DE2124023B2 - Verfahren zur selektiven Gewinnung von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder von deren Sulfaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Gewinnung von Vinblastin (früher Vincalcukoblastin), Vinleurosin (früher I.eurosin) und Vincristin (früher Leurocristin) oder von deren Sulfaten aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L.

In letzter Zeit arbeiten die Pharmakologen in der ganzen Welt mit beträchtlicher Intensität an der Herstellung cytostatisch wirkender zur medizinischen Behandlung von Krebskranken geeigneter Verbindungen. Zu den bedeutendsten Ergebnissen dieser Forschungen gehört die Auffindung der dimeren Alkaloide von Vinca rosea L. und deren Einführung in die Therapie. Diese Präparate haben sich seit nun schon beinahe einem Jahrzehnt in der klinischen Praxis auf dem Gebiet der Onkologie ais die verhältnismäßig wirksamsten Mittel erwiesen.

Das Vinblastin ist ein seit 1959 bekanntes Tumorzellen zerstörendes Mittel beziehungsweise Onkolyticum, dessen klinische Anwendung eine beträchtliche Verminderung der Zahl der weißen Blutkörperchen im Blut zur Folge hat. Es erwies sich bei öor Hodgkini sehen Krankheit, bei akuter Leukämie und auch bei resistentem Chorionkarzinom [beispielsweise Johnson» I S,, Weright, H, F., Svoboda, G. H und Vlantis, J.: Cancer Res. 20 (1960) 1016 als wirksam.

Die Wirkung des Vinleurosins ist noch weniger bekannt. Das Wirkungsgebiet scheint das gleiche wie das des Vinblastins zu sein [Johnson und Mitarbeiter: Cancer Res. 23 (1963) 1390; Antitumoral effects of Vinca rosea alkaloids. Proceeding first symposium of the G. E. A. Excerpta Medica Foundation, Amsterdam 1966].

Vincristin wurde erstmals von G. H. Svoboda beschrieben beziehungsweise isoliert [Svoboda, G. H.: Alkaloids of Vinca rosea (Catharanthus roseus) IX. Extraction and Characterisation of Leurosidine and Leurocristine. Lloydia 24 (1961) 173 bis 178]. Es stellte sich bald heraus, daß dieses neue Alkaloid, obgleich es hinsichtlich seiner Wirkung dem früher aufgefundenen Vinblastin gleicht, vom pharmakologischen Standpunkt aus wesentlich vorteilhafter ist. Bei in vitro durchgeführten Versuchen unterbindet Vincristin die Zellteilung beziehungsweise Mitose neoplastischer Zellen bei der zweiten Kernteilungsphase beziehungsweise Metaphase [beispielsweise Cardinali, G., About F.nein, M. I. M.: Studies on the Antimitotic Action of Leurocristine (Vincristine). Blood 21 (1963) 102|. Bei der klinischen Anwendung hat sich Vincristin im Vergleich zu den bisher bekannten Chemotherapeutika in Fällen von akuter Leukämie im Kindesalter als sehr vorteilhaft erwiesen. Während früher in den meisten Fällen dieser Krankheit keine therapeutischen Erfoige erzielt werden konnten, kann jetzt durch Vincristin etwa in der Hälfte der Fälle ein völliges Nachlassen beziehungsweise eine völlige Remission erreicht werden [beispielsweise Haggard, M. E.: Vincristine (NSC-67574) therapy for Acute Leukemie in Children. Cane. Cheniother. Rep. 52 (1968) 477], dem Vincristin kommt also eine lebensrettende Bedeutung zu. Auch bei bösartigen Hartgeschwulsterkrankungen im Kindesalter konnte in 65 von 94 Fällen ein bedeutender Rückgang beziehungsweise eine bedeutende Regression erreicht werden [Selavry, O., Holland, J. F. und WoImann, I. J.: Cane. Chemothcr. Rep., 52 (1968) 497].

