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Verfahren zur Gewinnung virusaktiver reiner Substanzen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Gewinnung zweier Wirkstoffe in reiner Form, im folgenden Wirkstoff 21548/A und Wirkstoff 21548/C genannt, sowie ihrer Säurederivate und Salze dieser Verbindungen. Die neuen Wirkstoffe lassen sich aus Pflanzen der Familie der Melianthaceen, in erster Li-
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wiesama lucens, Bersama swinnyi, Bersama tysoniana, Bersama abyssinica, Bersama kivuensis, vorzugsweise aus Bersama cf. hebecalyx, gewinnen.
Die Pflanzen der Familie der Melianthaceae, insbesondere der Gattung Bersama, sind Bäume, Sträu- cher oder Halbsträucher des tropischen Afrika, die von Abessinien bis Angola und in Südafrika zu finden sind. Chemisch wurden diese Pflanzen noch nicht untersucht, Ebensowenig ist ein reiner Wirkstoff daraus bis heute isoliert worden.
Aus den genannten Pflanzen lassen sich nun zwei neue Wirkstoffe isolieren, nämlich eine farblose bis
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- 3230 schmilzt.Methanol, Aceton oder halogenierten Kohlenwasserstoffen, Äther, Hexan oder Wasser, praktisch unlöslieh.
Die neuen Wirkstoffe, deren Säurederivate, vorzugsweise deren Ester, und Salze dieser Verbindungen sind gegen Virusinfektionen wirksam. Dies konnte z. B. in Versuchen mit Ektromelia gezeigt werden.
Mäuse, die mit Mäusepockenvirus (einem Virus, das dem menschlichen Pockenvirus nahe verwandt ist) inokuliert wurden, werden durch tägliche Verabreichung der neuen Präparate geschützt. Der therapeutische Effekt wird mit Dosen erreicht, die von den behandelten Tieren gut vertragen werden. Die neuen Präparate können in Fällen von dermatotropen, viscerotropsn und neurotropen Virusinfektionen, z. B.
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Die neuen wirkstoffe werden erhalten, wenn man Pflanzenteile aus Melianthaceen unter Erhitzen bis zirka 1000 C mit einem wässerigen, organischen oder wässerig-organischen Extraktionsmittel extrahiert,
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schen nicht mischbaren Lösungsmitteln in reiner Form isoliert.
Die Extraktion, wie auch die Isolierung der neuen Verbindungen kann man auf verschiedene Weise nach an sich bekannten Methoden vornehmen. So ist es vorteilhaft, die genannten Pflanzen, insbesondere Rindenmaterial, in erster Linie Wurzelrinde von Bersama cf. hebecalyx mit Alkoholen, wie Methanol, Äthanol, Propanol oder halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie Chloroform, Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Trichloräthylen, mit Benzol oder Dioxan bzw. ihren Gemischen, gegebenenfalls in Gegen- wart von Wasser, wässerigen Säuren, wie wässerige Essigsäure, oder mit alkalischen Mitteln, wie anorgani- schen oder organischen Basen, z. B. Natriumcarbonat oder-bicarbonat, zu extrahieren.
Den erhaltenen
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So kann man-ihn in Methylcellosolve-Wassergemischen aufnehmen und die neuen Verbindungen durch Eindampfen, Kristallisieren und Umkristallisieren isolieren. Ferner lassen sich die neuen Verbindungen
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nannten Extrakten abtrennen.
Eine bevorzugte Verfahrensmethode besteht darin, dass man die Wurzel- bzw. Stammrinden mit wässerigem Methanol anteigt, dann mit technischem Methanol am Rückfluss mehrere Stunden extrahiert und die Lösung im Vakuum auf ungefähr 10% ihres Volumens einengt. Man lässt dann über Nacht kristal- sieren, nutscht das erhaltene Kristallisat ab und nimmt es in einem Gemisch vonMethylcellosolve-Was- ser (2 : 1) bei 40 auf. Das nach dem Abkühlen erhaltene Kristallisat wird abfiltriert und stellt den Wirkstoff 21548/C dar. Die Mutterlaugen werden auf 1/2-1/3 ihres Volumens eingedampft und mit 2 Volumen Methanol versetzt, worauf man nach dem Abkühlen und Stehenlassen den Wirkstoff 21548/A abtrennt.
