Verfahren zur Reindarstellung von Cozymase Hinsichtlich der Gewinnung
von Cozymase (Diphosphopyridinnucleotid) sind in neuerer Zeit verschiedene Vorschläge
zur Verbesserung der bis dahin üblichen Verfahren (vgl. »Biochemical Preparations«,
Vol. I, S. 28, 1949) gemacht worden. Durch Anwendung moderner Methoden, wie
die der Gegenstromverteilung und des Ionenaustausches, ist es gelungen, wesentliche
Vereinfachungen bezüglich der technischen Darstellung .dieses immer wichtiger werdenden
enzymatischen Wirkstoffes zu erzielen (vgl. unter anderem Ne i 1 a n d s und Akeson
in.»The Journal of Biological Chemistry«, Vol. 188, S. 307, 195z). Die Patentschrift
913 4o6 beschreibt ein Verfahren, nach dem es unter stufenweiser Anwendung
besonderer lonenaustauschcr erstmals möglich ist, die Cozymase in reinem Zustande
zu isolieren. Allerdings hat diese Methode noch den Nachteil, daß eine restlose
Erfassung des im Ausgangsmaterial enthaltenen Diphosphopyridinnucleotids (DPN) nur
durch eine etwas umständliche Aufarbeitung von Fraktionen niederen Wirkstoffgehaltes
möglich ist.Process for the pure preparation of Cozymase With regard to the production of Cozymase (diphosphopyridine nucleotide), various proposals have recently been made to improve the previously customary processes (cf. "Biochemical Preparations", Vol. I, p. 28, 1949). By using modern methods, such as countercurrent distribution and ion exchange, it has been possible to achieve significant simplifications with regard to the technical representation of this enzymatic active ingredient, which is becoming more and more important (see, among others, Ne i 1 ands and Akeson in "The Journal of Biological Chemistry ", Vol. 188, pp. 307, 195z). Patent specification 913 406 describes a process according to which it is possible for the first time to isolate the cozymase in a pure state with the gradual application of special ion exchangers. However, this method still has the disadvantage that a complete detection of the diphosphopyridine nucleotide (DPN) contained in the starting material is only possible through a somewhat laborious work-up of fractions with a low active ingredient content.
Der Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren, mit dessen Hilfe
es gelingt, die in dem betreffenden Ausgangsmaterial enthaltene Cozymase nahezu
quantitativ in einfacher Weise, gewissermaßen in einem Arbeitsgang, zu isolieren.
Wie nämlich gefunden wurde, bildet die Cozymase mit Basen von Chinaalkaloiden gut
kristallisierende Salze, die auf Grund ihrer Löslichkeitseigenschaften leicht abgetrennt
und gegebenenfalls umkristallisiert werden können. Die Salze lassen sich in üblicher
Weise in ihre Komponenten spalten, und nach Abtrennung der Base erhält man aus ihnen
das DPN in reiner Form.The object of the invention is now a method with the help of which
the cozymase contained in the starting material in question succeeds almost
to isolate quantitatively in a simple manner, as it were in one operation.
Namely, as has been found, the cozymase forms well with bases of china alkaloids
crystallizing salts which are easily separated due to their solubility properties
and can optionally be recrystallized. The salts can be used in usual
Way into their components, and after separation of the base one obtains from them
the DPN in its pure form.
Als zweckmäßig hat sich für die Zerlegung der Salze und Abtrennung
des freien Nucleotids auch hier wieder die Methode des Ionenaustausches erwiesen.
Schickt
man die wäßrige Salzlösung durch eine Säule eines schwach basischen Austauschers,
z. B. basische Ionenaustauscher auf Kunstharzbasis in ihrer Acetatform, so erfolgt
unter Zerlegung der Salze einAustausch des DPN gegen dieAcetationen, während das
Acetat des betreffenden Alkaloids die Säule passiert. Anschließend läßt sich das
DPN in Gegenwart einer geeigneten stärkeren Säure glatt und quantitativ eluieren
und durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in welchem es unlöslich ist,
aus dem Eluat ausfällen.It has been found to be useful for the decomposition of the salts and separation
of the free nucleotide here, too, the method of ion exchange has again been demonstrated.
Sends
the aqueous salt solution through a column of a weakly basic exchanger,
z. B. basic ion exchangers based on synthetic resin in their acetate form, so takes place
with decomposition of the salts, an exchange of the DPN for the acetations, while the
Acetate of the alkaloid in question passed the column. Then you can
Elute DPN smoothly and quantitatively in the presence of a suitable stronger acid
and by adding an organic solvent in which it is insoluble,
precipitate from the eluate.