Die vom pharmakologisehen Stundpunkt aus in Frage kommenden dimeren Alkaloide von Vinca rosea, nämlich Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin. sind sogenannte Minor-Alkaloide der Pflanze, das heißt von den mehr als 60 in der l'fliin/c vorkommenden Alkaloiden gerade solche, die nur in sehr geringen

Mengen zugegen sind. Vinblastin und Vinleurosin machen zusammen nur 1 bis 2% der Gesamtalkaloide der Pflanze aus und Vincristin kommt sogar nur in noch um 2 Größenordnungen geringeren Konzentrationen vor. Es ist daher verständlich, daß deren Abtrennung von den anderen Alkaloiden, Gewinnung und Herstellung in einer für Arzneimittel zu fordernden Reinheit ein sehr sorgfältiges Verfahren erfordert, das wesentlich komplizierter als die für die Abtrennung der Alkaloide bekannten Verfahren ist.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Gewinnung von Vinblastin und Vinleurosin sowie Vincristin bekannt [Nobel, R. L. und Mitarbeiter: Ann. N. Y. Acad. Sei. 76 (1958) 882; britische Patentschrift 870723; US-Patentschriften 3097131 und 3205220; Svoboda, G. H. und Mitarbeiter: J. Am. Assoc. Sei, ed. 48 (1959) 659; ungarische Patentschriften 153200 und 154715; belgische Patentschrift 624046], die alle auf einem sauren oder basischen Aufschluß der getrockneten D;v!ge beziehungsweise einer sauren oder basischen Vorbehandlung, der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, der bei einem oder zwei verschiedenen pH-Werten erfolgenden Überführung der Alkaloide aus wäßriger Lösung in das organische Lösungsmittel und schließlich der chromatographischen Fraktionierung des in das organische Lösungsmittel überführten Alkaloidgemisches beruhen.

Obwohl im Laufe der weiteren Entwicklung die 3 pharmakologisch verwendbaren dimeren Alkaloide mit den angeführten Verfahren in immer besserer Qualität und immer besseren Ausbeuten aus der Droge isoliert werden konnten, bereitet der mehrfache Phasenwechsel, hauptsächlich jedoch die komplizierte chromatographische Trennung noch immer Schwierigkeiten bei der technischen Anwendung dieser Verfahren. Die Kompliziertheit der chromatographischen Trennung ist leicht an der Tatsache zu erkennen, daß die 3 dimeren Alkaloide Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin aus der mehr als 60 Alkaloide enthaltenden Gesamtalkaloidmenge, in welcher sie nur in Mengen von 1 bis 2% vorliegen, angereichert und danach isoliert und schließlich in einer der Verwendung als Arzneimittel entsprechenden Reinheit hergestellt werden müssen. Die chromatographische Trennung der Gesamtalkaloide ist ein sehr umständlicher, langwieriger und große Sorgfalt beanspruchender Arbeitsgang und erfordert chromatographische Trennsäulen von sehr großen Abmessungen. Die Größe der chromatographischen Einrichtung ist außer durch die Maße der Trennsäule auch durch die Menge des zur Trennung zu verwendenden Aluminiumoxids gut gekennzeichnet. So sind nach der ungarischen Patentschrift 154715 zur Gewinnung von 150 g Vinblastin, das aus 1 t Droge zu erhalten ist, 240 kg Aluminiumoxid erfordeilich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Behebung der Nachteile der Verfahren des Standes der Technik ein Verfahren zur selektiven Gewinnung von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder von deren Sulfaten zu schaffen, welches gegenüber den bekannten Verfahren eine wesentliche Vereinfachung beziehungsweise eine Beseitigung der Nachteile der auf mehrfachem Phasenwechsel und einer komplizierten chromatographischen Trennung beruhenden Verfahren, eine beträchtliche Verminderung der Abmessungen derchromatographischen Hinrichtung und weiterhin die gleichzeitige Gewinnung der 3 herzustellenden dimeren Alkaloide in besseren Ausbeuten als bisher und in entsprechender Qualität ermöglicht.

