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Verfahren zur Gewinnung des Coenzyms Q
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer neuen Chinonart, die als Coenzym Q" bezeichnet wird. Das Chinon wirkt als Coenzym, indem es bei der Oxydation des Substrates in Mitochon- drien der periodischen Oxydation und Reduktion unterliegt.
Erfindungsgemäss wird das Coenzym Q aus Rinderherzmitochondrien, Rinderlebermitochondrien,
Cyclophorase der Taubenbrustmuskeln, N. crassa, Torula, Azotobacter oder Bäckereihefe in der Weise gewonnen, dass man diese Stoffe mit Alkalihydroxyd in Gegenwart von Pyrogallol verseift, das verseifte
Gemisch mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Coenzym Q aus dem Extrakt abtrennt, oder diese Ausgangsstoffe unmittelbar mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Coenzym Q durch Chromatographie gewinnt.
Nach einer besonderen Ausführungsform verwendet man als organisches Lösungsmittel für das verseifte Gemisch Heptan oder Isooctan.
Nach einer weiteren Ausführungsform geht man in der Weise vor, dass man das Coenzym Q in Isooctanlösung chromatographiert und mit einer Lösung von Äther in Isoctan eluiert.
Pyrogallol wird angewandt, weil das Chinon in alkalischen Lösungen irreversibel zerstört wird, wenn das Verseifungsmedium nicht Pyrogallol oder ein gleichwertiges Oxydationsschutzmittel enthält. Wenn man chromatographisch z. B. mit Aluminiumoxyd, Magnesiumsilicat, Natriumaluminiumsilicat, Fullererde usw. arbeitet, verwendet man vorzugsweise Isooctan- oder Heptanlösungen und eluiert mit einem etwas stärker polaren Lösungsmittelgemisch, z. B. mit 5%igem Äthyläther in Isooctan. Die Präparate des Coenzyms Q können auch durch Umkristallisieren aus Äthanol, Methanol, Amylalkohol, Äthylacetat, Aceton oder Essigsäure gereinigt werden.
Die Extraktion mit Heptan oder Isooctan wird gegenüber derjenigen mit Äther, Petroläther, Pentan u. dgl. bevorzugt, da die letztgenannten niedrigsiedenden Lösungsmittel erheblich mehr unerwünschte Stoffe extrahieren. Die Hauptverunreinigungen bei der Extraktion mit Heptan und Isooctan sind die Carotenoide und Sterine, die sich glücklicherweise aus dem Chinon auf chromatographischem Wege und/oder durch fraktionierte Kristallisation entfernen lassen.
Präparate des Coenzyms Q, die aus verschiedenen Quellen nach ähnlichen oder verschiedenen Methoden gewonnen sind, sind in ihren wesentlichen Eigenschaften grundsätzlich einander ähnlich, wie sich aus den nachstehenden Angaben ergibt. Alle Produkte sind gelb-orangefarbene, neutrale, niedrigschmelzende feste Körper, unlöslich in Wasser und löslich in organischen Lösungsmitteln, wie Pentan, Heptan (nHeptan), Isooctan (2, 2, 4-Trimethylpentan), Petroläther, Cychlohexan, Benzol, Toluol, Äthyläther, Aceton, niederen Alkanolen (z. B. Methylalkohol, Äthylalkohol und Amylalkohol), Äthylacetat, Essigsäure, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Pyridin, und zwar sind sie am stärksten in nicht-polaren Lösungsmitteln (Kohlenwasserstoffen) löslich.
Die gelbe Farbe des Chinons wird durch Reduktionsmittel, z. B. KBH4, Ascorbinsäure, Zink, usw., gebleicht, und die reduzierte Verbindung oxydiert langsam an der Luft und wird in Gegenwart von Ag20 rasch in das Coenzym Q, d. h. die oxydierte Form des Coenzyms Q, zurückverwandelt. Das chromatographische Verhalten gegenüber ausgefälltem Natriumaluminiumsilicatgel (erhältlich unter der Be- zeichnung Decalso") ist ebenfalls ähnlich. Coenzym Q wird z. B. in Lösung mit Isooctan von Natriumaluminiumsilicat adsorbiert und lässt sich mit verdünnten Lösungen von Äther (3-10% Äthyläther) in Isooctan eluieren. Alle Coenzym-Q-Präparate reaktivieren ein an Coenzym Q erschöpftes Succinoxydasesystem.
Die Ultraviolettabsorptionsspektren für Coenzym Q sind ebenfalls im ganzen sichtbaren Bereich qualitativ identisch, da alle Präparate in Äthanol Maxima bei etwa 275 mu und eine breitere Bande bei 405 m (i aufweisen. Diese Maxima verschwinden bei der Reduktion mit Borhydrid (KBH4), und es erscheint ein einziges Maximum von geringerer Intensität bei 290 mfL ; vg1. Fig. l, a und b, wo die ausgezogene Linie des Spektrum der oxydierten Form des Coenzyms Q und die gestrichelte Linie das Spektrum der reduzierten Form des Coenzyms Q wiedergibt. Ausserdem zeigt das Spektrum Zwischenstufen bei der Reduktion an. Schüttelt man z. B.