Das erhaltene Filtrat wird erneut mit ungefähr 2 Volumen Methanol versetzt, wobei man nach dem Stehenlassen und Abkühlen erneut Kristalle des Wirkstoffes 21548/A erhält.
Je nach der Arbeitsweise gewinnt man die neuen Verbindungen in Form der Säure oder ihrer Salze.
Aus den Säuren können therapeutisch verwendbare Salze gebildet werden, wie diejenigen von Alkalioder Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Magnesium oder Calcium, indem man die neuen Verbindungen mit den Hydroxyden oder Carbonaten dieser Metalle in An- oder Abwesenheit von Verdünnungmitteln umsetzt. Sie lassen sich auch in an sich bekannter Weise, z. B. durch Veresterung mit Alkoholen, in ihre funktionellen Säurederivate überführen.
Die neuen Wirkstoffe, ihre Säurederivate und Salze können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden, welche sie in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder topicale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial enthalten. Für die Bildung desselben kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Wasser, Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Kalk, pflanzliche Öle, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragées, Salben, Cremen oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw.
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oder Emulgiermittel,Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 ! 4, 23 kg fein gemahlene Stammrinde von Bersama cf. hebecalyx werden mit 31 eines chemisches anus gleichen Teilen Methanol und Nasser angeteigt und mit 61 Methanol 2 Stunden am Rückfluss extrahiert. Die Extraktlösung wird dann unter vermindertem Druck auf ein Volumen von zirka. O. 51 eingeengt, wobei sich Kristalle an der Kolbenwand abscheiden. Man lässt über Nacht stehen, filtriert ab und wäscht den Filterrückstand mit Methanol. Man erhält so 29, 5 g Rohkristallisat, das einen Schmelzpunkt von etwa 2500 besitzt.
Der im Extraktor verbliebene Drogenrückstand wird nochmals mit 6 1 Methanol 4 Stunden extrahiert.
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3 list, noch 8. 8 g Rohkristallisat. Aus einer dritten, sesti1ndigen Rückflussextraktion des Drogenrückstan- des mit 5 1 Methanol erhält man nur noch Spuren von kristallisiertem Material.
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wärmen auf 35 - 400 und starkem Rühren grösstenteils gelöst. Dann trennt man die noch in der Lösung suspendierten feinen Kristalle durch Filtration durch ein Sinterglasfilter FG 4 ab und erhält 6, 3 g Rohkristallisat des Wirkstoffes 21548/C.
Dieses lässt sich aus einem grossen Volumen eines Methylcellosolve-
Wasser-(2:1)-Gernisches umkristallisieren und bildet dann farblose Nädelchen, welche bei zirka 3200 schmelzen.
Die Mutterlauge dieser Kristalle wird im Vakuum auf ein Volumen von 150 cnr* eingeengt, wobei sich Kristalle an den Wänden abzuscheiden beginnen, dann werden 400 cm3 Methanol zur Lösung gegeben und das Gemisch Über Nacht bei 40 stehen gelassen. Man filtriert und erhält 9, 06 g Rohkristallisat des Wirkstoffes 21548/A vom F. 262.. 2640 (Zersetzung). welches sich durch eine weitere Umkristallisation in dem oben beschriebenen Lösungsmittelgemisch und durch anschliessende Kristallisation aus Methanol weiter reinigen lässt und schwachgelbe Nadeln vom Schmelzpunkt 267 - 2680 (Zersetzung) gibt.
Die Mutterlauge des Rohkristallisates wird im Vakuum auf ein Volumen von zirka 30 cmS eingeengt und nach Zugabe von 60 cm3 Methanol über Nacht stehen gelassen. Dabei kristallisieren noch 2, 1 g unreine Substanz 21548/A, welche durch Abfiltrieren isoliert werden.
