Verfahren zur Gewinnung von Coenzym Q
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines neuartigen Chinons, welches als Coenzym Q bezeichnet wird. Dieses Chinon wirkt als Coenzym, indem es während der Substrat-Oxydation in Mitochondrien cyclisch oxydiert und reduziert wird.
Es wurde nun gefunden, dass Materialien mit hoher Atmungsgeschwindigkeit im allgemeinen gute Quellen für die Gewinnung von Coenzym Q sind.
Beispielsweise konnte das Chinon aus Rinderherz Mitochondrien, Rinderleber-Mitochondrien, Taubenbrustmuskel-Cyclophorase, N.-crassa, Torula, Azotobakter, Bäckerhefe usw. gewonnen werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von Coenzym Q ist nun dadurch gekennzeichnet, dass man Rinderherzgewebe einschliesslich Rinderherz-Mitochondrien, Azobakter vinelandii, Torula oder Bäckerhefe mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und aus dem Auszug das Coenzym Q abtrennt.
Ein bevorzugtes und allgemein anwendbares Verfahren besteht darin, diese Materialien mit wässerigem Alkylihydroxyd in einem Lösungsmittel, wie Äthanol, in Gegenwart von Pyrogallol zu verseifen und das verseifte Gemisch mit Isooctan und Heptan zu extrahieren, gegebenenfalls unter nachfolgendem Chromatographieren des Auszugs auf einer Säule.
Pyrogallol wird verwendet, da das Chinon in alkalischen Lösungen irreversibel zerstört wird, wenn das Verseifungsmedium nicht Pyrogallol oder ein gleichwertiges Antioxydationsmittel enthält. Falls man chromatographiert, z. B. auf Tonerde, Magnesiumsilikat (Forisil), Natriumaluminosilikat (Decalso), Fullererde usw., wendet man vorzugsweise Isooctanoder Heptanlösungen an, wobei man mit einem etwas stairker polaren Lösungsmittelgemisch eluiert, welches z. B. aus 5 % Athyläther und Isooctan besteht. Die Coenzym-Q-Präparate können auch durch Umkristallisieren aus Äthanol, Methanol, Amylalkohol, Äthylacetat, Aceton oder Essigsäure gereinigt werden.
Als Lösungsmittel zum Extrahieren bevorzugt man Heptan oder Isooctan gegenüber Ather, Petrol äther, Pentan und dergleichen, da diese letzteren, niedrig siedenden Lösungsmittel erheblich mehr unerwünschte Stoffe extrahieren. Beim Extrahieren mit Heptan und Isooctan treten als hauptsächliche Verunreinigungen Carotinoide und Steroide auf, welche sich glücklicherweise durch Chromatographieverfahren und/oder Differential-Kristallisation vom Chinon abtrennen lassen.
Nach gleichen oder verschiedenen Verfahren aus verschiedenen Quellen gewonnene Coenzym-Q-Prä- parate sind in ihren wesentlichen Eigenschaften grund sätzlich gleich. Alle Produkte sind gelborange, neutrale, niedrig schmelzende Feststoffe, unlöslich in Wasser und löslich in organischen Lösungsmitteln wie Pentan, Heptan (n-Heptan), Isooctan (2, 2, 4-Tri methylpentan), Petroläther, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Äthyläther, Aceton, niedrigen Alkanolen (z. B. Methanol, Äthanol oder Amylalkohol), Äthylacetat, Essigsäure, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Pyridin, wobei die Löslichkeit in den nichtpolaren (Kohlenwasserstoff-) Lösungsmitteln am grössten ist.
Die gelbe Farbe des Chinons wird durch Reduktionsmittel, wie Kaliumborhydrid (KBH), Ascorbin- säure, Zink usw., gebleicht, und die erhaltene reduzierte Verbindung wird an der Luft langsam oxydiert und in Gegenwart von Silberoxyd (Ag20) rasch zu Coenzym Q, das heisst der oxydierten Form von Coenzym Q, regeneriert. Auch die chromatographischen Eigenschaften auf gelartigem, ausgefälltem Na triumaluminosilikat (käuflich unter der Marke Decalso ) sind gleich. Coenzym Q, beispielsweise in Isooctanlösung, wird auf Decalso adsorbiert und lässt sich mit verdünnten ätherischen (3-10 % Äthyläther) Lösungen von Isooctan eluieren.
Alle Coenzym-Q Präparate vermögen ein Succinoxidasesystem, dessen Coenzym-Q-Gehalt erschöpft ist, zu reaktivieren.
Auch die Ultraviolett-Absorptionsspektren für Coenzym Q sind im sichtbaren Gebiet qualitativ identisch, indem alle Präparate in Athanol Maxima bei etwa 275 mu, mit einer breiteren Bande bei 405 mu, aufweisen. Diese Maxima verschwinden bei der Re duktion mit Borhydrid (KBH4), und es erscheint ein einzelnes Maximum von geringerer Stärke bei 290 mu.
In Fig. Ia und 1b entspricht die ausgezogene Linie dem Spektrum der oxydierten Form von Coenzym Q, die gestrichelte Linie dem Spektrum der reduzierten Form von Coenzym Q.