Coenzym Q in Äthanol mit festem KBH4, so verschwindet das Maximum bei 275 mu und es erscheinen Maxima bei 248 und 312 mil. Die letzteren beiden Banden ver-
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schwinden rasch und es bildet sich eine einzige beständige Bande bei 290 m ; jt.. Im sichtbaren Bereich erscheint beim Schütteln einer Äthanollösung von Coenzym Q mit einer geringen Menge KBH4 eine rosa Farbe, bevor die gelbe Farbe ausgebleicht ist. Die rosa Farbe erscheint wieder beim Schütteln der gebleichten Lösung mit Luft.
Beobachtet man diese Reduktion in Äthanol mit KBH4 in einem registrierenden Spektrophotometer, so zeigt sich sofort ein starker Anstieg in der Extinktion über den ganzen sichtbaren Bereich hinweg unter vorübergehender Bildung von zwei scharfen Banden bei 420 und 442 mu.. Dann geht die Extinktion rasch zurück, bis der gebleichte Zustand erreicht ist. Auch diese charakteristische Eigenschaft ist allen Coenzym-Q-Präparaten unabhängig vom Ausgangsstoff gemeinsam.
Hydriert man das Coenzym Q bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck in einem WarburgManometer in Äthylalkohol mit Palladium auf Holzkohle als Katalysator (2-3 mg Pd/mg Chinon), so erhält man eine sofortige Wasserstoffaufnahme, die nach wenigen Minuten vollständig ist, wobei die Werte im Bereich von etwa 1, 2-1, 3 Mol an absorbiertem H2/100 g Chinon liegen. Unter ähnlichen Bedingungen wurde mit Platinoxyd in Äthanol ein etwas höherer Wert erhalten.
Auch die Ultrarotspektren des aus verschiedenen Ausgangsstoffen nach ähnlichen oder verschiedenen Methoden gewonnenen Coenzyms Q sind qualitativ identisch. Diese Spektren sind in Fig. 2 unter Verwendung von KBr-Kügelchen dargestellt. Das Coenzym Q zeigt charakteristische Absorptionsbanden im Ultrarot bei den folgenden, in [L angegebenen Wellenlängen : 3, 45 ; 3, 52 ; 4, 37 ; 6, 08 ; 6, 20 ; 6, 90 ; 7, 21 ; 7, 77 ; 7, 92 ; 8, 32 ; 8, 67 ; 9, 03 ; 9, 78 ; 10, 42 ; 11, 39 ; 12, 55 ; 13, 27.
In der reduzierten Form bildet das Coencym Q einen Essigsäureester (Diacetat), der folgendermassen hergestellt werden kann : 400 mg aus Rinderherzmitochondrien gewonnenes Coenzym Q, 400 mg Zinkstaub, 10 cm3 Essigsäureanhydrid und 2 cm3 Triäthylamin werden etwa 5-10 min. erwärmt. Nach dem Filtrieren durch Glaswolle wird das Gemisch in einen Scheidetrichter übergeführt, in welchem sich 50 cm3
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50 cm3 Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und das halbfeste Produkt in 20 cm3 heissem absolutem Äthanol gelöst und bei 5 C stehengelassen. Nach 2 Tagen wird der in- zwischen entstandene praktisch weisse Niederschlag abgesaugt und wieder in 10 cm3 absolutem Äthanol gelöst.
Nach dem Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur ist das Diacetat ausgefallen, und man gewinnt eine weitere kleine Menge nach weiterem 2tägigem Stehenlassen bei 5 C. Nach dem Entfernen der Mutterlauge durch Zentrifugieren und dem Trocknen des Niederschlages im Vakuum erhält man das Diacetat des Coenzyms Q-10 (siehe unten) als weisses Produkt, welches bei 39 C erweicht und bei 400 C schmilzt.
Die Absorptionsspektren der oxydierten und der reduzierten Form des Coenzyms Q deuten auf die Anwesenheit einer < x, ss-ungesättigten Carbonylfünktion hin, die einer reversiblen Oxydation und Reduktion unterliegt. Dies bedeutet, dass das Coenzym Q ein Chinon, u. zw. wegen seiner Farbe ein p-Chinon, ist.
Aus der Tatsache, dass das Coenzym Q einen negativen Craven-Test ergibt, kann geschlossen werden, dass es sich um ein tetrasubstituiertes Chinon handelt. Auch andere Anzeichen, wie die Löslichkeit in Lipoidlösungsmitteln, deuten auf die Anwesenheit einer chinonoiden Gruppe oder eines chinonoiden Kernes mit einer ungesättigten aliphatischen Seitenkette hin. Durch Oxydation des Coenzyms Q mit Permanganat (1% KMn04 in 0, 3molarer KOH) erhält man Laevulinsäure, Bernsteinsäure und andere Abbauprodukte, darunter auch teilweise oxydierte Produkte. Die Laevulinsäure (die in Form ihres 2, 4- Dinitrophenylhydrazons identifiziert wurde) zeigt die Gegenwart von isoprenartigen Gruppen
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in der Seitenkette des Coenzyms Q an.