Beispiel 2 : 100 g fein gemahlene Wurzelrinde werden mit 750 cm3 Methanol während 4 Stunden am Rückfluss extrahiert. Der Drogenrückstand wird ein zweites Mal mit 300 cms Methanol während 3 Stunden ausgezogen. Die vereinigten Extraktlösungen engt man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 80 en ein und lässt mehrere Wochen bei 40 stehen. Dabei entsteht am Kolbenboden ein Gemenge von mikroskopisch feinen Nädelchen der Wirkstoffe 21548/A und/C und von grossen, bis 6 mm Kantenlänge messenden Prismen von Rohrzucker.
Die nach dem Abfiltrieren erhaltenen Kristalle werden in Wasser aufgenommen, das Unlösliche durch Filtrieren abgetrennt und mit Wasser nachgewaschen. Nach dem Trocknen wiegt der feinkristalline Rück-
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solve und Wasser (2 : 1) leicht in die Wirkstoffe 21548/A und/C trennen lässt.
Beispiel 3 : 500 g fein gemahlene Wurzelrinde werden mit 0, 5 1 eines Gemisches von 90 Teilen Methanol und 10 Teilen Wasser angefeuchtet und mit 4,5 1 Methanol perkoliert. Durch Einengen der Ex-
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Nacht stehen gelassen. Das dabei abgeschiedene Kristallisat des Wirkstoffes 21548/A lässt sich durch wiederholte Kristallisation aus heissem Methanol weiter reinigen.
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in den ersten fünf Rohren einer Glasapparatur (nach Craig) in jeweils 25 ml oberer und unterer Schicht gelöst und über 50 Stufen verteilt. Der Inhalt der Rohre Nr. 30-33, welche die Spitzenfraktionen enthal- ten, wird vereinigt und gibt, aus Methanol kristallisiert, 125 mg reinen Wirkstoff 21548/A vomF. 267- 268 .
Beispiel 5 : 11 kg Wurzelrinde von Bersama cf. hebecalyx werden fein gemahlen, in 2 gleiche
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wei-3"4 Stunden.
Die Extraktlösungen werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. bis ein harziger Rückstand übrigbleibt. Dieser wird in 11 Chloroform aufgenommen, wobei beim Schütteln der grSSte Tedl in Lösung geht. Die an der Kolbenwand haftenden und in der Lösung suspendierten Teilchen bilden ein in kaltem
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mit konzentrierter methanolischer Salzsäure ansäuert, wobei die Substanz als schwach gelbliches Kristallisat ausfällt. Wiederholte Nachextraktion des Nutschenrückstandes mit nachfolgendem Ansäuern führt schliesslich zu insgesamt 3, 9 g gereinigten, blassgelben Kristallen vom F. 315 - 3210.
Zur weiteren Reinigung wird die Substanz in heissem Chloroform gelöst, die Lösung filtriert und nach Zugabe von zirka 1/10 Volumen Methanol unter leicht reduziertem Druck bis auf ein kleines Volumen eingeengt. Wird diese Operation wiederholt, so erhält man die Reinsubstanz als schwach gelblich gefärbte Nädelchen vom F. 320 - 3230 (Koflerblock). Bei langsamer Steigerung der Temperatur beginnt die Substanz bereits bei zirka 2600 langsam zu sublimieren.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung virusaktiver, reiner Substanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man Pflanzenteile aus Melianthaceen unter Erhitzen bis zirka 1000 C mit einem wässerigen, organischen oder wässerig-organischen Extraktionsmittel extrahiert, und aus dem Extrakt die Wirkstoffe 21548/C, eine aus Methylcellosolve-Wasser oder Chloroform-Methanol in Nädelchen kristallisierende Substanz vomF. 320 - 3230 mit Säurecharakter, und 21548/A, eine aus Methylcellosolve-Wasser kristallisierende Substanz vom F. 267 - 2680 (Zersetzung) mit Säurecharakter, durch teilweises Eindampfen, Kristallisation, Adsorption und bzw. oder Verteilung zwischen nicht mischbaren Lösungsmitteln in reiner Form isoliert.