JP2502332B2 - 第二鉄イオンを使用するアルカロイド二量体の製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は抗腫瘍剤及び抗腫瘍剤の前駆物質として有用
なアルカロイド化合物に関する。さらに詳細には、本発
明は植物「カサランサス・ロゼウス（Catharanthus ros
eus）」によって天然に生産される二量体インドールア
ルカロイドである３′,4′−アンヒドロビンブラスチン
及びビンブラスチンの製造に関する。

〔発明の背景〕

マダガスカルのにちにちそう植物「カサランサス・ロ
ゼウス（Catharanthus roseus）」（ビンカ・ロゼア（V
inca rosea）及びロチネラ・ロゼア（Lochnera rosea）
としても知られる）に見出された多数の天然のアルカロ
イドは抗腫瘍薬として認められている。癌の治療で認め
られているビンクリスチン及びビンブラスチンは大いに
商業上の関心がもたれている。ビンクリスチンは白血
病、リンパ腫、固形腫瘍の治療に有効な薬剤である。ビ
ンブラスチンは同様の有効性を有し、ホジキン病の治療
に有効な薬剤でもある。

ビンブラスチン及びビンクリスチンの両方とも一般に
は前記植物から容易に抽出されるが、薬剤を抽出する前
に収穫し乾燥しなければならない。植物抽出物の複雑性
（少なくとも200種類のアルカロイドを含有している）
及び所望のアルカロイドの低濃度（ビンブラスチンにつ
いては0.0003乾燥重量％）のため抽出工程は時間と費用
がかかる。抽出方法に固有の問題のためビンクリスチン
及びビンブラスチン製造の別の方法の開発が注目を集め
ている。

ビンクリスチンはビンブラスチンから化学的に製造で
きる。一方、ビンブラスチンはカサランサス・ロゼウス
（Catharanthus roseus）中に見出された天然のインド
ールアルカロイドであるカサランチン及びビンドリンか
ら中間物質３′,4′−アンヒドロビンブラスチン（Ａ−
VLB）を経て化学的に製造される。カサランチン及びビ
ンドリンは、過酸（例えば、ｍ−クロロ過安息香酸）を
使って、カサランチンをそのＮ−オキシドに変え、次に
トリフルオロ酢酸の添加により開始される該Ｎ−オキシ
ドのポロノフスキ型開裂により化学的にカップリングし
て天然の二量体を生成する。水素化ホウ素ナトリウムな
どの還元剤を上記混合物に添加して３′,4′−アンヒド
ロビンブラスチン（Ａ−VLB）を生成し、これはビンブ
ラスチンに変えることができ、さらに酸化してビンクリ
スチンに変えることができる。化学反応の全体系は次に
示すとおりである： ３′,4′−アンヒドロビンブラスチン（Ａ−VLB）は
それ自体が強力な細胞増殖抑制性活性を有すると報告さ
れており、しかも、ビンクリスチンまたはビンブラスチ
ンのいずれよりも低い毒性を示している。これはビンブ
ラスチン及びビンクリスチン合成の必須前駆物質であ
る。クットニー（Kutney）著「Pure and Applied Chemi
stry」54巻、2523頁（1982年）及びスコット他著「Hete
rocycles」９巻、1419頁（1978年）に示されるようにＡ
−VLBはC.ロゼウスの葉から得られた無細胞抽出物を使
ってビンドリン及びカサランチンから酵素的に形成され
る。しかし、報告されている収率は極めて低い。

カサランチン及びビンドリンの化学的カップリング反
応は単純化すると下記のように表わされる： 本発明の目的はカサランチン及びビンドリンをカップ
リングして二量体アルカロイドを生成する新規な方法を
提供することである。

本発明の別の目的はビンブラスチン及び３′,4′−ア
ンヒドロビンブラスチンを製造する方法を提供すること
である。

〔発明の要約〕

本発明において、単量体アルカロイドのビンドリン及
びカサランチンは触媒として有効な量の第二鉄イオンの
存在下で結合させる。反応生成物は主な成分として
３′,4′−アンヒドロビンズラスチン及びビンブラスチ
ンを含有している。カサリン及びリュロシンも有意以下
の量であるが反応から生ずる。種々の反応生成物の各々
が生成される量は以下に詳細に述べるように反応条件を
変えることによりある程度まで操作できる。

〔好ましい具体例の詳細な説明〕

必要な反応物の各々は現在市販されている。単量体ア
ルカロイドであるビンドリン及びカサランチンは塩の形
で、例えばビンドリン塩酸塩及びカサランチン硫酸塩な
どとして入手でき、反応で使用できる。さもなければ、
該単量体を先行技術、例えば1981年１月27日発行の米国
特許1,094,552号公報に記載の方法でC.ロゼウス（C.ros
eus）組織から抽出できる。