Die Unterschiede in den Schmelzpunkten und den Rf-Werten (vgl. Tabelle I) sowie die Unterschiede in den Löslichkeiten in niederen Alkanolen (z. B. bei verschiedenen Temperaturen) bestätigen, dass die aus den nachstehend beschriebenen Ausgangsstoffen gewonnenen Chinone (Coencym Q) verschieden sind.
Soweit ersichtlich ist, handelt es sich um eine homologe Reihe von Verbindungen mit dem gleichen chinonoiden Chromophor mit zwei Alkoxylsubstituenten und einer langen Seitenkette von isoprenartigem Charakter. Die Verbindungen scheinen, jedenfalls in der Mehrzahl, sich nur durch die Länge dieser Kette, u. zw. insbesondere in der Anzahl an 5 Kohlenstoffatomen enthaltenden Einheiten (Isopreneinheiten), voneinander zu unterscheiden. Dies ist in Tabelle I erläutert, die die Eigenschaften verschiedener, aus verschiedenen Ausgangsstoffen erhaltener Coencympräparate wiedergibt.
Tabelle I
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<tb>
<tb> Moleku- <SEP> Empirische <SEP> SchmelzAusgangsstoff <SEP> Coenzym <SEP> Rf- <SEP> Wert
<tb> largewicht <SEP> Formel <SEP> punkt <SEP> C
<tb> Rinderherz <SEP> ............................... <SEP> Q-10 <SEP> 849,3 <SEP> C58H88O4 <SEP> 49,9 <SEP> 0,27
<tb> T. <SEP> utilis <SEP> (hochschmelzende <SEP> Form) <SEP> ......... <SEP> Q-9 <SEP> 781,2 <SEP> C53H80O4 <SEP> 45,2 <SEP> 0,36
<tb> A. <SEP> vinelandii <SEP> ............................ <SEP> Q-8 <SEP> 713,1 <SEP> C48H72O4 <SEP> 37,0 <SEP> 0,42
<tb> T. <SEP> utilis <SEP> (niedrigschmelzende <SEP> Form). <SEP> ...... <SEP> Q-7 <SEP> 644,9 <SEP> C43H64O4 <SEP> 30,5 <SEP> 0,49
<tb>
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<tb>
<tb> (CgHgVerbindung <SEP> Q-10 <SEP> Q-9 <SEP> Q-8 <SEP> Q-7
<tb> Kohlenstoff, <SEP> theoretisch, <SEP> % <SEP> ....................................
<SEP> 82,02 <SEP> 81,48 <SEP> 80,85 <SEP> 80,07
<tb> gefunden, <SEP> % <SEP> ............................................. <SEP> 82,24 <SEP> 81,44 <SEP> 81,01 <SEP> 79,48
<tb> Wasserstoff, <SEP> theoretisch, <SEP> %............................... <SEP> 10, <SEP> 44 <SEP> 10, <SEP> 32 <SEP> 10, <SEP> 18 <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP>
<tb> gefunden, <SEP> % <SEP> ............................................. <SEP> 10,38 <SEP> 10,11 <SEP> 9,83 <SEP> 9,84
<tb>
Weitere Versuche haben gezeigt, dass das Coenzym Q keine Vitamin K-oder Vitamin E-Aktivität besitzt und den Prothrombinspiegel bei mit Warfarin behandelten Ratten nicht wiederherstellt.
Methoxygruppen wurden durch Bestimmung nach Zeisel in allen Coenzym Q-Präparaten gefunden, und die entsprechenden Werte sind in Tabelle III angegeben. Ein anderes, bei allen Chinonen wiederkehrendes Merkmal ist die Anwesenheit einer beträchtlichen Anzahl abgezweigter Methylgruppen, bestimmt nach Kuhn-Roth. Durch Titration der reduzierten Form des Coenzyms Q mit einer alkoholischen Lösung von FeCl3-α,α'-dipyridyl wurden die in Tabelle III angegebenen Äquivalentgewichte bestimmt.
Die Menge an absorbiertem Wasserstoff bei Verwendung von Palladium auf Holzkohle als Katalysator wurde ebenfalls bestimmt und ist in MolH2/Mol Coenzym Q für die verschiedenen Chinone in Tabelle III angegeben.
