FI80462C - Foerfarande foer framstaellning av dimera catharanthus-alkaloider. - Google Patents

Description

1 ε O 4 6 2

Menetelmä valmistaa dimeerisiä Catharanthus-alkaloideja Förfarande för framställning av dimera Catharanthus-alkaloider

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään valmistaa dimeerisiä Catharanthus-alkaloideja, joiden kaavan I on

»· £** OH

a A' V / \ (' I 18 / <n

I * ,*\ J]iiH

Η,οοΛτ^Ν^^ΟΑο R COOCH3 jossa R on CH3 tai CHO, tai näiden johdannaisia.

Yllä kuvattuja kaavan I mukaisia dimeerisiä alkaloideja, vinkristiiniä (R=CHO) ja vinblastiinia (R=CH3> käytetään syövän hoidossa sellaisenaan tai erilaisina johdannaisina. Näitä yhdisteitä ja niiden käyttöä on kuvattu mm. patenttihakemuksissa FI 852785 ja 860456.

Kyseisiä yhdisteitä ei ole taloudellisesti pystytty syntetisoimaan vaan yhdisteitä on tuotettu uuttamalla Catharanthus-suvun kasveista. Yhdisteen pitoisuus kasveissa on kuitenkin pieni, joten näin talteenotettuna lopputuotteen hinta on erittäin korkea.

2 80462

Kaavan I mukaiset dimeeriset alkaloidit eli bis-indolialka-loidit muodostuvat monomeerisista alkaloidiyksiköistä, katarantiinista (III) ja vindoliinista (II). Molemmat mono-meerit ovat Catharanthus roseus-kasvin (punatalvio) pääalka-loideja (jopa 1 % kuivapainosta) ja helposti eristettävissä.

Ko. kasvia viljellään mm. Etelä-Euroopassa, Japanissa ja koristekasvina Suomessa kasvihuoneissa.

Niiden lähtöaineiden synteettinen yhdistäminen kaavan I mukaiseksi lopputuotteeksi on kuitenkin aikaisemmin ollut vaikeata [(Lounasmaa, M ja Nemes, A. (1982) Tetrahedron, 38, s. 223, (1982)].

Nyt on yllättäen havaittu, että nämä monomeeriset yksiköt voidaan yksinkertaisella tavalla liittää yhteen kaavan I mukaiseksi lopputuotteeksi, jolla on haluttu stereokemiallinen konfiguraatio 16'-asemassa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että vindoliini, jonka kaava II on . (¾ frns/CHj H3C0>^'N^>0Ac H5 OH ui) h3c cooch3 ja katarantiini, jonka kaava III on H COOCH3 ^ (III) 3 8C462 säteilytetään UV-valolla vesiliuoksessa. Dimerisaatioon voidaan kytkeä myös samanaikainen fotolyyttinen hapetus, jolloinka päätuotteena syntyy vinkristiiniä (I, R = CHO).

Oletetaan, että reaktiomekanismi on seuraava: 1. Katarantiini (III):

Happamissa olosuhteissa fotolyysi muuttaa katarantiinin (III) virittyneeseen tilaan, joka on tasapainossa ympärillä olevan happaman liuottimen kanssa.

hl/ = ctcv * h “°ch3 h /Mr a m jh*

Todellisuudessa fotokemian säännöin kyse on radikaalireak-tiosta, mutta elektronien siirrot ovat kaaviossa esitetyt havainnollisuuden vuoksi elektroniparien siirtoina.

Virittyneessä tilassaan III' pyrkii takaisin aromaattiseen muotoonsa ja tällöin sopivalla nukleofiillä, tässä vindoliinillä (II), on mahdollisuus osallistua reaktioon (<-nm -nuolella osoitettuun kohtaan molekyyliä). Jos virittynyttä III' tilaa tarkastellaan, niin konjugoituneet kaksoissidosjärjestelmät 4 80462 muodostavat tason, jonka piirroksessa oleva N-siltarakennelma asettuu piirroksen yläpuolelle. Tämä merkitsee jatkoreaktion kannalta sitä, että lähestyvä nukleofiili voi lähestyä molekyyliä vain piirroksen tason alapuolelta. Tämä johtaa vinblas-tiinissa (I, R = -CH3) luonnonmukaiseen C-16' S-konfiguraa-tioon. III'-välivaiheessa syntynyt enamiini hydrolysoituu normaalisti happaman vesiliuoksen vaikutuksesta. Kaksoissi-dokseen liittyvän veden ~OH-ryhmä pääsee molekyylin rakenteen vuoksi hyökkäämään C-20' vain molekyylin toiselta puolelta ja yksiselitteinen enantiomeeri syntyy.