Man kann die erfindungsgemäß vorzunehmende Isolierung des Diphosphopyridinnucleotids
als Salz eines Chinaalkaloids aber auch durch doppelte Umsetzung geeigneter Salzpaare
bewirken. So können Lösungen, in denen das DPN in Anwendung der üblichen Methode
als Ba-Salz angereichert vorliegt, mit ausreichenden Mengen von z. B. Chininsulfat
versetzt werden, worauf nach Abtrennung des Bariumsulfats eine Ausfällung der Nucleotid-Chinin-Verbindung
durch Zugabe von z. B. Benzol erfolgen kann. Eine derartige doppelte Umsetzung kann
natürlich auch unter Anwendung von geeigneten Ionenaustauschern vorgenommen werden.
Beispiel 2 g eines Blut- oder Hefekonzentrats, in welchem das Diphosphopyridinnucleotid
unter Anwendung bekannter Methoden zu 75 % angereichert ist, werden in 20 ccm Wasser
gelöst; falls die Lösung getrübt bleibt, wird zentrifugiert. Man fügt nun eine Lösung
von 2,2 g Chininbase in 17 ccm Alkohol hinzu, und unter kräftigem Schütteln
der Mischung wird so lange eine 3oo/oige Lösung von absolutem Alkohol in Benzol
zugegeben, bis alles klar gelöst ist. Man läßt die Lösung (etwa 400 ccm) bei Zimmertemperatur
zum Kristallisieren stehen; nach etwa 40 Stunden ist die Kristallisation beendet.
Die Kristalle werden abzentrifugiert, mit einer Alkohol-Benzol-Mischung gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Ausbeute an. Chininsalz 2,2 g.The isolation of the diphosphopyridine nucleotide as a salt of a quina alkaloid, which is to be carried out according to the invention, can also be brought about by double conversion of suitable salt pairs. For example, solutions in which the DPN is enriched as a Ba salt using the usual method can be mixed with sufficient amounts of z. B. quinine sulfate are added, whereupon after separation of the barium sulfate a precipitation of the nucleotide quinine compound by adding z. B. benzene can be done. Such a double conversion can of course also be carried out using suitable ion exchangers. Example 2 g of a blood or yeast concentrate in which the diphosphopyridine nucleotide is enriched to 75% using known methods are dissolved in 20 cc of water; if the solution remains cloudy, it is centrifuged. If one adds a solution of 2.2 g quinine in 1 7 cc of alcohol added, and a 3oo / o solution is added as long of absolute alcohol in benzene with vigorous shaking of the mixture is a clear solution to everything. The solution (about 400 ccm) is allowed to stand at room temperature to crystallize; after about 40 hours, the crystallization is complete. The crystals are centrifuged off, washed with an alcohol-benzene mixture and dried in vacuo. Yield to. Quinine salt 2.2 g.
Zur Freilegung des DPN löst man 4oo mg Chininsalz in 2o ccm ro n-Essigsäure.
Die Lösung wird durch eine Säule von ro ccm eines basischen Ionenaustaus,chers auf
Kurnstharzbmis in seiner Acetatform geschickt, wobei das Chininsalz unter Zurückhaltung
der Nucleotidkomponente gespalten wird; es wird bis" zur Chininfreiheit nachgewaschen.
Nun wird die Säule so lange mit etwa 8,5°/aiger Ameisensäure durchspült, bis in
einer Probe des Eluates kein DPN mehr nachweisbar ist. Aus den gegebenenfalls eingeengten
Eluaten wird der Wirkstoff durch Zugabe von Aceton ausgefällt. Man erhält nach dem
Trocknen 240 mg freies Diphosphopyrindinnucleotid.To expose the DPN, 400 mg of quinine salt is dissolved in 20 cc of ro n-acetic acid.
The solution is passed through a 3 cc column of basic ion exchange
Kurnstharzbmis sent in its acetate form, the quinine salt with reluctance
the nucleotide component is cleaved; it is washed until it is "quinine-free".
Now the column is rinsed with about 8.5% formic acid until in
DPN is no longer detectable in a sample of the eluate. From the possibly narrowed
The active ingredient is precipitated in the eluate by adding acetone. After the
Dry 240 mg of free diphosphopyrindine nucleotide.