Tabelle III
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<tb>
<tb> Coenzym <SEP> Q-10 <SEP> Q-9 <SEP> Q-8 <SEP> Q-7
<tb> Alkoxyl, <SEP> % <SEP> CH3 <SEP> ..... <SEP> 6,78 <SEP> 7,95 <SEP> 8,33 <SEP> 9,79
<tb> Äquivalentgewicht...'1 <SEP> 447 <SEP> 417 <SEP> 387 <SEP> 331 <SEP>
<tb> Mol <SEP> H2/Mol <SEP> ............ <SEP> 11,0 <SEP> 10,2 <SEP> 8,9 <SEP> 7,9
<tb>
Die Molekulargewichte und empirischen Formeln der Tabelle I stimmen am besten mit den verfügbaren Werten überein ; allerdings kann die in den Formeln angegebene Anzahl an Kohlenstoffatomen ohne ernsthaften Widerspruch mit den analytischen Werten etwas geändert werden. Es ist auch möglich, dass die einzelnen Chinonverbindungen in der Verzweigung der Seitenkette, der Anzahl und Stellung der Doppelbindungen in der Seitenkette etwas voneinander abweichen und in Form geometrischer Isomerer vorliegen.
Ebenso ist es möglich, dass der chinonoide Kern zwei Seitenketten mit Isopreneinheiten statt einer Seitenkette von isoprenartigem Charakter enthält.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
Beispiel 1 : Aus Rinderherzmitochondrien (Q-10).
Stufe l : Verseifung.
1057 g Protein von Rinderherzmitochondrien wurde ansatzweise folgendermassen aufgearbeitet : 1 Raumteil einer wässerigen Suspension (60-70 mg Proteinjcm3) wurde zu 2 Raumteilen 10% iger KOH in 95%igem Äthanol zugesetzt, welches eine der Gewichtsmenge des Mitochondrienproteins äquivalente Menge an Pyrogallol enthielt. Das Gemisch wurde dann 30 min am Rückflusskühler erhitzt.
Stufe 2 : Extraktion.
Das so erhaltene verseifte Gemisch wurde dreimal mit je 1/6 seines Volumens an Heptan extrahiert.
Die vereinigten Heptanextrakte wurden mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der wässerigen Extrakte unverändert blieb.
Stufe 3 : Verdampfung.
Der gewaschene Heptanextrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Heptan im Vakuum abdestilliert.
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Das so als Rückstand erhaltene Produkt, welches die gewünschte Chinonverbindung, verunreinigt mit Cholesterin u. dgl., enthielt, wurde in 250 cm3 warmem Isooctan gelöst und die Lösung mehrere Tage auf einer Temperatur von 5 C gehalten. Der hiebei gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und mit 50 cm3 kaltem Isooctan gewaschen. Dieser Niederschlag bestand hauptsächlich aus Cholesterin. Das Filtrat wurde
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mit den Waschflüssigkeiten vereinigt, und die Isooctanlösung wurde über Nacht auf einer Temperatur von-20 C gehalten. Dann wurde der geringe Niederschlag, der sich gebildet hatte, abfiltriert und ver- worfen.
Stufe 5 : Chromatographie. y Diese Reinigungsstufe wurde in einer Kolonne mit Natriumaluminiumsilicat (Decalso) einer Korn- grösse von 0, 297 bis 0, 177 mm durchgeführt. Das Natriumaluminiumsilicat wurde zunächst mit 500 cm3
Isooctan gewaschen, worauf das nach der obigen Verfahrensstufe 4 erhaltene Chinon-Isooctankonzentrat in die Kolonne eingegossen wurde.
Die Eluierung wurde folgendermassen durchgeführt, wobei 500 cm3-
Fraktionen aufgefangen wurden :
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<tb>
<tb> ) <SEP> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Lösungsmittel <SEP> Volumen, <SEP> cm3 <SEP> Eluat
<tb> 1-3 <SEP> Isooctan <SEP> 1250 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> : <SEP> gelbe <SEP> Farbe
<tb> 3 <SEP> : <SEP> keine <SEP> Farbe
<tb> 4-8 <SEP> 5% <SEP> Äthyläther <SEP> 2750 <SEP> hauptsächlich <SEP> gelbe <SEP> Farbe <SEP> in <SEP> 4,
<tb> in <SEP> Isooctan <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP> ; <SEP> verblassend <SEP> in <SEP> 7,8
<tb>
Das Äthereluat enthält das gewünschte Chinon und der grösste Teil desselben erscheint in den Fraktionen Nr. 4-6.
Nochmalige Chromatographie.
Das Äthereluat (z. B. die Fraktionen 4,5 und 6) kann gewünschtenfalls nochmals in einer zweiten Kolonne mit Natriumaluminiumsilicat folgendermassen chromatographiert werden :
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Lösungsmittel <SEP> Volumen, <SEP> cm <SEP> Aussehen
<tb> 1 <SEP> Isooctan <SEP> 500 <SEP> farblos
<tb> 2-4 <SEP> 5% <SEP> Äthyläther <SEP> 1500 <SEP> nur <SEP> ein <SEP> farbiger <SEP> Streifen, <SEP> Hauptin <SEP> Isooctan <SEP> farbe <SEP> in <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 4 <SEP> fast <SEP> farblos
<tb>
Stufe 6 : Letzte Reinigung.