Aus dem Spektrum ergibt sich auch die Existenz von Zwischenstufen bei der Reduktion. Schüttelt man Coenzym Q in Äthanol, beispielsweise mit festem Kaliumborhydrid, so verschwindet die Spitze bei 275 m, u, und es erscheinen Spitzen bei 248 und 312 m, u. Diese letzteren beiden Banden verschwinden rasch, worauf die einzelne stabile Bande bei 290 m, u entsteht. Auch erscheint im sichtbaren Bereich, wenn man eine äthanolische Lösung von Coenzym Q mit kleinen Mengen Kaliumborhydrid schüttelt, eine rosarötliche Farbe, bevor die gelbe Farbe ausgebleicht wird. Die rosarötliche Farbe erscheint wiederum beim Schütteln der gebleichten Lösung an der Luft.
Beobachtet man diese Reduktion mit Kaliumborhydrid in Äthanol in einem aufzeichnenden Spektrophotometer, so erfolgt sofort eine starke Zunahme der Auslöschung im ganzen sichtbaren Bereich unter vor übergehender Bildung von zwei scharfen Banden bei 420 und 442 m, u. Die Auslöschung nimmt dann rasch ab, bis der gebleichte Zustand erreicht ist. Auch diese Eigenschaft wird bei allen Coenzym-Q-Präparaten, unabhängig von deren Herkunft, beobachtet.
Hydriert man Coenzym Q bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck in einem Warburg-Manometer in Athylalkohol mit Palladium auf Holzkohle als Katalysator (2-3 mg Palladium/mg Chinon), so erfolgt augenblicklich Wasserstoffaufnahme, welche nach einigen Minuten beendet ist, wobei 1, 2 bis 1, 3 Mol H/100 g Chinon absorbiert werden. Unter gleichen Bedingungen wurde unter Verwendung von Platinoxyd in Athanol ein etwas höherer Wert erreicht.
Auch die Infrarotspektra von aus verschiedenen Quellen nach gleichen oder verschiedenen Verfahren erhaltenem Coenzym Q sind qualitativ identisch. Dieses Spektrum wird in Fig. 2 dargestellt unter Verwendung von Kaliumbromidpillen. Wie hier gezeigt wird, zeigt Coenzym Q im Infrarotbereich des Spektrums charakteristische Absorptionsbanden bei folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in, u : 3, 45 ; 3, 52 ; 4, 37 ; 6, 08 ; 6, 20 ; 6, 90 ; 7, 21 ; 7, 77 ; 7, 92 ; 8, 32 ; 8, 67 ; 9, 03 ; 9, 78 ; 10, 42 ; 11, 39 ; 12, 55 ; 13, 27.
Coenzym Q bildet in der reduzierten Form einen Acetatester (Diacetat), welcher wie folgt hergestellt werden kann : 400 mg Coenzym Q, das aus Rinderherz-Mitochondrien erhalten wurde, 400 mg Zinkstaub, 10 cm3 Acetanhydrid und 2 cm3 Triäthylamin werden etwa 5-10 Minuten lang erwärmt. Das Gemisch wird durch Glaswolle filtriert und in einen Scheidetrichter gegeben, welcher 50 cm3 Cyclohexan enthält. Die Cyclohexanphase wird zweimal mit je 25 cm3 0, 3n Salzsäure und dreimal mit je 50 cm3 Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, und das halbfeste Produkt wird in 20 cm3 heissem absolutem Athanol gelöst und bei 5 C stehengelassen. Nach 2 Tagen wird der gebildete praktisch weisse Niederschlag abgenutscht und in 10 cm3 absolutem Athanol wieder gelöst.
Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur trennt man das ausgefällte Diacetat ab. Nach 2 Tagen bei 5 C kann eine weitere kleine Menge gewonnen werden. Nach Entfernung der Mutterlösung durch Zentrifugieren und nach dem Trocknen des Niederschlages im Vakuum erhält man das Diacetatderivat von Coenzym-Q-10 (siehe unten) in Form eines wei ssen Feststoffes, welcher bei 39 C erweicht und bei 40 C schmilzt.
Die Absorptionsspektra der oxydierten und reduzierten Form von Coenzym Q stehen in Überein- stimmung mit der Anwesenheit einer aje-ungesättig- ten Carbonylfunktion, welche reversibel oxydiert und reduziert wird. Daraus geht hervor, dass Coenzym Q ein Chinon und wegen der Farbe ein p-Chinon ist. Es ist auch ein tetrasubstituiertes Chinon indiziert, da Coenzym Q einen negativen Craven-Test gibt. Auch andere Befunde, wie die Löslichkeit in Fettlösungs- mitteln, weisen auf die Anwesenheit einer chinoiden Gruppe oder eines chinoiden Kerns mit einer (ungesättigten) aliphatischen Seitenkette hin.
Durch Oxydation von Coenzym Q mit Permanganat (unter Verwendung von I C KMnO4 in 0, 3m KOH) erhält man Lävulinsäure nebst Bernsteinsäure und andern Zersetzungsprodukten, inbegriffen teilweise oxydierten Produkten. Die Lävulinsäure (identifiziert als 2, 4 Dinitro-phenylhydrazon) weist auf die Anwesenheit von isoprenoiden Gruppen
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in der Seitenkette von Coenzym Q hin.