Die obigen Vorteile wurden überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß aus dem aus der Droge hergestellten große Mengen roher Alkaloide enthaltenden Gemisch ein überwiegend aus Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin bestehendes Alkaloidsulfatgemisch unmittelbar abgeschieden werden kann, aus dem in verhältnismäßig einfacher Weise die obigen Bestandteile zu gewinnen sind. Während der Versuche wurde nämlich festgestellt, daß diese 3 dimeren Alkaloide abweichend von den bisherigen Verfahren in wesentlich ■'!infacherer Weise zu gewinnen sind, wenn diese vor der chromatographischen Trennung angereichert werden und dieses die gewünschten dimeren Alkaloide zu etwa 70% enthaltende angereicherte Alkaloidkonzentrat chromatographiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren 7ur selektiven Gewinnung von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder von deren Sulfaten durch Extrahieren von Pflanzenteilen von Vinca rosea L. mit wäßrigem Methanol, Einengen des Auszuges, bis er praktisch frei von Methanol ist, Ansäuern der eingeengten Lösung, Filtrieren, Extrahieren der sauren wäßrigen Lösung mit mit Wasser nicht mischbarer. Lösungsmitteln, Alkalischmachen der wäßrigen Phase, Extrahieren der alkalischen wäßrigen Phase mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln und Eindampfen der getrockneten organischen Phase zur Trockne und Trennen des Gemisches der Gesamtalkaloide durch Chromatographieren an teilweise mit Wasser desaktiviertem Aluminiumoxyd, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Extrahieren der Pflanzenteile mit neutralem 5 bis 20% Wasser enthaltendem Methanol durchführt, das in bekannter Weise erhaltene Gemisch der Gesamtalkaloide in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol so löst, daß die Lösung einen pH-Wert von 4 bis 5 besitzt, dann aus der äthanolischen Lösung das Gemisch der Sulfate von Vinblastin, Vinieurosin und Vincristin kristallisiert, die abfiltrierten, noch geringe Mengen Begleitstoffe enthaltenden Sulfate entweder

a) in einem Gemisch von Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis von 2: 1 löst und an mit Wasser teilweise desaktiviertem Aluminiumoxyd chromatographiert, mit dem genannten Lösungsmitteigemisch fraktioniert eluiert oder

b) in Wasser löst, die Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 bis 9 einstellt und mit Chloroform ausschüttelt, die getrocknete Chloroformlösung zur Trockne eindampft, den Rückstand in einem Gemisch von Benzol und Chloroform im Verhältnis von 1: 1 löst und an mit Wasser teilweise desaktiviertem Aluminiumoxid chromatographiert, mit dem genannten Lösungsmittelgemisch fraktioniert eluiert

und aus den verschiedenen L-Iuatfraktionen durch Eindampfen zur Trockne Vincristin und ein Gemisch von Vinblastin und Vinleurosin gewinnt, das Vinblastin-Vinleurosin-Gemisch in wasserfreiem Äthanol löst, Vinleurosin auskristallisieren läßt und abtrennt, Vinblastin aus der Mutterlauge des Vinleurosins mit iithanolischer Schwefelsäure als Sulfat fällt und abtrennt und Vincristin, gegebenenfalls nach Lösen in Methanol und Kristallisieren als Base aus dieser Lösung, in wasserfreiem Äthanol löst und mit äthunoli-

scher Schwefelsäure als Sulfat abscheidet.

Bei dieser Anwendung werden die 3 dimeren Alkaloide vom überwiegenden Teil der Begleitalkaloidc in Form der Sulfatsalze abgetrennt, ohne sie vor oder während der Extraktion einner heiklen basischen oder sauren Behandlung zu unterwerfen. Daher ist die Konzentration der 3 dimeren Verbindungen 30- bis 40mal höher als in den bei den bekannten Verfahren zur chrc.natographischen Fraktionierung kommenden Alkaloidgemischen. Die chromatographische Trennung ist somit viel einfacher und mit wesentlich kleiner dimensionierten Trennsäulen zu erreichen, weil die gewünschten dimeren Alkaloide von nur in kleinen Mengen vorliegendem Begleitmaterial abzutrennen sind. Die vorteilhafte Vereinfachung und Verringerung der Säulenabmessungen bei der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführenden chromatographischen Trennung kann am einfachsten durch die Aluminiumoxydmenge, die für die Fraktionierung des aus 1 t der Droge erhaltenen Alkaloidgernisches erforderlich ist, ausgedrückt werden. Diese Menge beträgt beim erfindungsgemäßen Verfahren 8 bis 100 kg, vorzugsweise etwa 20 kg, während bisher 240 kg benötigt wurden.

