C:seen. Näihin seoksiin lisättiin vaihtelevia määriä vesipitoista varastoliuosta, joka sisälsi joko 1,2 M ferrikloridia tai 0,6 M ferrisulfaattia, mikä johti ferri-ionipitoisuuksiin, jotka vaihtelevat välillä 20 -100 mM 6,0 ml:n lopullisessa näytetilavuudessa. Kun reak- 10 tio oli initioitu ferriyhdisteellä, näytteitä ravistettiin 4°C:ssa ja reaktio sammutettiin 0,5, 1 ja 2 tunnin kestoajan kohdalla lisäämällä mooliylimäärä natriumboori-hydridiä ja 1,0 ml 14 M ammoniumhydroksidin vesiliuosta. Tulokset on lueteltu seuraavissa taulukoissa 1 ja 2.

15 Taulukko 1 3+

FeCl^ Fe -lähteenä [Fe^+] Aika A-VLB-saanto VLB-saanto (mM) (tuntia) (%) (%) 20 20 0,5 15,04 15,37 1.0 29,615 15,01 2.0 34,75 18,44 40 0,5 11,005 19,43 1.0 37,455 17,33 25 2,0 41,44 21,34 60 0,5 9,72 19,80 1.0 35,86 20,80 2.0 42,58 20,66 80 0,5 15,77 17,39 30 1,0 36,595 19,32 2.0 37,315 18,88 100 0,5 20,84 18,725 1T0 59,11 15,24 2.0 40,43 17,54 35 -------- 10

Taulukko 2

Fe2(SO^)2 Fe3+-lähteenä [Fe3+] Aika A-VLB-saanto VLB-saanto 5 (mM) (tuntia) _(_%j_ (%) 20 0,5 15,10 14,62 1.0 25,775 17,265 2.0 34,895 19,70 40 0,5 27,02 16,23 10 1,0 44,67 13,03 2.0 44,17 19,23 60 0,5 32,18 19,07 1.0 45,20 16,72 2.0 48,23 19,40 15 80 0,5 41,14 18,15 1.0 52,205 16,24 2.0 51,50 17,78 100 0,5 50,355 15,22 1.0 58,495 15,14 20 2,0 57,89 16,35

Reaktiossa tuotetut dimeeriset alkaloidit analysoitiin uuttamalla näytteet kolme kertaa 6,0 ml:11a etyy-25 liasetaattia (HPLC-laatu). Orgaaniset jakeet kerättiin yhteen, kuivattiin tyhjössä ja muodostettiin uudelleen 200 yulrlla HPLC-laatuista metanolia. Näytteiden HPLC-analyy-si suoritettiin C-8, 5 ^um-kolonnilla todettujen mielenkiintoisten piikkien UV-spektrianalyysin vastatessa 3',4'-30 anhydrovinblastiinia, vinblastiinia, leurosiinia ja kata-riinia. Suoritettiin TLC-analyysi piidioksidilla päällystetyillä levyillä, jotka kehitettiin ympäristön lämpötilassa eetteri:kloroformi:metanolilla (50:35:20), joka sisälsi 0,5 % (til.til) trietyyliamiinia. Sekä muodostetut 35 UV-spektrit että alkaloidien kehittäminen serium(4)-ammo- il 91067 11 niumsulfaatilla vahvistivat edellä mainittujen dimeerien läsnäolon.

Taulukoista 1 ja 2 käy ilmi, että jopa 21,34 %:n (paino-%) vinblastiinisaanto (40 mM ferrikloridi; t = 5 2 h) ja 59,11 %:n (paino-%) 3',4'-anhydrovinblastiinisaan- to (100 mM ferrikloridia; t = 1 h) toteutui.