第二鉄イオンの原料は、該第二鉄イオンが反応媒体に
放出され反応に関与することができるという条件で種々
に変えられる。例えば、Fe³⁺:EDTA錯体及び第二鉄ピロ
リン酸塩などのように第二鉄イオンが強くキレート化す
る化合物は避けるべきである。より適切なFe³⁺源として
は、その硫酸塩、硫酸アンモニウム塩、モノリン酸塩、
塩化物及び硝酸塩などが挙げられる。

反応は触媒として有効量の第二鉄イオンをビンドリン
及びカサランチンを含有する反応媒体に添加するだけで
行われる。反応は非緩衝水性媒体中、室温で進行する
が、所望の二量体アルカロイドの製造を最大にするため
に反応の進行を制御することが望ましい。例えば、反応
は初期にＡ−VLB及びビンブラスチンを生成することに
より始まる。続くこれらの二量体の酸化により例えばビ
ンブラスチン、カサリン、リュロシン、ビンアミジン、
３−Ｒ−ヒドロキシビンアミジンなどの他の生成物を生
じ、その相対的な量は反応条件によって変わる。従っ
て、Ａ−VLB及びビンブラスチン製造に最適にして他の
二量体の生成を制限し収率を最高にすることができる。
この目的のため、pH、反応温度、第二鉄イオン濃度、反
応媒体及び反応時間などの因子を、所望の医薬上の有用
性があるＡ−VLB及び／またはビンブラスチンを経済的
に有意な収率で製造するように操作すればよい。

反応媒体は種々の溶媒から選ぶことができる。水性媒
体を使用してもよい。水自体を使用してもよいが、例え
ばHCl,H₂SO₄,HNO₃,H₃PO₄など鉱酸の希釈水溶液も同様に
有用であり、実際反応速度を制御する能力があるので好
ましい場合もある。酢酸のような有機酸水溶液も使用で
きる。さらに、所望により例えばジメチルホルムアミド
及びテトラヒドロフランなどの水と混合しうる非プロト
ン性溶媒も使用される。さらに、反応を生成物形成に導
く助けをする溶媒系が使用される。このような溶媒系に
より二量体生成物は二量体の形として触媒から分離する
ことができる。適当な系としては、塩化メチレン、四塩
化炭素、クロロホルム及び他のハロゲン化低級炭化水
素、酢酸エチル及びジエチルエーテルなどのエーテル類
などの疎水性成分及び前述の水性溶媒などの親水性成
分、即ち水と混合しうる成分から成る２相溶媒系が挙げ
られる。溶媒混合物を連続的に混合して、二量体生成物
を疎水性相に移し、そこから周知の方法により抽出でき
る。触媒は所望により水性相から回収される。

反応を行う際のpHは所望する生成物により変化させる
ことができる。pHは生成物のタイプに著しい影響を与
え、反応媒体が鉱酸及び／または有機酸の水溶液から成
る場合は単に酸を添加している間pHを監視するか、また
はFe³⁺を添加して反応を開始する前に必要な酸の強度ま
たは量を定量的に測定することにより直接管理すること
ができる。溶媒として水を使用する場合は、反応媒体は
例えばグリシンなどで適当に緩衝化され所望のpH範囲を
維持しうる。なお、媒体にFe³⁺を添加するとそれだけで
媒体のpHを低下させ、得られたpHは媒体中のe³⁺の最終
濃度に影響を与える。

最も好ましい条件では、Ａ−VLBの製造はpHが約1.5以
下のとき最大である。さらに高いpH、例えば、1.50から
４までの場合は、明らかに低レベルのpHの場合よりも相
対的にビンブラスチンの収率が増加するが、しかし、や
はりＡ−VLBが反応生成物の中では主要な二量体であ
る。これら低いpHの範囲は４℃のときＡ−VLB及びビン
ブラスチンの相対収率に影響を与えるが、必ずしも厳密
に固執するべきではない。

反応が行われる温度は広い範囲で変えられる。温度に
よって反応速度を効果的に管理することができるので、
温度は反応生成物の形成を好ましく操作するパラメータ
である。例えば室温以上約40℃までのような高温では、
反応は非常に速く進み、所望の二量体の存在が最大の時
に反応の進行を止めるために還元剤を正確な時間を計っ
て添加する必要がある。さらに、通常高温により空気中
の酸素との反応性が増してＡ−VLB及びビンブラスチン
を酸化して所望しない二量化を生成する。従って、Ａ−
VLB及びビンブラスチンが所望であり反応が高温で行わ
れる場合、反応生成物は不活性の雰囲気、例えばN₂にさ
らし、形成される生成物の種類をさらによく制御すべき
である。脱酸素が行われてもよい。