Die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorteilhafterweise in folgender Weise:

Die gemahlene Droge (Vinca rosea L.) wird mit 5 bis 20%, vorteilhafterweise 10%, Wasser enthaltendem Methanol mehrmals ausgelaugt, und die filtrierten und vereinigten Auszüge werden unter vermindertem Druck bis zur Entfernung praktisch des ganzen Methanols eingeengt. Danach wird der wäßrige Rückstand zur Entfernung der nicht zu den Alkaloiden gehörenden Begleitbestandteile mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert und der entstehende Niederschlag wird abfiltriert. Die saure wäßrige Lösung wird mehrmals mit Benzol ausgelaugt, danach wird die abgetrennte saure wäßrige Phase alkalisch gemacht und die alkalische wäßrige Lösung ebenfalls mit Benzol mehrmals ausgelaugt, bis sie alkaloidfrei ist. Die bei dem Auslaugen der alkalischen wäßrigen Lösung erhaltenen vereinigten benzolischen Lösungen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. So wird ein braunes amorphes Alkaioidgemisch von !ockerer Struktur erhalten. Dts Alkaioidgemisch wird in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol gelöst, wobei zugleich der pH-Wert der Lösung auf 4,0 bis 5,0 eingestellt wird. Die Lösung wird mit Kristallen der dimeren Alkaloidsulfate angeimpft, und die Kristallisation wird durch Kratzen der Gefäßwand in Gi:.ng gebracht, worauf 2 Tage lang bei Zimmertemperatur kristallisieren gelassen wird. Das ausgeschiedene und abfiltrierte aus den Sulfaten von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende Kristallgemisch wird gelöst und direkt chromatographiert. Zum Lösen und Eluieren wird ein Gemisch aus Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis von 2:1 und zur chromatographischen Trennung eine mit Wasser teilweise desaktiviertes Aluminiumoxid enthaltende Trennsäule verwendet. Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten den überwiegenden Teil der noch vorhandenen Begleitalkaloide und die Fraktionen 2 bis 9 Vinblastin und Vinleurosin. Vincristin beginnt in der 9ten Fraktion in Spuren zu erscheinen und die Elution ist mit der 18ten Fraktion beendet. Die das Vinblrstin und Vinleurosin enthaltenden Fraktionen werden zur Trockne eingedampft, danach wird der Rückstand in Äthanol gelöst, und nach dem Auskristallisieren des Vinleurosins wird Vinblastin aus der Mutterlauge mit verdünnter äthanolischer Schwefelsäurelösung, die zweckmäßigerweise höch-• stens 10% Schwefelsäure enthält, in Form des Sulfates gefällt, abfiltriert und danach zur weiteren Reinigung umkristallisiert.

Auch die das Vincristin enthaltenden Fraktionen können in der Weise aufbereitet werden, daß der

in Trockenrückstand in Äthanol gelöst und das Vincristin auskristallisieren gelassen wird, welch letzteres in gleicher Weise wie oben beschrieben durch Lösen in verdünnter äthanolischer Schwefelsäure und Abscheiden des kristallinen Sulfates gereinigt wird.

I^ Es kann auch so verfahren werden, daß die Alkaloidbasen chromatographiert werden. In diesem Fall wird das aus den Sulfaten von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende Kristallgemisch in Wasser gelöst und die Lösung mit Am;no-

·?'> niak auf einen pH-Wert vor Δ,Ο bis 9,0 eingestellt. Aus der alkalischen Lösung werdr η die Aikaioidbasen mit Chloroform wiederholt ausgeschüttelt, und die vereinigten Chloroformlösungen werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und

-'"> drnach unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das hauptsächlich die drei dimeren Alkaloide enthaltende Alkaloidbasengemisch wird in einem Benzol und Chloroform im Verhältnis von 1 : 1 enthaltenden Gemisch gelöst un J an einer Trennsäule

in an mit Wasser teilweise desaktiviertem Aluminiumoxid chromatographiert. Zum Eluieren wird ein Lösungsmittelgemisch gleicher Zusammensetzung verwendet. Die Fraktionen 1 bis 10 enthalten Vinblastin und Vinleurosin und die Fraktionen 13 bis 17 Vincri-

>'> stin. Die Aufbereitung der auf papier- beziehungsweise dünnschichtchromatographitchem Wege identifizierten Vinblastin undVinleurosin beziehungsweise Vincristin enthaltenden Fraktionen orfoljjt in der bereits weiter oben beschriebenen Weise.