Die Unterschiede in den Schmelzpunkten und R- Werten (siehe Tabelle 1) sowie auch die erwähnten Unterschiede in den Löslichkeitseigenschaften in niedrigen Alkanolen (z. B. bei verschiedenen Temperaturen) bestätigen, dass die aus den unten beschriebenen Quellen erhaltenen Chinone (Coenzym Q) verschieden sind. Aus den derzeitigen Befunden geht hervor, dass es sich um eine homologe Reihe von Verbindungen mit dem gleichen chinoiden Chromophor, zwei Alkoxylsubstituenten und einer langen Seitenkette von isoprenoidem Charakter handelt. Die Verbindun gen scheinen sich, mindestens zum grössten Teil, nur durch die Länge dieser Kette zu unterscheiden, insbesondere, um eine Anzahl von 5 Kohlenstoffeinheiten (Isopreneinheiten).
Dies geht aus Tabelle 1 hervor, welche die Eigenschaften von verschiedenen, aus verschiedenen Quellen erhaltenen Coenzympräpara- ten angibt.
Tabelle 1 Quelle Coenzym Molekular-Empirische Schmelzpunkt Rf-Wert gewicht Formel t Rinderherz Q-10 849, 3 C58H8804 49, 9 0, 27 T. utilis Q-9 781, 2 C53H8004 45, 2 0, 36
Form mit hohem Schmelzpunkt A. vinelandi Q-8 713, 1 C48H7204 37, 0 0, 42 T. utilis Q-7 644, 9 C43H6404 30, 5 0, 49
Form mit niedrigem Schmelzpunkt (Die Rf-Werte wurden bei der Papierchromatographie mit Phasenumkehr in n-Propanol/H2O 8 : 2 [Volumen/Volumen] erhalten).
Mit den Angaben der obigen Tabelle stände die Annahme in Dbereinstimmung, dass die Alkoxylgruppen Methoxygruppen sind und dass die Coenzyme Q-10, Q-9, Q-8 und Q-7 10 bzw. 9 bzw. 8 bzw. 7 Isopreneinheiten (CH$) aufweisen. Das aus Bäckerhefe isolierte Coenzym Q ist das nächst niedrige Homologe mit 6 Isopreneinheiten, das heisst Coenzym Q-6. Es hat einen Schmelzpunkt von 16 C und ein Molekulargewicht (bestimmt durch FeCl3- Dipyridyl-Titration) von etwa 590. Aus der in Tabelle 2 angeführten chemischen Analyse geht hervor, dass keines der kristallinen Coenzympräparate Stickstoff, Schwefel oder Halogen enthält.
Tabelle 2 Verbindung Q-10 Q-9 Q-8 Q-7 C berechnet 82, 02 81, 48 80, 85 80, 07 gefunden 82, 24 81, 44 81, 01 79, 48 H berechnet 10, 44 10, 32 10, 18 10, 00 gefunden 10, 38 10, 11 9, 83 9, 84
Versuche haben ferner gezeigt, dass Coenzym Q keine Vitamin-K-oder Vitamin-E-Wirkung besitzt und den Prothrombin-Spiegel von Ratten, welche mit Warfarin behandelt wurden, nicht wieder herstellt.
Auf Grund der Zeisel-Bestimmung wurde gefunden, dass in allen Coenzym-Q-Präparaten Methoxygruppen anwesend sind ; die erhaltenen Werte sind in Tabelle 3 angegeben. Ein weiteres beständiges Merkmal aller Chinone ist die Anwesenheit einer beträcht- lichen Zahl verzweigter Methylgruppen gemäss Bestimmung nach Kuhn-Roth. Die Titration der reduzierten Form von Coenzym Q mit einer alkoholischen Lösung von FeCl3-a, a'-dipyridyl diente als Grundlage für die Bestimmung der in Tabelle 3 angegebenen Äquivalentgewichte. Unter Verwendung von Palladium auf Holzkohle als Katalysator, wie oben er wähnt, absorbierten die verschiedenen in Tabelle 3 genannten Chinone die angegebene Anzahl Mol H2/ Mol Coenzym Q.
Tabelle 3 Coenzym Q-10 Q-9 Q-8 Q-7 Alkoxyl % CH3 6, 78 7, 95 8, 33 9, 79 Äquivalentgewicht 447 417 387 331 Anzahl Mol H2/Mol 11, 0 10, 2 8, 9 7, 9
Die in Tabelle 1 angegebenen Molekulargewichte und empirischen Formeln entsprechen den verfüg- baren Daten am besten, wenn auch die Zahl der den Formeln zugeschriebenen C-Atome etwas abgeändert werden könnte, ohne dass ein ernsthafter Widerspruch zu den analytischen Werten aufträte. Es ist auch möglich, dass sich die einzelnen Chinonverbindungen hinsichtlich der Verzweigung in der Seitenkette sowie der Anzahl und Lage der Doppelbindungen in der Seitenkette ein wenig unterscheiden und dass geometrische Isomeren auftreten, die in verschiedenen Kombinationen vorkommen.
Es ist auch möglich, dass der chinoide Kern zwei Seitenketten mit Isopreneinheiten anstatt nur einer einzigen Seitenkette von isoprenoidem Charakter aufweist.
Beispiel 1 Q-10 (aus Rinderherz-Mitochondrien)
Stufe 1-Verseifung
Etwa 1057 g Eiweiss aus Rinderherz-Mitochondrien wurden ansatzweise in folgender Weise aufgearbeitet : Man gab 1 Volumteil einer wässerigen Suspension (60-70 mg Protein/cm3) zu 2 Volumteilen 10% iger Kalilauge in 95% igem Athanol, welches eine Pyrogallol-Menge enthielt, welche dem Gewicht des Mitochondrien-Eiweisses entsprach. Dieses Gemisch wurde dann 30 Minuten lang auf Rückfluss erhitzt.