反応をさらに低い温度で行うことにより、反応速度を
さらに効果的に管理し、反応を止めるために還元剤を添
加する正確な時間をさらに制御しやすくする。10℃以
下、例えば、４℃で反応を行うとＡ−VLB及びビンブラ
スチンの酸化速度を低下させるので、不活性雰囲気中で
操作する必要が実際には省ける。グリシン緩衝液はこの
ような低温ではビンブラスチンの製造を増大させるよう
であるから、低温で緩衝液が使用できる場合には使用し
た方が好ましい。例えばリン酸塩、トリスなど他の緩衝
液も使用できるが、第二鉄イオンを結合させない緩衝液
を選ぶよう注意すべきである。

反応の進行は媒体中の第二鉄イオンの濃度によっても
左右される。第二鉄イオンの好ましい触媒として有効な
量は最終濃度としてカサランチンのモル当り１から10⁴
モルFe³⁺の範囲である。Fe³⁺のさらに好ましい最終濃度
は400:1〜1,000:1の範囲である。カサランチンとのモル
比の関係が現在の反応機構の理論に影響を与えている。
第二鉄イオンはカサランチンと錯体を形成し、ビンドリ
ンとの適切なカップリングを促進する電子移動を引き起
こす。従って、Fe³⁺濃度は相対的カサランチン濃度と共
に反応においては初期制御因子のようである。

選ばれた反応条件にかかわらず、反応の進行は所望の
二量体の濃度がピークに達した時水素化硼素ナトリウム
などの還元剤を添加して止められる。還元剤の添加時期
が早すぎると二量体Ａ−VLBまたはビンブラスチンを最
大収率で回収する防げとなる。還元剤の添加時期が遅れ
ると反応が進行しすぎてＡ−VLBが主要生成物でありビ
ンブラスチンの生成量が最大となる段階を過ぎてしま
う。還元剤を添加する間隔は反応条件、第二鉄イオン濃
度などによって変わる。例えば、４℃のHCl水溶液中で
カサランチン及びビンドリンの各々を0.5mgずつカップ
リング開始するために第二鉄イオン源として100mMの塩
化第二鉄を使用すると、Ａ−VLBの最大収率は３時間後
に得られる。非緩衝水溶液媒体中20mMのFeCl₃を使用す
る以外は同様の条件下で、Ａ−VLBの最大量は約４時間
後に得られる。ビンドリン及びカサランチンの各々0.5m
gずつを40mMの塩化第二鉄を含有するグリシン緩衝液中
で反応させ２時間後に反応を止めるとビンブラスチンの
最大収率が得られる。従って、反応の進行中に還元剤を
添加する適切な間隔を決定するために反応を終了する前
に反応を定量的に分析する必要があるかもしれない。以
下の実施例に概略されているような試験が適当である
が、類似の実験は実験に馴れた化学者にとって容易なこ
とである。

反応が一旦止められると、二量体は例えば酢酸エチル
などの極性有機物として抽出され標準的な化学技術方法
を使って精製される。

本発明の具体例を以下に挙げる。各実施例について、
ビンブラスチン及びＡ−VLBの存在は質量分析、円偏光
二色性分析及び紫外スペクトルにより確認された。紫外
スペクトルは既知の標準物質と比較して第１のオーダー
の誘導体と一致した。円偏光二色性分析はＣ−18炭素に
ついてα−結合を確認した。

実施例１ 0.1Mのグリシン緩衝液（４℃でpH2.0）中に0.5mgのカ
サランチン（硫酸塩として）及び0.5mgのビンドリン（H
Cl塩として）を含有する新しい試料を４℃まであらかじ
め冷却した。これら試料の混合物に最終試料容量6.0ml
中に20mMから100mMの範囲の第二鉄イオン濃度をもたら
す1.2Mの塩化第二鉄または0.6Mの硫酸第二鉄のいずれか
の貯蔵水溶液の種々な量を添加した。第二鉄塩を加え反
応を開始した後、0.5時間、１時間、２時間試料を４℃
で振とうし、モル過剰量の水素化硼素ナトリウムと14M
水酸化アンモニウムの水溶液0.1mlを添加した。