2. Vindoliini (II)

Vindoliinissä (II) on kaksi tekijää, jotka tekevät sen 10-hii-lestä varsin tehokkaan nukleofiilin kahden alkaloidin (II & III) dimerisaatiolle. Molekyylissä on aromaattinen osa, johon on liittyneenä sekä metoksiryhmä ja parittoman elektroniparin omaava typpi. Kummatkin aiheuttavat molekyylissä "elektroni-paineen" juuri C-10:een. Asiaa voidaan luonnostella esim. resonanssimuodoilla II' ja II" ® ch3COOCH3 CH3cooch3 H3C0 CH3COOCH3 I* I I”

Resonanssimuodot II* ja II" selittävät mahdollisen jatkoreaktion; esim. nukleofiilisen substitution viritystilassa olevan katarantiinin (III) kanssa, jolloin tuotteena syntyy vinblas-tiinia (I, R = -CH3).

Il 5 80462

Yllättäen esillä oleva reaktio voidaan toteuttaa erittäin yksinkertaisilla menetelmillä sekoittamalla reaktiokomponentit keskenään vesiliuoksessa ja säteilyttämällä seosta UV-valolla.

Reaktio voidaan suorittaa erilaisissa lämpötiloissa rajojen ollessa noin -10 - +60°C. Yleensä käytetään normaalipainetta, mutta korotettuakin painetta voidaan käyttää yhdessä alennetun lämpötilan kanssa.

Reaktio suoritetaan vesiliuoksessa, jonka pH säädetään välille noin 1,5 - noin 7. pH:n säätöön voidaan käyttää epäorgaanisia happoja, kuten kloori- tai bromivetyhappoja tai orgaanisia happoja, kuten muurahaishappo.

Keksintö voidaan edullisesti suorittaa kuvan I mukaisessa "Hanovia"-fotoreaktorissa. Tämä reaktori muodostuu 1 litrai-sesta, kolme kaulaisesta "Pyrex"-pullosta 1. Pulloon on työnnetty lasiputkeen sijoitettu valokaarielementti 2, jossa lasiputkessa on jäähdytysväliaineen sisääntuloliitäntä 3 ja ulos-tuloliitäntä 4. Pullo varustetaan magneettisekoittajalla. Menetelmän yleiskulku on seuraava. Pullo täytetään litralla ionivaihdettua vettä, 1 - 2 mg lähtöainetta lisätään vesiliuokseen, jonka pH säädetään hapolla (edullisesti HCl, HBr tai HCOOH) arvoon 3-4. Seosta sekoitetaan magneettisekoittajalla ja pyrex-pullon keskelle kvartsivaippaan sijoitettu UV-valoa säteilevä lamppu sytytetään. Valon aallonpituus on välillä 180 - 400 nm (pääosin 254, 265, 297 ja 366 nm). Reaktioaika on noin 15 min - 8 tuntia, mutta voi myöskin olla pidempi riippuen käytetystä haposta ja lähtöaineiden pitoisuuksista.

Reaktion päätyttyä reaktiotuotteet erotetaan ja analysoidaan tavanomaisilla analyysimenetelmillä.

Esillä olevaa keksintöä selitetään tarkemmin seuraavissa esimerkeissä. On kuitenkin huomattava, että keksintö ei rajoitu 6 80462 ainoastaan näihin esimerkein esitettyihin keksinnön sovellutus-muotoihin, vaan keksinnön yksityiskohdat voivat vaihdella jäljempänä esitettävien vaatimusten puitteissa.

Esimerkki 1 "Hanovia"-reaktori täytettiin litralla ionivaihdettua vettä ja liuoksen pH-arvo säädetiin bromivetyhapolla 3,5:een. Happamaan vesiliuokseen lisättiin 1,8 mg (4,4 μταοί) vindoliinia (II) sekä 1,7 mg (4,4 pmol) katarantiinia (III). Reaktioseosta säteily-tettiin 0,5 tuntia noin 8°C lämpötilassa. Vesi haihdutettiin alipaineessa pois, jolloinka haihdutusjäännöksenä saatiin 3,4 mg kellertävää viskoosia öljyä.

Analyysi

Vertailuaineina kaikissa analyysivaiheissa olivat dimeeriset Catharanthus-alkaloidit; vinblastiini (I, R = -CH3) ja vinkris-tiini (I, R = -CHO).

HPLC

Kolmella eri kolonnilla asetaattipuskurilla ajetut reaktionäyt-teet LC:ssä antavat täysin identtisen signaalin vinblastiinin (I, R = -CH3) kanssa jopa yli 40 minuutin retenttioajalla. LC:n perusteella voidaan päätellä noin 15 - 20 % reaktiosaantoa.

HPTLC

Eluoitaessa emäksinen (NH4OH), konsentroitu reaktioseos meta-nolilla TLC-levylle ilmestyi lähtöaineita hitaammin liikkuva täplä, joka vastaa vinblastiini-standardia. Täplä on TLC-levyllä näkyvissä UV-alueella 366 nm. Sen sijaan lähtöaineet näkyvät UV-alueella 254 nm (lähtöaineista vindoliinia oli hieman jäljellä).

If 7 80462

MS

Massaspektrissä on voimakas piikki m/z 809 (= M+-l), joka on tyypillinen tämänlaisille orgaanisille yhdisteille. Signaali kuitenkin selvästi osoittaa, että dimerisaatio vindoliinin (II, MW = 455) ja katarantiinin (III, MW = 336) välillä on syntynyt.