Esimerkki 2 Näytteet, jotka sisälsivät 0,5 mg katarantiinia (sulfaattisuolana) ja 0,5 mg vindoliinia (HCl-suolana), 10 suspendoitiin kloorivetyhapon vesiliuokseen, jonka väkevyys vaihteli välillä 0,001 - 0,05 M ja jäähdytettiin 4°C:seen. Monomeerien kemiallinen yhdistäminen initioi-tiin lisäämällä ferrikloridin 1,2 M varastoliuosta 20 -100 mM:n lopullisiin ferritasoihin 6,0 ml:n kokonaisti-15 lavuudessa. Näytteitä ravisteltiin 4°C:ssa ja reaktio sammutettiin 0,5, 1, 2 ja 3 tunnin kestoajan kohdalla lisäämällä molaariset ylimäärät natriumboorihydridiä ja 1,0 ml 14 M ammoniumhydroksidin vesiliuosta. Tulokset on lueteltu jäljempänä olevassa taulukossa 3.

Taulukko 3 12 [HC1] [Fe^ ] pH* Aika A-VLB-saanto VLB-naanto ( N ) (mM) _ (tuntia) _( % )_ ( % ) 0,001 20 2,19 0,5 22,495 0,94 1.0 27,65 2,395 2.0 25,465 3,86 3,8 29,285 2,11 40 2,04 0,5 27,795 4,695 1.0 28 Γ74 5 4,265 10 ’ 7 2.0 46,385 7,22 3.0 34,81 1,905 60 1,95 0,5 17,685 3,42 1.0 16,60 5,115 2.0 37,39 9,31 15 7 r r 3.0 37,815 4,065 80 1,85 0,5 17,255 2,115 1.0 16,66 4,525 2.0 39,08 11,145 3.0 36,76 3,52 20 ' 100 1,76 0,5 13,31 3,79 1.0 16,745 4,83 2.0 40,20 8,455 3.0 39,45 5,145 25

Taulukko 3 (jatkoa) 13 91067 [HC1] [Fe3+] pH* Aika A-VLB-saanto VLB-saanto (N) (mM) _ (tuntia) (%) (%) 5 0 r 005 20 1,96 0,5 24,615 5,205 1.0 35,66 3,42 2.0 29,78 1,485 3.0 31,45 4,245 40 1,74 0,5 38,695 8,36 10 1,0 40,915 4,645 2.0 50,605 2,40 3.0 23,60 6,495 60 1,74 0,5 49,415 10,815 1.0 46,71 6,205 15 2,0 47,06 2,83 3.0 36,725 6,255 80 1,70 0,5 55,215 11,665 1.0 41,105 6,60 2.0 18,925 5,16 20 3,0 37,69 5,83 100 1,64 0,5 48,12 9,45 1.0 24,76 8,53 2.0 37,03 3,985 3.0 28,80 6,14 25

Taulukko 3 (jatkoa) 14 [HC1 ] [Fe3+] pH* Aika A-VLB-saanto VLB-saanto (N) (mM) _ (tuntia) _(%) (%) 5 0,01 20 2,00 0,5 39,0 1,535 1.0 45,465 N.A.

2.0 31,97 1,07 3.0 44,317 3,125 40 1,82 0,5 40,335 5,72 10 1,0 32^845 4,815 2.0 35,785 2,27 3.0 40,375 6,91 60 1,79 0,5 47,935 3,88 1.0 30,02 5,845 15 2,0 30,485 3,295 3.0 40,18 7,235 80 1,72 0,5 42,965 5,635 1.0 34,42 8,19 2.0 36,21 3,58 20 3,0 42,355 9,135 100 1,63 0,5 36,54 6,535 1.0 38,815 6,37 2.0 41,70 3,32 3.0 46,52 6,89 25 -—

Taulukko 3 (jatkoa) 15 91067 [HCl] [ Fe3 + ] pH* Aika A-VLB-saanto VLB-saanto (N) (mM) _ (tuntia) (%) (%) 0,05 20 1,65 0,5 13,185 0,995 1.0 10,785 2,145 2.0 24,04 0,925 3.0 62,865 3,455 40 1,57 0,5 32,73 1,53 10 k 1,0 20,53 3,52 2.0 32,87 2,66 3.0 49,665 7,84 60 1,50 0,5 23,785 4,13 1.0 44,47 5,87 15 2,0 29,30 4,56 3.0 45,825 11,41 80 1,45 0,5 44,635 6,135 1.0 37,90 6,395 2.0 35,90 3,81 20 3,0 53,045 10,085 100 1,41 0,5 36,77 8,34 1.0 38,24 7,475 2.0 33,765 5,21 3.0 68,63 12,33 25 ♦Näytteen pH rekisteröity ennen reaktion päättämistä.