結果を以下の表１及び表２に示す。

反応で生成した二量体アルカロイドは、反応混合物を
6.0mlの酢酸エチル（HPLC−級）で３回抽出することに
より分析された。有機層を集めて真空中で濃縮乾固させ
200μのHPLC−級のメタノールでに溶解する。試料のH
PLC分析はＣ−8,5μｍカラムで行ない、３′,4′−アン
ヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、リュロシン、
カサリンの各々に対応するピークを紫外線分光分析で検
知した。シリカゲルTLCによる分析は、0.5％（V/V）ト
リエチルアミンを含有するエーテル：クロロホルム：メ
タノール（50:35:20）を用い室温で展開して行った。紫
外線をあてての発色及び硫酸第二セリウムアンモニウム
によるアルカロイドの発色によって前述の二量体の存在
を確認した。

ビンブラスチンが収率21.34重量％（40mM塩化第二
鉄；反応時間＝２時間）で得られたこと及び３′,4′−
アンヒドロビンブラスチンが収率59.11重量％（100mM塩
化第二鉄；反応時間＝１時間）で得られたことは表１及
び表２から明らかである。

実施例２ 0.5mgのカサランチン（硫酸塩として）及び0.5mgのビ
ンドリン（HCl塩として）を含有する試料を0.001−0.05
モルの濃度範囲の塩酸に懸濁し４℃に冷却した。単量体
のカップリングは、6.0mlの全容量中で最終濃度が20−1
00mMになるように1.2Mの塩化第二鉄の貯蔵水溶液を添加
して開始された。試料を４℃で0.5、１、２、及び３時
間の各時間振とうし、モル過剰量の水素化硼素ナトリウ
ム及び1.0mlの14M水酸化アンモニウム水溶液を添加して
止めた。結果を下記の表３に示す。

反応を停せした試料を6.0mlの酢酸エチル（HPLC−
級）で３回抽出し、集めた有機層を真空中で濃縮乾固し
た。その試料を200μのHPCL級メタノールに溶解し、H
PLC分析及びTLC分析を行った。

HPLC分析はＣ−8,5μｍカラムを用い、緩衝性剤とし
て燐酸ｔ−ブチルアンモニウムを含有する水と55−90％
のメタノールとのグラジエントをかけて行った。周知の
標準二量体と類似の保持時間を示すピークの紫外スペク
トルを測定することにより３′,4′−アンヒドロビンブ
ラスチン、ビンブラスチン、カサランチン及びリュロシ
ンの存在を確認した。シリカゲルのTLC分析は、トルエ
ン：アセトン：メタノール：水酸化アンモニウム（水溶
液、14M）（28:10:3:0.5）で展開し、次いで紫外スペク
トル分析及び標準サンプルと共に移動したスポットの硫
酸第二セリウムアンモニウム発色を行って前述の二量体
の存在を確認した。

上記操作により、ビンブラスチンについては最大収率
12.33％（重量％）及び３′,4′−アンヒドロビンブラ
スチンについては最大収率68.63％（重量％）が0.5Mの
塩酸中の100mM塩化第二鉄を用い３時間反応した時に観
察された。

実施例３ 0.5mgのカサランチン（硫酸塩として）及び0.5mgのビ
ンドリン（HCl塩として）を含有する反応混合物を0.005
Nの鉱酸および有機酸水溶液中で調製し、４℃に冷却し
た。最終試料の溶量6.0ml中に80mMの最終濃度となるよ
うに塩化第二鉄を添加して二量体の製造を開始した。用
いた酸は酢酸、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸であった。結
果は以下の表４に示す。

0.5時間、１時間、２時間、４℃で振とう後、反応混
合物にモル過剰の水素化硼素ナトリウム及び1.0mlの14M
水酸化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。そ
の反応を停止した試料をさらに酢酸エチル（HPLC−級）
で３回抽出した。有機層を集めて真空中で濃度乾固し、
残渣を200μのHPLC−級メタノールに溶解した。

この試料のＣ−8,5μｍカラム上でのHPLCによる分析
と、そのスペクトルデータにより、二量体:3′,4′−ア
ンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、カサリン及
びリュロシンの存在が示された。シリカゲルTLC分析
を、トルエン：アセトン：メタノール：水酸化アンモニ
ウム（14M,水溶液）（28:10:3:0.5）を用いて展開し、
紫外スペクトル測定及び標準サンプルと共に移動するス
ポットの硫酸第二セリウムアンモニウム発色によりさら
に前述の二量体の存在を実証した。

前述の方法により、ビンブラスチンについては3.24％
（重量％）の収率（0.005M硫酸；反応時間２時間）と、
３′,4′−アンヒドロビンブラスチンについては67.10
％（重量％）の収率（0.005M HCl;反応時間２時間）が
得られた。