Stufe 2-Extraktion
Das oben erhaltene verseifte Gemisch wurde dreimal je mit einem Sechstel seines Volumens an Heptan extrahiert. Die vereinigten Heptanauszüge wurden mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der pH der wässerigen Auszüge unverändert blieb.
Stufe 3-Verdampfung
Die oben erhaltenen gewaschenen Heptanauszüge wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf das Heptan im Vakuum abdestilliert wurde.
Stufe 4-Entfernung der Cholesterin-Fraktion
Der oben erhaltene Rückstand, welcher die ge wünschte Chinonverbindung, verunreinigt mit Cholesterin und ähnlichen Stoffen, enthielt, wurde in 250 cm3 warmem Isooctan gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mehrere Tage lang bei etwa 5 C gehalten. Der gebildete Niederschlag wurde abgenutscht und mit 50 cm3 kaltem Isooctan gewaschen. Dieser Niederschlag bestand zur Hauptsache aus Cholesterin.
Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt, und die Isooctanlösung wurde über Nacht auf -20 C gestellt. Die dabei gebildete kleine Menge Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen.
Stufe 5-Chromatographie
Diese Reinigungsstufe wurde vorgenommen unter Verwendung einer Natriumaluminosilikat (Decalso 50/80 Maschen) enthaltenden Säule. Das Decalso wurde zunächst mit etwa 500 cm3 Isooctan gewaschen, worauf das in Stufe 4 erhaltene Chinon Isooctan-Konzentrat auf die Säule gegeben wurde.
Das Eluieren geschah wie folgt, wobei Fraktionen von ungefähr 500 cm3 gesammelt wurden : Fraktion Volumen Fraction Losungsmittel (CM3) Beschreibung des Eluats
Nr. (c3) 1-3 Isooctan 1250 1, 2 : gelbe Farbe ; 3 : farblos
4-8 5 % Athyläther-Isooctan 2750 Hauptteil der gelben Farbe in 4, 5, 6 ; Rostmengen in 7, 8.
Das Äthereluat enthält das gewünschte Chinon, und der grösste Teil davon erscheint in den Fraktionen 4-6.
Rückehromatographie
Das Äthereluat (insbesondere die Fraktionen 4, 5 und 6) kann gewünschtenfalls in einer zweiten gleichartigen Decalso-Kolonne rückchromatographiert werden, wie folgt : Fraktion Volumen
Fraktion Lösungsrmitlel (cms) Aussehen
1 Isooctan 500 farblos
2-4 5% Äthyläther-Isooctan 1500 einzelnes gefärbtes Band Hauptmenge in 2 ;
4 fast farblos.
Stufe 6-Letzte Reinigung
Die Fraktionen 2 und 3 der zweiten Säule wurden im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wurde auf dem Dampfbad mit 100 cm3 absolutem Äthanol erhitzt, und die das Chinon enthaltende heisse äthano- lische Lösung wurde durch Dekantieren von einer kleinen Menge unlöslichen bräunlichen Öls getrennt.
Nach etwa eintägigem Stehen bei 5 C bildete sich in der äthanolischen Lösung ein gelber Niederschlag.
Dieser Niederschlag wurde abfiltriert und nach Entfernung einer sehr kleinen Menge eines alkoholunlös- lichen Öls aus 100 cm3 absolutem Äthanol umkristallisiert. Das umkristallisierte Q-10-Produkt hatte einen Schmelzpunkt von etwa 49 C.
Beispiel 2
Q-10 (aus Rinderherz-Mitochondrien, ohne Chromatographie)
Rinderherz-Mitochondrien wurden mit 10% iger alkoholischer Kalilauge in Gegenwart von Pyrogal lussäure wie in Stufe 1 von Beispiel 1 verseift. Der erste Heptanauszug (siehe Stufe 2 von Beispiel 1) des verseiften Gemisches wurde eingedampft, und der Rückstand wurde in Äthanol aufgenommen, wobei ein roter Rest von äthanolunlöslichem Material zu rückblieb. Die das gewünschte Chinon enthaltende äthanolische Lösung wurde über Nacht bei-15 C gehalten, und die weissen Kristalle, welche sich bildeten (hauptsächlich Cholesterin), wurden durch Filtrieren entfernt und verworfen.
Die orangefarbene Mutterlösung wurde während etwa 48-72 Stunden bei-15 C gehalten, bis das Chinon in Form von orangefarbenen Kristallen kristallisierte. Die Kristalle wurden durch Dekantieren abgetrennt und in warmem, 100% igem Athanol wieder gelöst. Der rote Niederschlag, welcher sich bei Zimmertemperatur bildete, wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die äthanolische Lösung wurde über Nacht bei-15 C gehalten. Die orangefarbenen Kristalle, welche sich bildeten, wurden abgetrennt, in warmem Athanol wieder gelöst und wiederum über Nacht oder bis zur Farblosigkeit der Mutterlösung bei-15 C gehalten.
Nach Abtrennung von der Flüssigkeit zeigten die Kristalle des gewünschten Q-10-Chinons einen Schmelzpunkt von etwa 45-47 C.