Sammutetut näytteet uutettiin kolme kertaa 6,0 ml :11a etyyliasetaattia (HPLC-laatu) ja yhteen kerätyt 30 orgaaniset jakeet kuivattiin tyhjössä. Näytteet, jotka oli yhdistetty uudelleen 200 ^ulilla HPLC-laatuista rae-tanolia, saatettiin HPLC- ja TLC-analyyseihin.

C-8, 5 ^um-kolonnin HPLC-analyysi koostui monimutkaisesta gradientista, joka vaihteli 55 %:sta 90 %:iin 35 metanolia vedessä, joka sisälsi t-butyyliammoniumfosfaat-tia modifiointiaineena. Niiden piikkien UV-spektrien 16 läpikäynti, joilla oli samat retentioajat kuin tunnetuilla standardidimeereillä, varmisti 3',41-anhydrovinblas-tiinin, vinblastiinin, katariinin ja leurosiinin läsnäolon. TLC-piidioksidipäällysteisillä levyillä, jotka ke-5 hitetään tolueeni:asetoni:metanoli:ammoniumhydroksidilla (vesiliuos, 14 M) (28:10:3:0,5), mitä seuraa UV-spektri-analyysi ja niiden täplien serium(4)-sulfaattikäsittely, jotka vaeltavat yhdessä tunnettujen standardien kanssa, vahvistaa edelleen edellä mainittujen dimeerien läsnä-10 oloa.

Noudattaen edellä mainittua menettelyä parhaat 12,33 %:n (paino-%) vinblastiiniarvot ja 68,63 %:n (pai-no-%) 3',4'-anhydrovinblastiiniarvot todettiin 100 mM:n ferrikloridipitoisuudella 0,5 M kloorivetyhapossa kolmen 15 tunnin reaktioajan jälkeen.

Esimerkki 3

Reaktioseokset, jotka sisälsivät 0,5 mg katarintii-nia (sulfaattisuolana) ja 0,5 mg vindoliinia (HCl-suola-na) valmistettiin 0,005 N mineraali/orgaanisten happojen 20 vesiliuokseen ja jäähdytettiin 4°C:seen. Dimeerituotanto initioitiin lisäämällä ferrikloridia 80 mM:n loppuväke-vyyteen 6,0 ml:n lopullisessa näytetilavuudessa. Kokeissa käytetyt hapot olivat: etikka-, kloorivety-, typpi-, fosfori- ja rikkihappo. Tulokset käyvät ilmi seuraavasta 25 taulukosta 4.

il

Taulukko 4 17 91067

Aika A-VLB-saanto VLB-saanto

Happo (tuntia) _( % )_ ( % )

Etikkahappo 0,5 37,71 0,67 5 1,0 51,60 1,065 2.0 52,03 2,79 HC1 0,5 42,21 0,15 1.0 66,64 2,93 2.0 67,10 2,245 10 HN03 0,5 42,65 0,53 1.0 67,05 1,11 2.0 58,10 1,56 H3P04 0,5 43,03 1,005 1.0 61,26 0,795 15 2,0 49,76 2,705 H2S04 0,5 43,37 1,05 1.0 57,84 1,835 2.0 47,98 3,24 20 0,5, 1 ja 2 tunnin reaktioaikojen kuluttua ravistellen 4°C:ssa näytteet sammutettiin molaarisella ylimäärällä natriumboorihydridiä ja 1,0 ml:11a 14 M ammonium- hydroksidin vesiliuosta. Sammutettuja näytteitä proses-25 soitiin edelleen uuttamalla kolme kertaa etyyliasetaatilla (HPLC-laatu). Orgaaniset jakeet kerättiin yhteen, kuivattiin tyhjössä ja jäännös yhdistettiin uudelleen 200 ^ulilla HPLC-laatuista metanolia.