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Beispiel 2 : Aus Rinderherzmitochondrien ohne Chromatographie (Q-10).
Die Rinderherzmitochondrien wurden gemäss Stufe 1 des Beispiels 1 mit 10%iger alkoholischer Kali- lauge in Gegenwart von Pyrogallol verseift. Der erste Heptanextrakt (Beispiel 1, Stufe 2) des verseiften Gemisches wurde eingedampft und der Rückstand in Äthanol aufgenommen, wobei ein roter, in Äthanol unlöslicher Rückstand hinterblieb. Die Äthanollösung, die das gewünschte Chinon enthielt, wurde über Nacht auf einer Temperatur von-15 C gehalten, und die hiebei entstandenen weissen Kristalle (hauptsächlich Cholesterin) wurden abfiltriert und verworfen. Die orangefarbene Mutterlauge wurde weitere 48-72 h auf-15 C gehalten, bis das Chinon in Form orangefarbener Kristalle auskristallisierte.
Die Kristalle wurden durch Dekantieren abgetrennt und wieder in warmem 100% igem Äthanol gelöst. Der bei Raumtemperatur gebildete rote Niederschlag wurde abzentrifugiert und die Äthanollösung über Nacht auf-15 C gehalten. Die hiebei gebildeten orangefarbenen Kristalle wurden abgetrennt, wieder in warmem Äthanol gelöst und die Lösung nochmals über Nacht auf-15 C gehalten, bis die Mutterlauge farblos war. Nach Abtrennung von der Mutterlauge besassen die Kristalle des Q-10-Chinons einen Schmelzpunkt von etwa 45 bis 47 C.
Beispiel 3 : Aus dem Gewebe ganzer Rinderherzen (Q-10).
Rinderherzgewebe wurde von Fett und Bindegewebe befreit und durch einen Fleischwolf geschickt.
Auf je 453, 6 g Herz wurden 600 cm3 10%iges Natriumhydroxyd in 95%igem Äthylalkohol und 30 g Pyro-
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erhitzt. Dann wurde das Gemisch gekühlt, in einen Scheidetrichter überführt und zweimal mit 100 cm3 Heptan extrahiert. Die Heptanextrakte wurden vereinigt und dreimal mit je 4 Raumteilen destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurden die gewaschenen Heptanextrakte über wasserfreiem Natriumsulfat 2 h getrocknet. Das Heptan wurde unter vermindertem Druck durch schwaches Erhitzen mit einem langsamen Wasserdampfstrom abdestilliert. Der Rückstand, der aus einem mit orange-bis gelbfarbigen Kristallen bedeckten weissen Film bestand, wurde in 20 cm3 Äthylalkohol aufgenommen und über Nacht bei 5 C stehengelassen.
Nach dem Entfernen eines etwa beim Stehen gebildeten Niederschlages wurde der Alkohol unter vermindertem Druck abgedampft, wobei zu starkes Spritzen gegen Ende des Eindampfens sorgsam vermieden wurde. Der Rückstand wurde in der geringstmöglichen Menge an Isooctan aufgenommen und auf-15 C gekühlt. Wenn sich während des Abkühlens weisse Plättchen (Cholesterin) bilden, werden sie abfiltriert. Die rötlich-orangefarbene Isooctanlösung wurde dann in eine mit Natriumaluminiumsilicat (Korngrösse 0, 297-0, 177 mm) gefüllte Kolonne gegossen. (Für einen Extrakt von 1, 36 kg
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Rinderherz genügt eine Kolonne von 31, 7 mm lichter Weite und 20, 3 cm Länge. ) Die Kolonne wurde mit
Isooctan gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet, bevor der Extrakt eingefüllt wurde.
Die Kolonne wurde mit trockenem Isooctan eluiert, bis das erste gelbe Band (Carotene) vollständig ausgewaschen war (hiefür genügen etwa 300 cm3 Isooctan). Dann wurde das Chinon aus der Kolonne mit einer 5%igen Lösung von wasserfreiem Äthyläther in Isooctan eluiert (das Chinon kann als gelbes
Band identifiziert werden ; zum Eluieren genügen etwa 300 cm3 Ätherlösung). Cholesterin u. a. Verun- reinigungen können im Eluat in den letzten gelben Fraktionen oder unmittelbar danach auftreten, und deshalb sollen die allerletzten Fraktionen des Chinons nicht mit der Hauptmenge des Materials von dem Hauptteil des gelben Bandes vermischt werden. Die gelben Eluate, die die Hauptmenge des gelben Chinonbandes enthalten, wurden miteinander vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abgedampft.
Das hinterbleibende gelbe Öl wurde mit der geringstmöglichen Menge an heissem Äthanol aufgenommen und über Nacht bei 5 C stehengelassen. Dann wurden die orangefarbenen Kristalle abfiltriert und mit kaltem Äthanol (5 C) gewaschen. Die Kristalle des Q-10-Chinons können gewünschtenfalls durch nochmalige Chromatographie an Natriumaluminiumsilicat, durch Umkristallisieren aus Äthanol oder durch beide Verfahren weiter gereinigt werden. Ausserdem kann man zusätzliches Material durch nochmalige Verarbbeitung der Mutterlauge mit Hilfe einer zweiten chromatographischen Kolonne nach dem oben beschriebenen Verfahren gewinnen.