4Ί Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es wurden 100 kg getrocknete, hauptsächlich aus

1> Blättern bestehende gemahlene Pflanzenteile von Vinca rosea L. lmal mit 600 I und 2mal mit je 400 I 90%igem wäßrigem Methanol ausgelaugt. Die filtrierten und vereinigten methanolischen Auszüge wurden unter vermindertem Druck auf 140 bis 150 I

><> (bis sie praktisch frei von Methanol waren) eingeengt. Danach wurde zur Entfernung der verschiedenen extrahierten nicht den Alkaioiden angehörenden Verbindungen mit dem gleichen Volumen 5%iger wäßriger Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von 2

v> angesäuert, und der gebildete dunkelfarbige Niederschlag wurde abfiltriert. Die filtrierte saure wäßrige Lösung wurde 3mal mit je 500 I Benzol ausgelaugt und danach wurde der pH-Wert der die Alkaloide enthaltender abgesonderten sauren wäßrigen Phase

mi mit konzentrierter wäßriger Ammoniumhydroxydlösung auf 8,5 bis 9,0 eingestellt. Danach wurde die alkalische wäßrige Lösung 3- bis 4ηιεΙ mit je 600 1 Benzol, bis sie alkaloidfrei war, ausgelaugt. Die vereinigten benzolischen Lösungen wurden über was-

i>. serfreiem Nat.iumsulfat oder Kaliumcarbonat getrocknet und danach wurde die filtrierte benzolische Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurden etwa 700 g eines braunen Alkaloids-miseries

von lockerer Struktur erhalten.

Das Alkaloidgemisch wurde in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol gelöst, wobei darauf zu achten war, daß der pH-Wert der Lösung zwischen 4.0 und 5,0 lag. Die Lösung wurde mit Vinblastinsulfatkristallen angeimpft, und die Kristallabscheidung begann bald nach dem Kratzen der Gefäßwand.

Es wurde 2 Tage lang bei Zimmertemperatur kristallisieren gelassen, und danach wurden die ausgeschiedenen Kristalle mittels eines Glasfilters abfiltriert.

Die Ausbeute betrug je nach der Qualität der Droge 20 bis 100 g eines aus Vinblastin-, Vinleurosin- und Vincristinsulfat sowie den Sulfaten der Begleitalkaloide bestehenden Kristallgemisches. Das Kristallgemisch der rohen Alkaloidsulfate wurde in einem Zum Zwecke der Identifizierung wurde das Vinblastinsulfat in die Base überführt und aus dieser durch Umkristallisation aus Äther Vinblastin-Ätherat hergestellt; Schmelzpunkt: 201 bis 211° C; [α] 26=+42° (CHCl,).

Der auf chromatographischem Wege abgetrennte Vincristin enthaltende amorphe Trockenrückstand von 0,6 bis 3,0 g wurde in der lOfachen Menge wasserfreiem Äthanol gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit äthanolischcr Schwefelsaure auf 4,0 eingestellt. Zur vollständigen Kristallisation des Vincristinsulfatcs wurde die Lösung 16 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Die Menge des abfiltricrlen rohen Vincristinsulfates betrug 60 bis 70% des gelösten Vincristin enthaltenden amorphen Trockenrückstandes.