Beispiel 3 Q-10 (aus ganzem Rinderherzgewebe)
Rinderherzgewebe wurde von Fett-und Bindegewebe befreit und durch eine Fleischhackmaschine gelassen. Auf je 454 g Herz gab man 600 cm3 10 % igues Natriumhydroxyd in 95 % igem Äthylalkohol sowie 30 g Pyrogallussäure zu und erhitzte das Gemisch in einem Wasserbad von 90 C eine halbe Stunde lang auf Rückfluss. Das erhaltene Gemisch wurde gekühlt, in einen Scheidetrichter gegeben und zweimal mit je etwa 100 cm3 Heptan extrahiert. Die Heptanauszüge wurden vereinigt und dreimal mit 4 Volumteilen destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Heptanauszüge wurden etwa 2 Stunden lang über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Das Heptan wurde unter reduziertem Druck bei mässigem Erhitzen durch einen langsamen Dampfstrom entfernt. Der Rückstand, bestehend aus einem dünnen weissen, mit orangefarbenen und gelben Kristallen überdeckten Film, wurde in 20 cm3 Äthylalkohol aufgenommen und über Nacht bei 5 C stehengelassen. Nach Entfernung eines beim Stehen allfällig gebildeten Niederschlags wurde der Alkohol unter reduziertem Druck sorgfältig abgedampft unter Vermeidung von zu starkem Spritzen in der Schlussphase.
Der Rückstand wurde in einem möglichst kleinen Volumen Isooctan aufgenommen und auf-15 C gekühlt. Bei dieser Kühlbehandlung allfällig gebildete weisse Plättchen (Cholesterin) wurden abfiltriert. Die rötlichorangefarbene Isooctanlösung wurde dann auf eine Säule von Natriumaluminosilikat (Decalso 50/80 Maschen) gegeben. (Für einen Extrakt aus 1, 36 kg Rinderherz genügt eine Säule von 31, 7 mm Innendurchmesser und 203 mm Länge.) Vor der Zugabe des Auszuges wurde die Säule mit über Natriumsulfat getrocknetem Isooctan gewaschen.
Die Säule wurde mit getrocknetem Isooctan eluiert, bis das erste gelbe Band (Carotine) vollständig eluiert war (dazu waren etwa 300 cm3 Isooctan nötig).
Das Chinon wurde dann mit 5 % wasserfreiem Äthyl äther in Isooctan eluiert (das Chinon kann als gelbes Band identifiziert werden, und es werden etwa 300 cm3 Ätherlösung benötigt). Im Eluat können in den letzten gelben Fraktionen oder unmittelbar nachher Cholesterin und andere Verunreinigungen auftreten, so dass die Restfraktionen des Chinons nicht mit der Hauptmenge des Materials aus dem Hauptteil des gelben Bandes vermischt werden sollen. Die gelben Eluate, welche den Hauptteil des gelben Chinonbandes enthielten, wurden zusammengegeben, und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Das verbleibende gelbe Öl wurde in einem möglichst kleinen Volumen heissen Äthanols aufgenommen und über Nacht bei 5 C stehengelassen.
Die sich beim Stehen bildenden orangefarbenen Kristalle wurden durch Filtrieren entfernt und mit kaltem (5 C} Athanol gewaschen. Die Kristalle des gewünschten Q-10-Chinons können ge wünschtenfalls durch weiteres Chromatographieren auf Decalso, durch Umkristallisieren aus Äthanol oder durch beide Massnahmen weiter gereinigt werden.
Durch Aufarbeiten der Mutterlösung mit Hilfe einer zweiten chromatographischen Säule kann auch noch weiteres Material gewonnen werden.
Beispiel 4
Q-8 (aus Azotobakter vinelandii)
Dieses Verfahren wurde entsprechend Beispiel 1 ausgeführt, jedoch unter Fortlassung von Stufe 4, und umfasste das Verseifen, Extrahieren, Eindampfen und Chromatographieren eines Isooctankonzentrats wie in Beispiel 1. Das gewünschte Q-8-Chinon hatte nach Kristallisieren aus Äthanol, Eisessig und Methanol einen Schmelzpunkt von etwa 36, 5-37, 5 C.
Durch weiteres Umkristallisieren konnte der Schmelzpunkt nicht erhöht werden. Die Infrarotspektra des aus Azotobakter erhaltenen Q-8-Chinons und des aus Rinderherzmaterial erhaltenen Q-10-Chinons stimmen überein und scheinen, abgesehen von dem Unterschied des Schmelzpunktes und vom Umstand, dass f3 das Azotobakter-Chinon in Methanol, Äthanol und Eisessig besser löslich ist, identisch zu sein.
Beispiel 5
Q-7 und Q-9 (aus Torula)
Stufe 1-Verseifung
Das folgende Gemisch wurde 30 Minuten lang auf Rückfluss erhitzt : 1 Liter 15 % ige Kalilauge (Gew./Vol.) in 95% igem Sithanol, 37 g Pyrogallol und 330 g in 800 cm3 Wasser aufgeschlämmtes Torula-Pulver (Nährstoffqualität). In dieser Weise wurden 8 Ansätze gemacht.
Stufe 2-Extraktion
Jeder Ansatz wurde dreimal mit je 400 cm3 Isooctan in einem Scheidetrichter extrahiert. Der letzte Auszug jedes Ansatzes wurde verwendet zum Extrahieren eines neuen Ansatzes. Die vereinigten Iso octan-Auszüge wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von 500 cm3 eingedampft. Nach Stehenlassen über Nacht bei-20 C bildete sich ein Niederschlag, welcher nach dem Zentrifugieren verworfen wurde. Die überstehende Lösung enthielt 8, 15 g unreines Coenzym Q, das heisst ein Gemisch aus Q-9 und 0-7.
