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Publication number: DEM0014406MA
Authority: DE

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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 13. Juni 1952 Bekanntgemacht am 7. Juni 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von Vitamin-B₁₂-aktiven Konzentraten, um aus ihnen die Verunreinigungen zu entfernen und eine im wesentlichen quantitative Abscheidung der aktiven Substanzen als Vitamin B₁₂ zu erreichen.

Mit dem Ausdruck »Vitamin-B₁₂-aktive Substanzen« werden hier einerseits Vitamin B₁₂ selbst, eine Verbindung, die jetzt als ein Kobaltkomplex erkannt ist, welcher eine charakteristische C N-Gruppe enthält, andererseits eng mit verwandte Kobaltkomplexe bezeichnet, die als dem Vitamin B₁₂ analoge Substanzen angesehen werden können und sich von Vitamin B₁₂ dadurch unterscheiden, daß sie an Stelle der Cyangruppe einige andere charakteristische Gruppen oder Anionen enthalten. Vitamin-B₁₂-aktive Konzentrate, die aus der Leber und aus Gärungsprodukten gewonnen sind, enthalten im allgemeinen außer Vitamin B₁₂ selbst einen oder mehrere derartiger analoger Komplexe. Es ist auch möglich, Vitamin B₁₂ durch chemische Reaktion in verwandte oder analoge Komplexe umzuwandeln.

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Die bisher zur Gewinnung von Vitamin B₁₂ aus Vitamin-B₁₂-aktiven Konzentraten bekannten Verfahren sind verwickelt und umständlich. Sie bestehen im allgemeinen aus wiederholten Extraktionen mit verschiedenen Lösungsmitteln, der Konzentration der Extrakte, der. Gegenstromverteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln, wie Wasser und Benzylalkohol, und der wiederholten Fällung aktiver Substanzen aus ihrer Lösung

ίο mittels Lösungsmitteln wie Aceton, welche auf Vitamin B₁₂ im wesentlichen nichtlösend wirken. Erst durch derartige Verfahren wird ein hinreichend ■ gereinigtes Produkt gewonnen, um die Gewinnung von kristallinem Vitamin B₁₂ zu ermöglichen. Bei diesen Verfahren werden die Schwierigkeiten Um ein Vielfaches erhöht, wenn in den Konzentraten Vitamin-B₁₂-analoge Stoffe anwesend sind, und zwar infolge der Löslichkeitseigenschaften von Vitamin B₁₂ und seinen ver-

ao schiedenen analogen Verbindungen. Man kann die Gewinnung wesentlich vereinfachen, indem man ein Vitamin-B₁₂-aktives Konzentrat mit einem Stoff behandelt, der Cyanionen liefert. Dadurch werden im wesentlichen alle aktiven Substanzen in Vitamin B₁₂ umgewandelt. Selbst wenn das Konzentrat im wesentlichen die gesamte Vitamin-B₁₉-Aktivität in Form von Vitamin B₁, enthält,

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machen die große Menge und die komplexe Natur der in dem Konzentrat enthaltenen Verunreinigungen das Abscheidungsverfahren umständlich und unwirksam.

Es wurde nun gefunden, daß man die Gewinnung von Vitamin B₁₂ aus Vitamin-B₁₂-aktiven Konzentraten dadurch weitgehend abkürzen und vereinfachen kann, daß man eine die Vitaminsubstanz und die Verunreinigungen enthaltende. Lösung in Gegenwart von Cyanionen mit einem Anionenaustauschharz behandelt. Die aktiven Substanzen, d. h. Vitamin! B₁₂ und bzw. oder die Vitamin-B₁₂-analogen Stoffe, die in dem Konzentrat enthalten sein können, werden normalerweise durch Anionenaustauscher nicht merklich adsorbiert, obgleich gefunden wurde, daß ein Teil der Verunreinigungen, im allgemeinen etwa 5 bis 20% der gesamten Feststoffe, adsorbiert werden können. Überraschenderweise zeigte sich indessen, daß das aktive Material in Gegenwart von Cyanionen durch ein Anionenaustauschharz erheblich und oft fast quantitativ adsorbiert wird. Es wurde weiter gefunden, daß die so adsorbierten aktiven Substanzen durch Eluieren des Anionenaustauschers mit einem sauren Eluierungsmittel gewonnen werden können und daß die in dem entstandenen Eluat vorhandenen aktiven Substanzen hauptsächlich in Form von Vitamin B₁₂ selbst vorliegen.

Wenn auch der genaue Mechanismus dieser Adsorption nicht bekannt ist, scheint es doch, daß in Anwesenheit von Cyanid ein Komplex aus Ariionenaustauscher, Cyanid und Vitamin B₁₂ gebildet wird. Anscheinend werden ferner zuweilen auch Komplexe aus Anionenaustauscher, Cyanid und Vitamin-B₁₂-analogen Stoffen gebildet. Gleichzeitig aber bewirkt das Cyanid die Umwandlung der analogen Substanzen in Vitamin B₁₂, wodurch die meisten aktiven Substanzen als Vitamin B₁₂ adsorbiert werden.