Zur Umkristallisation wurde das rohe Vincristin-

2 1 enthaltenden Gemisch gelöst, und zwar wurden 7 cm' pro g verwendet. Diese Lösung wurde an einen mit der 1 OOfachcn Menge mit Wasser teilweise desaktiviertem Aluminiumoxid, bezogen auf das Kristallgemisch der rohen Alkaloidsulfate, gefüllten Säule chromatographiert und danach mit einem Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis von 2: 1 enthaltenden Gemisch eL'iert. Es wurden 18 Fraktionen von je 300 cm' (im Falle der Trennung von 20 g Kristallgemisch) bis 500 cm' (im Falle der Trennung von 100 g Kristallgemisch) aufgefangen. Die ersten 3 Fraktionen enthielten den überwiegenden Teil der Begleitalkaloide. Vinblastin und Vinleurosin wurden in der 2ten bis 9ten Fraktion erhalten. Vincristin begann in Spuren in der 9ten Fraktion zu erscheinen und wurde bis zur 18ten Fraktion eluiert. Die auf papier- beziehungsweise dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin beziehungsweise Vincristin enthaltenden Fraktionen wurden getrennt zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 15 bis 75 g eines Vinblastin und Vinleurosin beziehungsweise 0.6 bN 3.0 g eines Vincristin enthaltenden amorphen Trockcnrückstandes.

Der das Vinhlastin und Vinleurosin enthaltende Trockenrückstand wurde in der 15fachen Menge Äthanol gelöst. Das Vinleurosin kristallisierte aus und wurde abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute je nach der Qualität des Rohstoffes 5 bis 17 g Vinleurosin: Schmelzpunkt: 202 bis 205 C; [a] ²^= -72' (CHCI.).

Die Mutterlauge des Vinleurosins. die nun nur noch Vinblastin enthielt wurde mit wasserfreiem Äthanol auf das 2fache Volumen verdünnt, und der pH-Wert der Lösung wurde mit äthanolischer Schwefeisäurelösung auf 4,0 eingestellt. Die Kristallisation des Vinblastinsuifates begann schon während der Zugabe der äthanolischen Schwefelsäure. Dann wurde 16 Stunden im Kühlschrank kristallisieren gelassen. Ausbeute: je nach der Qualität des Rohstoffes 15 bis 70 g rohes Vinblastinsulfat.

Das getrocknete und gepulverte rohe Vinblastinsulfat wurde bei Zimmertemperatur in der 20fachen Menge wasserfreiem Methanol gelöst, und zu der filtrierten Lösung wurde das 4fache Volumen wasserfreies Äthanol zugegeben. Zur vollständigen Kristallisation des Vinblastins wurde die Lösung 16 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Bei der Umkristaiiisation war eine 90<7cige Ausbeute zu erzielen. Ausbeu'.e: je nach der Qualität des Rohstoffes 13 bis 63 g Vinblastinsulfat; [a]²^= -28'^J (CHCI₃).

.φ
wurde die 4fache Menge Äthanol zugegeben, die Lösung wurde zur Kristallisaton 16 Stunden im Kühlschrank stehengelassen und filtriert; Ausbeute: 0.3 bis 1,5 g Vincristinsulfat; Schmelzpunkt: 218 bis 220 C.

Es konnte auch so verfahren werden, daß der auf chromatographischem Wege abgetrennte Vincristin enthaltende amorphe Trockenrückstand von 0.6 bis 3.0 g in W 5- bis lOfachen Menge wasserfreiem Methanol gelöst und die Vincristinbase zur Kristallisation gebrach! wurde, die in der gleichen Weise wie oben beschrieben in wasserfreiem Äthanol gelöst und durch Abscheiden als kristallines Sulfat gereinigt wurde.

Beispiel 2

Das nach Beispiel 1 gewonnene je nach der Qualität der Droge aus 20 bis 100 g Sulfaten von Vinleurosin. Vinblastin, Vincristin und Begleitalkaloiden bestehende rohe Kristallgemisch wurde in Wasser gelöste und die Lösung wurde mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8.0 bis 9,0 eingestellt. Die Alkaloide wurden aus der Lösung 4mal mit je 1 I Chloroform ausgeschüttelt, und die vereinigten Chloroformlösungen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert und danach unter vermindertem Druck zurTrockne eingedampft. Ausbeute: 16 bis 80 g eines Gemisches der Alkaloidbasen. Diese Masse wurde in der 3- bis 4fachen Menge eines aus Benzol und Chloroform im Verhältnis von 1 :1 bestehenden Gemisches gelöst und danach an einer mit etwa der 40fachen Menge von durch Wasser teilweise desaktivier..-m Aluminiumoxid, bezogen auf das Kristallgemisch der rohen Alkaloidsulfate, gefüllten Säule Chromatographien. Als Elutionsgemisch wurde ein Gemisch aus Benzol und Chloroform im Verhältnis von 1:1 verwendet.