Stufe 3-Chromatographie auf Kieselsäure
Das Material von Stufe 2 wurde auf einer Säule aus 300 g Kieselsäure und 150 g Diatomeenerde (Super-Cel), die mit Isooctan ins Gleichgewicht gebracht worden war, adsorbiert. Das Material wurde mit Chloroform/Isooctan 1 : 1 (Vol./Vol.) eluiert. Die Coenzym Q enthaltenden Fraktionen, welche als tief orangefarbenes Band erschienen, wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Auch die Chromatographie auf Decalso-Säulen wurde für die Stufe mit Erfolg angewendet, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Stufe 4 - Trennung von Q-9 und Q-7 durch
Papierchromatographie mit umgekehrter Phase
Der Rückstand der vorausgehenden Stufe wurde in 50 cm3 Athanol gelöst. Diese äthanolische Lö sung wurde 4 cm vom Boden auf Whatman-Filterpapier Nr. 17 (1 mg Coenzym Q/cm) aufgetragen).
Das Papier wurde zuvor mit Silicon (Dow Corning Nr. 550) behandelt. Das Papier wurde dann in die Chromatographiekammer gehängt, worauf man innert etwa 24 Stunden mit n-PropanoltH2O 7 : 3 (Vol./ Vol.) das Gleichgewicht einstellen liess. Nach der Ausgleichungsperiode wurde das Material mit dem oben genannten Lösungsmittelsystem aufsteigend chromatographiert. Nachdem die Lösungsmittelfront 20 cm oder mehr vorgedrungen war, konnten zwei deutliche gelbe Bänder beobachtet werden. Die Papiere wurden dann luftgetrocknet, und die entsprechenden Bänder wurden ausgeschnitten. Die oberen und die unteren Bänder enthielten die tiefer schmelzende (Q-7) bzw. die höher schmelzende (Q-9) Verbindung.
Die Chinone wurden separat mit warmem Äthanol von dem Papier eluiert, bis keine Farbe zurückblieb. Die Alkoholeluate wurden zur Entfernung von Papierteilchen filtriert und dann zur Trockne eingedampft.
Die kleine Siliconmenge, welche nun anwesend war, wurde durch Chromatographie im wesentlichen wie in Stufe 3 beschrieben, jedoch unter Verwendung kleinerer Kolonnen, entfernt. Aus diesen Kolonnen erhielt man 80 mg höher schmelzende Q-9-Verbindung und 465 mg niedriger schmelzende Q-7-Verbindung.
Stufe 5-Letzte Reinigung a) Höher schmelzende Verbindung
Das Q-9-Eluat der Kieselsäurekolonne wurde zur Trockne gebracht, und der Rückstand wurde in 10 cm3 absolutem Athanol gelöst. Nach eintägigem Stehenlassen bei 5 C hatte sich eine kleine Menge eines weisslichen Niederschlages gebildet, welcher nach dem Zentrifugieren verworfen wurde. Die über- stehende Flüssigkeit wurde über Nacht auf-20 C gestellt. Der gelbe Niederschlag, welcher sich gebildet hatte, wurde abzentrifugiert, in 8 cm3 warmem Methanol-Athanol 1 : 1 (Vol./Vol.) wieder aufgelöst und auf 5 C gestellt.
Die sich bildenden gelben Kristalle wurden aus 4 cm3 Äthanol-Methanol-Lösung bei Zimmertemperatur umkristallisiert. Man erhielt 44 mg Q-9, Schmelzpunkt 43-45 C. Aus den Mut terlösungen lassen sich noch weitere Mengen der Verbindung erhalten. b) Niedrig schmelzende Form
Das Q-7-Eluat von der Kieselsäurekolonne wurde zur Trockne gebracht. Der Rückstand wurde in 36 cm3 Äthanol/Methanol 4 : 1 (Vol./Vol.) aufgenommen und über Nacht auf 5 C gestellt. Es schied sich eine kleine Menge farbloses Öl ab, welches nach dem Zentrifugieren verworfen wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde über Nacht auf -20 C gestellt.
Der gelbe Niederschlag, welcher sich bildete, wurde abzentrifugiert, in 12 cm3 Äthanol/ Methanol 4 : 1 wieder aufgelöst und 2 Tage lang auf 5 C gestellt. Die gebildeten Kristalle wurden an der Kälte abfiltriert und aus 7 cm3 Äthanol-Methanol umkristallisiert, wobei man 233 mg Q-7-Kristalle, Schmelzpunkt 30 C, erhielt. Aus den verschiedenen Mutterlösungen lassen sich weitere Materialmengen erhalten.
Beispiel 6
Q-10 (aus Rinderherz-Mitochondrien)
Direkte Extraktion Man extrahierte Rinderherz Mitochondrien in einer Suspension von etwa einem gleichen Volumen Wasser mit 10 Volumteilen Äthanol über Nacht bei Zimmertemperatur. Der äthano- lische Auszug wurde gekühlt und über Nacht bei -15 C gehalten, und der Niederschlag, welcher sich bildete, wurde durch Filtrieren abgetrennt. Das Lösungsmittel wurde dann abgedampft, und der Rück- stand wurde in einem möglichst kleinen Volumen Petroläther (Siedepunkt 30-60 C) aufgenommen.