Beispiel 4 : Aus Azotobacter vinelandii (Q-8).
Dieses Verfahren wurde gemäss Beispiel 1, jedoch ohne die Stufe 4, ausgeführt und bestand daher aus Verseifung, Extraktion, Verdampfung und Chromotographie eines Isooctankonzentrates. Das Q-8Chinon zeigte nach dem Umkristallisieren aus Äthanol, Eisessig und Methanol einen Schmelzpunkt von etwa 36, 5-37, 5 C. Der Schmelzpunkt stieg durch weiteres Umkristallisieren nicht mehr an. Die Ultrarotspektren des aus Azotobacter gewonnenen Q-8-Chinons und des aus Rinderherzen gewonnenen Q-10-Chinons erscheinen identisch, und die Stoffe scheinen mit Ausnahme des Unterschiedes im Schmelzpunkt und der Tatsache, dass das aus Azotobacter gewonnene Chinon stärker löslich in Methanol, Äthanol und Eisessig ist, die gleichen zu sein.
Beispiel 5 : Aus Torula (Q-7 und Q-9).
Stufe l : Verseifung.
Das folgende Gemisch wurde 30 Minuten unter Rücknuss erhitzt : 11 einer Lösung von 15 g KOH/lOOcm 95%igen Äthanol, 37 g Pyrogallol und 330 g getrocknetes Torulapulver, aufgeschlämmt in 800 cm3 Wasser. Auf diese Weise wurden 8 Ansätze unter Rückfluss erhitzt.
Stufe 2 : Extraktion.
Jeder Ansatz wurde dreimal mit je 400 cm3 Isooctan in einem Scheidetrichter extrahiert. Der letzte Extrakt eines Ansatzes wurde zum Extrahieren eines frischen Ansatzes verwendet. Die vereinigten Iso-
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eingeengt.Q-9 und Q-7.
Stufe 3 : Chromatographie an Kieselsäure.
Das Material von Stufe 2 wurde in einer Kolonne an 300 g Kieselsäure und 150 g Diatomeenerde (Super-Cel) adsorbiert, welches mit Isooctan ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Das Adsorbat wurde mit einem Gemisch aus gleichen Raumteilen Chloroform und Isooctan eluiert. Die das Coenzym Q enthaltenden Fraktionen, die als tieforangefarbenes Band erschienen, wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Diese Verfahrensstufe wurde auch erfolgreich durch Chromatographie an mit Natriumaluminiumsilicat gefüllten Kolonnen gemäss Beispiel l durchgeführt.
Stufe 4 : Trennung von Q-9 und Q-7 durch Papierchromatographie mit Phasenumkehr.
Der Rückstand der vorhergehenden Verfahrensstufe wurde in 50 cm3 Äthanol gelöst. Die Äthanollösung (1 mg Coenzym Q/cm3) wurde auf ein Whatman-Filterpapier Nr. 17 in einer Entfernung von 4 cm vom unteren Rand aufgebracht. Das Filterpapier war vorher mit Silicon (Dow Corning Nr. 550) behandelt worden. Dann wurde es in die chromatographische Kammer eingehängt und im Verlaufe von 24 Stunden mit einem Gemisch von 7 Raumteilen n-Propanol und 3 Raumteilen Wasser ins Gleichgewicht gebracht. Nach Einstellung des Gleichgewichtes wurde das Material mit dem obigen Fliessmittelsystem in aufsteigender Richtung chromatographiert. Sobald die Fliessmittelfront 20 cm oder mehr vorgerückt war, konnten zwei deutliche gelbe Streifen beobachtet werden. Die Papiere wurden an der Luft getrocknet und die entsprechenden Streifen ausgeschnitten.
Der obere und der untere Streifen enthielten das niedrigschmelzende Q-7 bzw. das hochschmelzende Q-9. Die Chinone wurden gesondert aus den Papieren mit warmem Äthanol eluiert, bis keine Farbe hinterblieb. Die Alkoholeluate wurden filtriert, um die Papierteilchen zu entfernen, und dann zur Trockne eingedampft. Die nun noch anwesende geringe Menge Silicon wurde durch Chromatographie an Kieselsäure im wesentlichen gemäss Stufe 3 entfernt, wobei allerdings mit kleineren Kolonnen gearbeitet wurde. Aus diesen Kolonnen wurden die folgenden
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:Stufe 5 : Letzte Reinigung. a) Hochschmelzende Verbindung.