Nach dem Ablaufen der ersten 2 bis 10 1 des Eluates, die nur geringe Mengen von Begleitalkaloiden enthielten, wurden 17 Fraktionen von je 0,6 1 (im Falle der Trennung von 20 g Kristallgemisch) bis 3,0 1 (im Falle der Trennung von 100 g Kristallgemisch) aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 10 enthielten Vinblastin und Vinleurosin, und die Fraktionen 11 bis 12 waren schon vinblastin- und vinleurosinfrei. Danach wurde je nach der Menge des aufgegebenen Kristaiigemisches mit 3 bis 18 i des aus Benzol und Chloroform im Verhältnis von 1:1 bestehenden Gemisches weiter eluiert, wobei Fraktionen von 0,6 bis 3,6 I aufgefangen wurden. Die Fraktionen 13 bis 17 enthielten

Vincristin.

Die Aufbereitung der auf papier- beziehungsweise dünnschichtchromatographischem Wege identifizierten Vinblastin und Vinleurosin beziehungsweise Vincristin enthaltenden Fraktionen wurde in der im Bei-

spiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt.

Es wurden dieselben Ausbeuten an Vinleurosin, Vinblastinsulfat und Vincristinsulfat wie im Beispiel 1 mit den in diesem angegebenen physikalischen Konstanten erhalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur selektiven Gewinnung von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder von deren Sulfaten durch Extrahieren von Pflanzenteilen von Vinca rosea L. mit wäßrigem Methanol, Einengen des Auszuges, bis er praktisch frei von Methanol ist, Ansäuern der eingeengten Lösung, Filtrieren, Extrahieren der sauren wäßrigen Lösung mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, Alkalischmachen der wäßrigen Phase, Extrahieren der alkalischen wäßrigen Phase mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln und Eindampfen der getrockneten organischen Phase zur Trockne und Trennen des Gemisches der Gesamtalkaloide durch Chromatographieren an teilweise mit Wasser desaktiviertem Aluminiumoxyd, dadurch ge kennzeich net, daß man das Extrahieren der Pflanzenteile mit neutralem 5 bis 20 % Wasser enthaltendem Methanol durchführt., das in bekannter Weise erhaltene Gemisch der Gesamtalkaloide in höchstens 10% Schwefelsäure enthaltendem Äthanol so löst, daß die Lösung einen pH-Wert von 4 bis 5 besitzt, dann aus der äthano-Iischen Lösung das Gemisch eier Sulfate von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin kristallisiert, die abfiltrierten, noch geringe Mengen Begleitstoffe enthaltenden Sulfate entweder

   a) in einem Gemisch von Methylenchlorid und Chloroform im Verhältnis von 2:1 löst und an mit Wasser teilweise desaktiviertem Aluminiumoxyd Chromatographien, mit dem genannten Lösungsmittelgemisch fraktioniert eluiert oder

   b) in Wasser löst, die Lösung mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 bis 9 einstellt und mit Chloroform ausschüttelt, die getrocknete Chloroformlösung zur Trockne eindampft, den Rückstand in einem Gemisch von Benzo! und Chloroform im Verhältnis von 1:1 löst und an mit Wasser teilweise desaktiviertem Aluminiumoxyd Chromatographien, mit dem genannten Lösungsmittelgemisch fraktioniert eluiert

   und aus den verschiedenen Eluatfraktionen durch Eindampfen zur Trockne Vincristin und ein Gemisch von Vinblastin und Vinleurosin gewinnt, das Vinblastin-Vinleurosin-Gemisch in wasserfreiem Äthanol löst, Vinleurosin auskristallisieren läßt und abtrennt, Vinblastin aus der Mutterlauge des Vinleurosins mit äthanolischer Schwefelsäure als Sulfat fällt und abtrennt und Vincristin, gegebenenfalls nach Lösen in Methanol und Kristallisieren als Base aus dieser Lösung, in wasserfreiem Äthanol löst und mit äthanolischer Schwefelsäure als Sulfat abscheidet.