UV

Synteesituotteen, joka erotettiin LCsllä ja standardiaineen (I, R = -CH3) UV-spektrit mitattuna metanolissa olivat täysin identtiset.

UV:^max dog£* MeOH): 223 (4,76), 258 (4,32) nm.

RIA

Nestekromatografiällä erotettu reaktiotuote antoi positiivisen vasteen vinblastiinin (I, R = -CH3) RIA-analyysissä.

1): Huhtikangas, A., Lehtola, T., Lapinjoki, S. ja Lounasmaa, M., Planta Medica, 1987, 85? 2): Lapinjoki, S.,

Veräjänkorva, H., Huhtikangas, A., Lehtola, T. ja Lounasmaa, M., Journal of Immunoassay, 7, 113 (1986).

Esimerkeissä 2-7 toistettiin edellä esimerkissä 1 kuvattu menetelmä sekä lopputuotteen analyysi, mutta käyttämällä taulukossa I esitettyjä parametrejä.

8 80462 0

4-) Γ> H N OJ

C r—t iH

ctj <#> i i i i i id m ro σ\ r-4 a t—i U) l :θ (ö — oooooo

Oj O <—I '—t i—I t—I i—H

e ·ή O I I I I I

:(0 4-)^-αο oo oo oo co 0 4-) —* M (0 u o r-~ in in (C M JO »

O).H —' CN (N <N O O <N

01 (0 rH i—I

—t >1 (0 4-) Φ 4-) Φ <d o a aa

4-) 4-) Q. r-H —I rH V4 O O

c >iauuuoaoo

>1 :<0 ιβ 3 S K S U U

O tn i*< jo K 03 Äö iti c__ n -h J c 03 m m in o o o £3 -»H Qj <C *h ro ro oo -*r E-i 4-)__ ω (0 -h

rH C

JO -H

C :(0 •h m r-nn-invor^CTio > :<ö O ·> «* - ·> - -

IfO 03 rH rH r-H CO r-H O

6 C

•H

c > Q) r-, Ό tr__ •ή ε

(1) *— *rH

c c •H ·Η

(0 -H

:0 -U

4-> C

jo O in H1 Φ h eo :(Ö >h *·*· “·»*· *

1-3 (0 rH rH rH CO rH rH

4-) tO M

*H

1 M

•H M

to in cn ro m m r~ W Φ e

II

9 80462

Esimerkki 8 "Hanovia"-reaktio täytettiin litralla ionivaihdettua vettä joka kyllästettiin hapella johtamalla siihen 02-kaasua. Liuoksen pH-arvo säädettiin kloorivetyhapolla 2,5:een. Happamaan vesiliuokseen lisättiin 1,8 mg (4,4 pnol) vindoliinia (II) sekä 1,7 mg (4,4 pmol) katarantiinia (III). Reaktioseosta säteilytettiin 0,5 tuntia noin 8°C lämpötilassa. Vesi haihdutettiin alipaineessa pois, jolloinka haihdutusjäännöksenä saatiin 3,4 mg kellertävää viskoosia öljyä.

Analyysi

Vertailuaineina kaikissa analyysivaiheissa oli Catharanthus-alkaloidi: vinkristiini (I, R = -CHO).

HPLC

Standardiaineen (vinkristiini, R = -CHO) mukaan asetaatti- ja fosfaattipuskurissa ajettu reaktioseos osoitti noin 30 % vinkristiinisaantoa.

HPTLC

Eluoitaessa emäksinen (NH4OH), kosentroitu reaktioseos metano-lilla, TLC-levylle ilmestyi lähtöaineita hitaammin liikkuva täplä, mikä vastaa vinkristiinistandardia.

MS

HPLC:llä eristetty reaktiotuote antoi kemiallisessa (NH3) ionisaatiossa tyypillisen m/z = 825 (M+ + 1) piikin.

UV

Eristetty reaktiotuote antoi identtisen UV-spektrin standardi-aineen (I, R = -CHO) kanssa.

Xmax (log£ , ajoneste): 222 (4,63, 253 (4,21), 293 (4,18) nm.

Claims (6)

1. Menetelmä valmistaa dimeerisiä Catharanthus-alkaloideja, joiden kaava I on r ?H ir ,r H OOCH3 (i> “r^ll- •ik A1 R COOCH3 jossa R on CH3 tai CHOf tunnettu siitä, että vindoliini, jonka kaava II on C@ fnfX/ffls Η,ΟΟ'^^'Ν'Κ^ολ (H)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuoksen pH säädetään välille 1,5 - 7.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH säädetään hapolla, edullisesti kloori- tai bromi-vetyhapolla tai orgaanisella hapolla.

3. H f OHU H3C COOCH3 ja katarantiini, jonka kaava III on n !l_ /tS? (iii> ^ C00CH3 II n 80462 säteilytetään UV-valolla vesiliuoksessa joko hapettomissa tai hapettavissa olosuhteissa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, reaktiolämpötila on -10° - +60°C.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan normaalipaineessa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan korotetussa paineessa, edullisesti alennetussa lämpötilassa. 12 80 462