Näytteiden analyysi HPLC-tekniikalla C-8, 5 ,um- 30 ' kolonnissa ja siihen liittyvä spektritieto antavat olettaa dimeerien 3',41-anhydrovinblastiinin, vinblastiinin, katariinin ja leurosiinin läsnäoloa. TLC-analyysi piidi-oksidipäällysteisillä levyillä tolueeni:asetonismetanoli: ammoniumhydroksidilla (14 M, vesiliuos), 28:10:3:0,5) ja ^ sen jälkeen UV-spektrimääritykset sekä niiden täplien käsittely serium(4)-ammoniumsulfaatilla, jotka vaelsivat 18 yhdessä tunnettujen standardien kanssa todistivat edelleen edellä mainittujen dimeerien läsnäoloa.

Käyttäen kuvattua menettelyä vinblastiinille saavutettiin 3,24 % (paino-%) saanto (0,005 M rikkihappo; t = 5 2 h) ja 3',4'-anhydrovinblastiinille (0,005 M HC1; t = 2 H) 67,10 %:n (paino-%) saanto.

Esimerkki 4

Puskuroimattomien vesipitoisten reaktioseosten, jotka sisälsivät 0,5 mg katarantiinia (sulfaattisuolana) 10 ja 0,5 mg vindoliinia (HCl-suolana), annettiin reagoida 4°C:ssa ravistellen. Monomeerien yhdistyminen initioitiin lisäämällä ferrikloridia 20 mM:n loppuväkevyyteen 6,0 ml:n kokonaisnäytetilavuudessa. Näytteet sammutettiin 1, 2, 3 ja 4 tunnin reaktion jälkeen molaarisilla ylimäärillä 15 natriumboorihydridiä ja 1,0 ml:11a 14 m ammoniumhydrok-sidia. Sammutettuja näytteitä prosessoitiin edelleen suorittaen orgaaninen uutto kolme kertaa 6,0 ml:11a etyyliasetaattia (HPLC-laatu). Orgaaniset jakeet kerättiin yhteen, kuivattiin tyhjössä ja jäännös yhdistettiin uudel-20 leen 200 ^ul:ssa HPLC-laatuista metanolia.

Dimeeristen indolialkaloidien (3',4'-anhydrovin-blastiini, vinblastiini, katariini ja leurosiini) läsnäolo todettiin yhdistelmällä, johon kuului sekä HPLC C-8, 5 ^um-kolonni että TLC-piidioksidipäällysteiset levyt, 25 jotka kehitettiin tolueeni:asetoni:metanoli:ammoniumhydr-oksidilla (14 M, vesiliuosta) (28:10:3:0,5). UV-spektri-analyysit kummassakin näistä systeemeistä verrattuna tunnettuihin standardeihin, varmisti edellä mainittujen dimeerien läsnäoloa. Tulokset esitetään seuraavassa taulu-30 kossa 5.

11

Taulukko 5 91067 19

Aika A-VLB-saanto VLB-saanto (tuntia) (%) (%) lf0 26,665 3,68 2.0 26,715 3,14 3.0 35,915 6,175 4.0 42,20 4,685 10 Käyttäen edellä esitettyä menettelyä, saadut parhaat arvot olivat 6,18 % (paino-%) vinblastiinilla (t = 3 h) ja 42,4 % (paino-%) 3',4'-anhydrovinblastiinilla (t = 4 h) .