実施例４ 0.5mgのカサランチン（硫酸塩として）及び0.5mgのビ
ンドリン（HCl塩として）を含有する非緩衝水溶液反応
混合物を振とうしながら４℃で反応させた。単量体のカ
ップリングは全試料容量6.0ml中に最終濃度20mMとなる
ように塩化第二鉄を添加して開始された。１時間、２時
間、３時間、４時間反応させた後、モル過剰量の水素化
硼素ナトリウム及び1.0mlの14M水酸化アンモニウム水溶
液を加えて反応を停止した。その停止した試料を6.0ml
の酢酸エチル（HPLC−級）で３回有機抽出した。有機層
を集めて真空中で濃度乾固し、残渣を200μのHPLC−
級メタノール中に溶解した。

二量体インドールアルカロイド（３′,4′−アンヒド
ロビンブラスチン、ビンブラスチン、カサリン及びリュ
ロシン）の存在をＣ−8,5μｍカラム上HPLC分析及びト
ルエン：アセトン：メタノール：水酸化アンモニウム
（14M、水溶液）（28:10:3:0.5）の中で展開されるシリ
カゲルTLC分析の両方の組合せによって確認した。これ
ら両方のシステムにおける紫外スペクトル分析により既
知の標準と比較して前記二量体の存在を確認した。結果
は表５に示す。

前述の方法により、得られた最大収率はビンブラスチ
ンについては6.18％（重量％）（反応時間３時間）であ
り、３′,4′−アンヒドロビンブラスチンについては4
2.2％（重量％）（反応時間３時間）であった。

実施例５ ビンドリン及びカサランチンの各々0.5mgを含有する
水溶液を6.0mlの最終容量中に20mMの第二鉄イオンを含
有するpHが2.0、2.5、3.0の0.1Mグリシン緩衝液に添加
した。

断続的に攪拌しながら、１時間30℃で反応させた後、
モル過剰量の水素化硼素ナトリウム及び0.2mlの14M水酸
化アンモニウム水溶液を添加して反応を終了した。

反応混合物の抽出を酢酸エチル（HPLC−級）で３回行
って、有機層を集めて真空中で濃縮乾固し0.2mlのHPLC
−級メタノールで再び溶解した。

試料をＣ−8,5μｍカラム上でHPLC分析して得られた
結果を表６に要約する。既知の標準と同じ時間に溶離す
るピークの紫外スペクトル分析により主要な二量体の存
在を確認した。

表６の数値からも明らかなように、0.1Mのグリシン
（pH＝2.5）がこのような条件下でのAVLB製造（27.28重
量％収率）に最適である。

従って、ここに記載された反応は３′,4′−アンヒド
ロビンブラスチン及びビンブラスチンの製造に適してい
る。反応条件を操作することによりＡ−VLBまたはビン
ブラスチンのいずれか一方の好ましい生成をもたらすこ
とができる。

反応条件には低温及び複雑な系の水溶液も含まれる
が、工業上の操作は室温で行うのが好ましい、すなわ
ち、費用のかからない反応条件を用いるのがより好まし
い。本発明は室温、溶媒として非緩衝水溶液の使用など
の操作条件なども包含する。しかし、このような条件下
では、不活性雰囲気が望ましい。さらに、反応速度は必
要ならば第二鉄イオン添加の操作により制御されるべき
である。高温では、第二鉄イオンの濃度を下げることが
できる。

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】触媒として有効な量の第二鉄イオンの存在
   下でビンドリンとカサランチンをカップリングすること
   を特徴とする二量体アルカロイドを製造する方法。
2. 【請求項２】触媒として有効な濃度の第二鉄イオンを含
   有する媒体中でビンドリンとカサランチンをカップリン
   グし、３′,4′−アンヒドロビンブラスチンを得ること
   を特徴とする３′,4′−アンヒドロビンブラスチンを製
   造する方法。
3. 【請求項３】第二鉄イオンが媒体中にカサランチンに対
   してモル比で1:1から10,000:1の範囲で存在することを
   特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
4. 【請求項４】前記モル比が400:1から1,000:1の範囲であ
   ることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
5. 【請求項５】触媒として有効な濃度の第二鉄イオンを含
   有する媒体中でビンドリン及びカサランチンをカップリ
   ングし、ビンブラスチンを得ることを特徴とするビンブ
   ラスチンを製造する方法。
6. 【請求項６】第二鉄イオンが媒体中にカサランチンに対
   しモル比で1:1から10,000:1の範囲で存在することを特
   徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
7. 【請求項７】前記モル比が400:1から1,000:1の範囲であ
   ることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の方法。