Das Q-9-Eluat von der Kieselsäurekolonne wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand in
10 cm3 abs. Äthanol gelöst. Die Lösung wurde einen Tag bei 5 C stehengelassen und die geringe Menge des hiebei gebildeten weisslichen Niederschlages abzentrifugiert und verworfen. Die überstehende Flüssig- keit wurde über Nacht auf einer Temperatur von-20 C gehalten. Der hiebei gebildete gelbe Niederschlag wurde abzentrifugiert, in 8 cm eines Gemisches aus gleichen Raumteilen Methanol und Äthanol gelöst und die Lösung bei 50 C aufbewahrt. Die hiebei entstandenen gelben Kristalle wurden aus 4 cm3 eines
Gemisches von Äthanol und Methanol bei Raumtemperatur umkristallisiert.
Ausbeute : 44 mg Q-9 ;
F = 43-45 C. Aus der Mutterlauge kann man weitere Mengen der Verbindung gewinnen. b) Niedrigschmelzende Form.
Das Q-7-Eluat von der Kieselsäurekolonne wurde zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 36 cm3 eines Gemisches von 4 Raumteilen Äthanol und 1 Raumteil Methanol aufgenommen und die Lösung über Nacht bei 5 C stehengelassen. Hiebei schied sich eine geringe Menge eines farblosen Öles ab, das abzentrifugiert und verworfen wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde über Nacht bei-20 C stehen- gelassen. Der hiebei gebildete gelbe Niederschlag wurde abzentrifugiert, in 12 cm eines Gemisches von
4 Raumteilen Äthanol und 1 Raumteil Methanol gelöst und die Lösung 2 Tage bei 5 C aufbewahrt. Die
Kristalle wurden in der Kälte abfiltriert und aus 7 cm3 eines Gemisches von Äthanol und Methanol um- kristallisiert.
Ausbeute = 233 mg Q-7-Kristalle ; F=30 C. Weiteres Material kann aus den ver- schiedenen Mutterlaugen gewonnen werden.
Beispiel 6 : Aus Rinderherzmitochondrien (Q-10).
Direkte Extraktion : Rinderherzmitochondrien wurden in einer Suspension von etwa dem gleichen
Raumteil Wasser mit 10 Raumteilen Äthanol über Nacht bei Raumtemperatur extrahiert. Der Äthanol- extrakt wurde dann gekühlt, über Nacht bei-15 C stehengelassen und der Niederschlag abfiltriert. Das
Lösungsmittel wurde aus dem Extrakt entfernt und der Rückstand in der geringstmöglichen Menge Petrol- äther (Kp = 30-60 C) aufgenommen. Der Petrolätherextrakt wurde langsam in 10 Raumteile Aceton gegossen und der Niederschlag abfiltriert. Das Aceton wurde abgedampft und der in Aceton lösliche An- teil in der geringstmöglichen Menge Heptan aufgenommen. Die Lösung wurde in einer chromatographi- schen Kolonne durch mit Säure gewaschenes Aluminiumoxyd gegossen.
Die Kolonne wurde mit Heptan eluiert, bis die Carotene (erstes gelbes Band) entfernt waren. Dann wurde die Kolonne mit einer 2% igen
Lösung von Äthyläther in Heptan eluiert, bis das zweite gelbe Band, welches die gewünschten Chinone enthielt, ausgewaschen war. Die Ätherfraktionen wurden dann nochmals an Aluminiumoxyd nach dem gleichen Verfahren chromatographiert. Das Lösungsmittel wurde von den das Chinon enthaltenden Fraktionen (d. h. den Äther-Heptanfraktionen) entfernt und das hinterbleibende rote Öl in der geringstmöglichen Menge an warmer Essigsäure gelöst. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei 5 C hatten sich orangefarbene Kristalle von Q-10 gebildet, die nach dem Umkristallisieren aus Essigsäure einen Schmelzpunkt von etwa 50 C aufwiesen.
Beispiel 7 : Aus Torula utilis (Q-7 und Q-9).
Direkte Extraktion : Die trockene Torula-Hefe wurde im Verlaufe von 1 bis 2 Tagen von Zeit zu Zeit mit Isooctan gerührt und absitzen gelassen. Die gelbe überstehende Flüssigkeit wurde abgehebert. Hiebei wurde eine genügende Menge an Isooctan angewandt, damit das Volumen der überstehenden Flüssigkeit etwa 1/5 des Gesamtvolumens der Suspension betrug. Die überstehende Isooctanlösung wurde durch eine mit Natriumaluminiumsilicat gefüllte Kolonne gegossen, bis das Chinon durchzubrechen begann, worauf eine neue Kolonne in Betrieb genommen wurde. Das Chinon wurde aus jeder Kolonne mit einer 5% igen Lösung von Äthyläther in Isooctan eluiert und das Eluat zu einem orangefarbenen Öl eingeengt.
Man kann die Chromatographie auch mit Fullererde u. dgl. und die weitere Reinigung durch Umkristallisieren aus Äthanol u. dgl. durchführen.