15 Esimerkki 5

Vesiliuokset, jotka sisälsivät 0,5 mg sekä vindo-liinia että katarantaania, lisättiin 0,1 M glysiinipusku-riin pH-arvoilla 2,0, 2,5 ja 3,0, joka sisälsi 20 mM fer-ri-ionia 6,0 ml:n lopullisessa tilavuudessa.

20 Yhden tunnin reaktion jälkeen 30°C:ssa ajoittain sekoittaen reaktio päätettiin lisäämällä molaarinen ylimäärä natriumboorihydridiä ja 0,3 ml 14 M ammoniumhydroksidin vesiliuosta.

Näytteiden orgaaninen uutto suoritettiin kolme ker- 25 taa etyyliasetaatilla (HPLC-laatu), uutteet kerättiin yhteen, kuivattiin tyhjössä ja yhdistettiin uudelleen 0,2 ml:11a HPLC-laatuista metanolia.

Näytteiden HPLC-analyysi C-8, 5 ^um-kolonnilla johti taulukossa 6 esitettyihin havaintoihin. Niiden piik- 30 kien UV-spektrianalyysi, jotka eluoituivat yhdessä tunnettujen standardien kanssa, vahvisti mielenkiintoisten dimeerien läsnäolon.

20

Taulukko 6

Puskurin pH Näytteen pH* % AVLB % VLB

2.0 1,91 22,45 N.D.** 5 2,5 2,26 27,28 N.D.

3.0 2,70 14,80 N.D.

* Näytteen pH ennen sammutusta **N.D. = toteamisrajojen alapuolella 10 Kuten taulukon 6 arvot osoittavat, 0,1 M glysiini (pH = 2,5) osoittautuu parhaaksi A-VLB:n tuotantoon (27, 28 %, saanto painosta) näissä olosuhteissa.

Näin ollen tässä kuvatut reaktiot sopivat 3',4'-anhydrovinblastiinin ja vinblastiinin muodostukseen. Reak-15 tio-olosuhteiden muutokset voivat johtaa joko A-VLB:n tai vinblastiinin ensisijaiseen muodostukseen.

Vaikka reaktio-olosuhteisiin voi liittyä kylmiä lämpötiloja ja monimutkaisia vesiliuoksia, tunnustetaan, että kaupalliset operaatiot suoritetaan edullisemmin huo-20 neen lämpötilassa jne., ts. käyttäen kohtuuhintaisia reaktio-olosuhteita. Tämä keksintö käsittää sellaiset proses-siolosuhteet kuin huoneen lämpötilan, puskuroimattoman veden käytön liuottimena jne. Tällaisissa olosuhteissa inertti atmosfääri on kuitenkin toivottava. Edelleen reak-25 tionopeutta tulee tarvittaessa säätää muuttamalla ferri-ionin lisäystä. Näissä korkeammissa lämpötiloissa ferri-ioniväkevyyttä voidaan pienentää.

Il

Claims (7)

91067

1. Menetelmä dimeerisen alkaloidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdistetään vindoliini 5 ja katarantiini ferri-ionin katalyyttisesti tehokkaan määrän läsnäollessa happamassa väliaineessa.

2. Menetelmä 3',4'-anhydrovinblastiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdistetään vindoliini ja katarantiini väliaineessa, joka sisältää kata- 10 lyyttisesti tehokkaan pitoisuuden ferri-ionia ja otetaan 3',4'-anhydrovinblastiini talteen siitä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ferri-ionia on läsnä väliaineessa moolisuhteessa 1:1 - 10 000:1 katarantiiniin verrattuna.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että moolisuhde on 400:1 - 1 000:1.

5. Menetelmä vinblastiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdistetään vindoliini ja katarantiini väliaineessa, joka sisältää katalyyttisesti tehok- 20 kaan pitoisuuden ferri-ionia ja otetaan talteen vinblas-tiini siitä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ferri-ionia on läsnä väliaineessa moolisuhteessa 1:1 - 10 000:1 katarantiiniin verrattuna.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että moolisuhde on välillä 400:1 - 1 000:1.