Der Petrolätherauszug wurde langsam in 10 Volumteilen Aceton gegossen, und der Niederschlag wurde durch Filtrieren entfernt. Das Aceton wurde abgedampft, und das Acetonlösliche wurde in einer möglichst kleinen Menge Heptan aufgenommen und auf eine mit Säure gewaschene chromatographische Tonerdesäule gegeben. Die Säule wurde mit Heptan eluiert, bis die Carotine (erstes gelbes Band) entfernt waren. Die Säule wurde dann mit 2%igem Äthyl- äther in Heptan eluiert, bis das zweite gelbe Band, welches das gewünschte Chinon enthielt, entfernt war.
Die Ätherfraktionen wurden dann erneut auf Tonerde chromatographiert unter Anwendung des gleichen Verfahrens wie oben. Das Lösungsmittel der das Chinon enthaltenden Fraktionen (das heisst der Ather-Heptan-Fraktionen) wurde entfernt, und das zurückbleibende rote Öl wurde in einer minimalen Menge warmer Essigsäure gelöst. Beim Stehenlassen über Nacht bildeten sich orangefarbene Kristalle von Q-10, welche nach Umkristallisieren aus Essigsäure einen Schmelzpunkt von etwa 50 C hatten.
Beispiel 7
Q-9 und Q-7 (aus Torula utilis)
Direkte Extraktion Die trockene Torula-Hefe wurde während etwa 1-2 Tagen intermittierend mit Isooctan gerührt, worauf man die Hefe sich setzen liess und die gelbe überstehende Flüssigkeit abheberte.
Es wurde so viel Isooctan verwendet, dass die über- stehende Flüssigkeit etwa einem Fünftel des Gesamtvolumens der Suspension entsprach. Die überstehende Isooctanlösung wurde in eine Säule mit Decalso (Natriumaluminosilikat) gegeben, bis das Chinon durchzulaufen begann, worauf eine neue Säule angefangen wurde. Aus allen Säulen wurde das Chinon mit 5 S Äthyläther in Isooctan eluiert. Das Eluat wurde zu einem orangefarbenen Öl konzentriert. Zum Chromatographieren kann man auch Fullererde und dergleichen verwenden, worauf durch Kristallisieren aus Äthanol und dergleichen weiter gereinigt werden kann, wie oben beschrieben.
Die aus Torula durch fraktionierte Kristallisation in Methanol oder Äthanol erhaltenen Coenzym-Q Produkte enthalten zwei nahe verwandte Substanzen, wie oben angegeben. Obschon das eine Produkt (Q-9) nach mehrmaligem Umkristallisieren einen Schmelzpunkt von 45, 2 C, das andere Produkt (Q-7) einen Schmelzpunkt von etwa 30, 5 C aufwies, hatten beide Produkte das gleiche Spektrum im sichtbaren Bereich und das gleiche Ultraviolettspektrum, wie es für alle Coenzym-Q-Produkte charakteristisch ist.
Coenzym-Q-6 kann aus der nicht verseifbaren Fraktion von Bäckerhefe entsprechend Beispiel 5 gewonnen werden.
In den obigen Beispielen wird in Beispiel 1-5 Verseifung und in den Beispielen 6 und 7 direkte Extraktion angewendet. Offensichtlich ist Coenzym Q, welches durch direktes Extrahieren mit Lösungsmit- teln und anschliessendes Reinigen durch Chromatographieren und Kristallisieren erhalten wurde, enzymatisch wirksamer als Coenzym Q, welches nach einem Verfahren isoliert wurde, bei welchem Verseifung angewendet wird. Coenzym Q-10 beispielsweise, welches durch direkte Extraktion aus Rinderherz erhalten wurde, kann in Gegenwart katalytischer Mengen von Mitochondrien, Cyanid und Succinat vollständig reduziert werden, während Coenzym-Q-10, das durch Verseifen aus Rinderherz erhalten wurde, nur teilweise enzymatisch reduziert werden kann, selbst, wenn es chemisch vollständig reduzierbar ist.
Coenzym-Q-Produkte sind milde Antikoagulationsmittel, das heisst, sie haben eine schwache anti Vitamin-K-Wirkung. Durch Extrahieren von Coenzym Q aus Mitochondrien wird die Succinoxidase Wirkung herabgesetzt, während durch Zugabe von Coenzym Q die ursprüngliche Aktivität wieder hergestellt wird.
Zufolge dieses Umstandes kann Coenzym Q verwendet werden zur Untersuchung auf Bernsteinsäure oder das Succinatradikal. Es stellt somit ein wertvolles Laboratoriumshilfsmittel für Versuche auf diesem Gebiet dar. Die Untersuchung lässt sich leicht durchführen, indem man Mitochondrien mit Isooctan extrahiert, den extrahierten Mitochondrien (welche nun für Bernsteinsäure oder das Succinatradikal spezifisch sind) Coenzym Q zusetzt und dann die zu untersuchende Probe zugibt. Durch Messung der Sauerstoffaufnahme lässt sich leicht sowohl die Menge als auch die Anwesenheit von Bernsteinsäure oder des Succinatradikals in der Probe ermitteln. Coenzym Q lässt sich, wie erwähnt, reversibel oxydieren und reduzieren. Trotzdem es aus natürlichen Produkten stammt, ist jedoch in der Natur weder die oxydierte noch die reduzierte Form bekannt.