Die Coezym-Q-Produkte, die aus Torula durch fraktionierte aus Methanol oder Äthanol erhalten werden, liefern zwei eng miteinander verwandte Produkte. Obwohl das eine Produkt (Q-9) nach mehrfachem Umkristallisieren einen Schmelzpunkt von 45, 2 C und das andere (Q-7) einen Schmelzpunkt von 30, 5 C aufwies, besassen beide Produkte die gleichen sichtbaren Spektren und die gleichen Ultraviolettspektren, die für alle Coenzym-Q-Produkte charakteristisch sind. Coenzym Q-6 kann aus der nicht-verseifbaren Fraktion von Bäckereihefe gemäss Beispiel 5 gewonnen werden.
In den obigen Beispielen 1-5 wird mit Verseifung und in den Beispielen 6 und 7 mit direkter Extraktion gearbeitet. Es bestehen Anzeichen dafür, dass das durch unmittelbare Lösungsmittelextraktion und anschliessende Reinigung durch Chromatographie und Kristallisation gewonnene Coenzym Q enzymatisch wirksamer ist als das nach dem Verseifungsverfahren isolierte Coenzym Q. Das aus Rinderherz durch unmittelbare Extraktion gewonnene Coenzym Q-10 lässt sich z. B. in Gegenwart katalytischer Mengen von Mitochondrien, Cyanid und Succinat vollständig reduzieren, während sich von dem aus Rinderherz durch Verseifung gewonnenen Coenzym Q-10 nur ein Teil enzymatisch reduzieren lässt, obwohl dieser Stoff chemisch vollständig reduzierbar ist.
Die Coenzym-Q-Produkte sind milde Antikoagulationsmittel, d. h. sie besitzen eine schwache Antivitamin-K-Aktivität. Die Extraktion von Coenzym Q aus Mitochondrien vermindert die Succinoxydaseaktivität und der Zusatz von Coenzym Q stellt die ursprüngliche Aktivität wieder her.
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In Anbetracht dessen lässt sich das Coenzym Q zur Analyse der Bernsteinsäure oder des Succinatrestes verwenden und ist ein wertvolles Reagenz zur Ausführung derartiger Analysen im Laboratorium. Man kann dies leicht ausfüh1en, indem man Mitochondrien mit Isooctan extrahiert, zu den extrahierten Mitochondrien Coenzym Q zusetzt (welches nunmehr spezifisch auf Bernsteinsäure oder den Succinatrest reagiert) und dann die zu untersuchende Probe zusetzt. Durch Messung der Sauerstoffaufnahme lässt sich leicht die Menge sowie auch die Anwesenheit von Bernsteinsäure oder Succinatresten in der Probe feststellen. Wie bereits erwähnt, erleidet das Coenzym Q eine reversible Oxydation und Reduktion ; jedoch ist weder die oxydierte noch die reduzierte Form in der Natur bekannt, obwohl das Coenzym von Naturprodukten abgeleitet ist.
In dieser Beziehung wurde folgendes festgestellt : Während das nach den obigen Beispielen gewonnene kristalline Coenzym Q nicht wasserlöslich ist und ein Absorptionsmaximum im
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nend als Komplexverbindung von Lipoprotein und Coenzym Q), hinsichtlich der Wiederherstellung der Succinoxydaseaktivität in mit Isooctan extrahierten Mitochondrien etwa fünfmal so wirksam ist wie die erfindungsgemäss gewonnenen kristallinen Coenzym-Q-Produkte. Diese fünfmal stärkere Wirksamkeit wurde auch durch Analyse in Gegenwart von Phosphatid gefunden, obwohl bekannt ist, dass ein Phosphatid des Lipoproteins die Ausnutzung des Coenzyms Q durch mit Isooctan extrahierte Mitochondrien erleichtert.
Die bisherigen Forschungen haben erwiesen, dass das Coenzym Q durch die folgende Formel dargestellt werden kann :
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in der n = 6-10 ist und R Wasserstoff, Acyl usw. bedeutet. Das Hydrochinon (R = H) kann, wie oben beschrieben, durch Reduktion mit KBH4 in Äthanol hergestellt werden, und die Acylderivate (R = Acyl) lassen sich aus dem Hydrochinon (Coenzym Q in reduzierter Form) nach dem oben für die Herstellung des Diacetats beschriebenen Verfahren darstellen.
Das hydrierte Coenzym Q (d. h. mit gesättigter Seitenkette) kann in der Hydrochinonform, wie oben beschrieben, durch Hydrieren an einem Hydrierungskatalysator dargestellt werden. Das hydrierte Coenzymzym Q lässt sich auch aus dem Chinon nach dem folgenden Verfahren herstellen :
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<tb> an <SEP> Raney-NickelAnalyse <SEP> : <SEP>
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> C59Hllo04 <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 80, <SEP> 19% <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 12, <SEP> 55% <SEP> ; <SEP>
<tb> Gefunden <SEP> : <SEP> C <SEP> = <SEP> 80, <SEP> 30% <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 12, <SEP> 36%. <SEP>
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