In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass, während gemäss den Beispielen isoliertes kristallines Coenzym Q nicht wasserlöslich ist und ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei etwa 405 m, u aufweist, der aktive Coenzym-Q-Faktor, wie er in der Natur in Lipoprotein auftritt, wasserlöslich ist und das entsprechende Maximum bei etwa 425 m, u besitzt. Es wurde auch gezeigt, dass der aktive Coenzym-Q-Faktor, wie er in der Natur in Lipoprotein auftritt (offenbar als Lipoprotein-Coenzym-Q-Komplex) bezüglich der Wiederherstellung der Succinoxydase-Aktivität in mit Isooctan extrahierten Mitochondrien etwa 5mal wirksamer ist als die erfindungsgemäss erhaltenen kristallinen Coenzym-Q-Produkte.
Diese Zahl der 5mal grö- sseren Wirksamkeit wurde auch festgestellt, wenn man den Versuch in Gegenwart von Phospholipid vornahm, trotzdem bekannt ist, dass einige Phospholipidsubstanzen aus dem Lipoprotein die Verwertung von Coenzym Q durch mit Isooctan extrahierte Mitochondrien erleichtern.
Aus den bis heute durchgeführten Untersuchungen geht hervor, dass Coenzym Q durch folgende Grundformel dargestellt werden kann :
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Darin bedeutet n = 6-10. Für Q-10 ist n = 10, für Q-6 ist n = 6 usw. Die Hydrochinonform von Coenzym Q und ihre Derivate entsprechen der Formel
EMI7.2
worin n=6-10 und R=H, Acyl usw. Das Hydrochinon (R = H) lässt sich herstellen durch Reduktion mitKalium- borhydrid in Athanol, wie oben beschrieben, und die Acylderivate (R = Acyl) lassen sich aus dem Hydrochinon (Coenzym Q in reduzierter Form) in der oben im Zusammenhang mit der Herstellung des Diacetatesters beschriebenen Weise gewinnen.
Hydriertes Coenzym Q (das heisst mit gesättigter Seitenkette) lässt sich in der Hydrochinonform herstellen durch Hydrieren über einem Hydrierungskata- lysator, wie oben beschrieben. Hydriertes Coenzym Q kann auch in der Chinonform in folgender Weise erhalten werden :
Die Hydrierung von Coenzym Q-10 über Raney Nickel-Katalysator in ätherischer Lösung oder über Platinkatalysator in Dioxanlösung wurde bei 1 Atmosphäre Druck vorgenommen. Es wurden llmolare Äquivalente Wasserstoff absorbiert, wobei die Hydrochinonform von hydriertem Coenzym Q gemäss nachfolgender Formel III (R = H, n= 10 entstand. Diese Verbindung wurde durch Filtrieren zur Entfernung des Katalysators und anschliessendes Eindampfen zur Entfernung des Lösungsmittels in Form eines farblosen Öls erhalten.
Das Hydrochinon lässt sich durch Behandeln mit Acetanhydrid in geringem Überschuss acetylieren (Formel III, R = Acyl).
Oxydiert man das ölige Hydrierungsprodukt durch Behandeln mit Silberoxyd (in ätherischer Lösung), so erhält man das Eicosahydrocoenzym entsprechend nachstehender Formel IV (n = 10), (Isooctan) 278 m, u, El% 187.
Analyse : berechnet für C"HI"04 : C 80, 19 H 12, 55 gefunden : C 80, 30 H 12, 36
EMI8.1
R = H, Axyl usw., n = 6-10.
EMI8.2
n = 6-10.
In den obigen Formeln stellt Formel I Coenzym Q oder, wie es manchmal bezeichnet wird, Coenzym Q in seiner oxydierten oder Chinonform dar ; Formel II (R = H) stellt Coenzym Q in seiner Hydrochinonform oder, wie sie manchmal bezeichnet wird, in der reduzierten Form dar. In beiden Formeln I und II bleibt die Kohlenwasserstoffseitenkette ungesättigt. In den Formeln III und IV ist die Seitenkette gesättigt ; Formel III (R = H) zeigt das hydrierte Coenzym Q in seiner Hydrochinon-oder reduzierten Form, und Formel IV stellt das hydrierte Coenzym Q in seiner Chinon-oder oxydierten Form dar.
Coenzym Q ist somit, wie oben ausgeführt, gekennzeichnet durch einen chinoiden Kern, welcher als Substituenten zwei Methoxygruppen und eine Methylgruppe sowie eine ungesättigte Kohlenwasserstoffkette am Chinonring aufweist. Die ungesättigte Kohlenwasserstoffseitenkette ist, wie aus den Angaben hervorgeht, von veränderlicher Länge und dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Mehrzahl von Isopren-oder ähnlichen ungesättigten Gruppen besteht.
Soweit bekannt ist, stellt diese Struktur, das heisst die Struktur von Coenzym Q, einen grundsätzlich neuartigen Typus eines substituierten Chinons dar. Es lassen sich Derivate herstellen, wie hervorgeht aus dem Umstand, dass die Hydroxylgruppen der reduzierten oder Hydrochinonform reaktionsfähig sind und leicht acyliert, z. B. in niedrige Acylderivate wie das oben beschriebene Diacetat übergeführt werden können. Auch die Seitenkette ist reaktionsfähig, wie aus der oben beschriebenen Hydrierung hervorgeht, und es lassen sich ausser der entstehenden gesättigten Seitenkette auf Grund bekannter Verfahren durch Umsetzen mit verschiedenen mit ungesättigten Kohlenwasserstoffen reagierenden Substanzen weitere Derivate herstellen.