Der Adsorptionsgrad hängt von einer Anzahl von Einflüssen ab, z. B. den Eigenschaften des Anionenaustauschers, der Art der in der Lösung anwesenden Verunreinigungen und der Art, wie die Cyanionen in das System eingeführt werden. Diese Bedingungen werden nachfolgend im einzelnen erläutert.

Bei der Adsorption wird der größte Teil der in ' der Ausgangslösung enthaltenen Verunreinigungen mit der !abströmenden Flüssigkeit entfernt, aber bestimmte, durch ein Anionenaustauschharz adsorbierbare Verunreinigungen können auch in Gegenwart von Cyanid adsorbiert werden; dies kann die Adsorptionsfähigkeit des Austauschharzes für Vitamin B₁₂ herabsetzen. Es ist deshalb vorzuziehen, die Lösung der aktiven Substanzen vor dem Zusatz von Cyanid einer Vorbehandlung mit einem Anionenaustauschharz zu unterwerfen, um durch Adsorption die Verunreinigungen zu entfernen, welche die Adsorption von Vitamin B₁₂ stören würden.

Die beschriebene Behandlung einer Vitamin-B₁₂-aktiven Lösung mit einem Anionenaustauscher in Abwesenheit von Cyanionen ist unabhängig als eine Maßnahme zur Entfernung von Verunreinigungen, besonders von gefärbten Verunreinigungen, aus derartigen Vitamih-B₁₂-aktiven Lösungen wertvoll. Insbesondere wurde gefunden, daß die Endstufen der Herstellung von Vitamin-B₁₂-Kristallen vereinfacht werden können, indem man eine Lösung, die aus Rohkristallen hergestellt ist, mit einem Anionenaustauscher behandelt, um störende Zusätze und gefärbte Verunreinigungen zu entfernen. · ■

Zur Durchführung des Verfahrens gemäß Erfindung kann man von Vitamin-B₁₂-aktiven Konzentraten verschiedener Herkunft ausgehen, die z. B. aus der Leber, aus Gärungsprodukten, Mutterlaugen, Waschwässern und anderen bei der Ge- 105. winnung von Vitamin B₁₂ anfallenden Nebenprodukten gewonnen werden. Man kann hierfür vorteilhaft von Konzentraten mit einem verhältnismäßig hohen Vitamin-B₁₂-Gehalt ausgehen, z.B. Konzentraten, die 25 bis 50 oder mehr der gesamten Feststoffe als Vitamin-B₁₂-aktive Stoffe enthalten. Der technische Fortschritt der Verfahren indessen wird noch stärker, wenn man von Konzentraten ausgeht, in denen die Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen zu weniger als etwa 5 °/o der gesamten Feststoffe enthalten sind. Beispielsweise lassen sich sehr zufriedenstellende Ergebnisse erzielen, wenn man von aus Gärungsprodukten gewonnenen Konzentraten ausgeht, in denen die Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen etwa 0,5 bis 1,5 der gesamten Feststoffe ausmachen. Man kann natürlich auch Konzentrate von einer viel geringeren Wirksamkeit verwenden, z.B. solche, die bis zu 0,05 bis 0,1 °/o Vitamin-B₁₂-aktive Substanzen in den gesamten Feststoffen enthalten. Wenn noch weniger wirksame Konzentrate verwendet werden, neigt indessen der

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stärkere relative Gehalt an Verunreinigungen dazu, die Wirksamkeit des Anionenaustauschers sowohl bei der Adsorption von Vitamin B₁₂ als Komplex mit Cyanid und Austauscher als auch die vorangehende Adsorption in Abwesenheit von Cyanionen zu verschlechtern.

Auch die Art der Verunreinigungen ist zu berücksichtigen. Insbesondere gefärbte und bzw. oder teerbildende Verunreinigungen können die

ίο Wirksamkeit des Anionenaustauschers selbst bei stärkeren Konzentraten verschlechtern. Wenn man weiß, daß die Konzentrate erhebliche Mengen an gefärbten und bzw. oder teerbildenden Verunreinigungen enthalten, empfiehlt es sich deshalb, eine Vorbehandlung vorzunehmen, um derartige Verunreinigungen zu entfernen. Ein für diesen Zweck besonders wirksames Verfahren besteht darin, daß man eine Lösung der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen mit Zinkhydroxyd behandelt und letztgenanntes zusammen mit merklichen Mengen der gefärbten und bzw. oder teer bildenden Verunreinigungen aus der verbleibenden Lösung abtrennt.

Die Konzentrate werden bei dem Verfahren nach der Erfindung vorzugsweise in Form wäßriger Lösungen, d. h. Lösungen in Wasser und wäßrigorganischen Lösungsmitteln, angewendet. Man kann auch Lösungen in wasserfreiem Alkohol verwenden; dann ist aber insbesondere die^; Hauptadsorption in Anwesenheit von Cyanid etwas weniger wirksam, auch entzieht sich eine größere Menge von Vitamin B₁₂ der Adsorption und muß aus der abströmenden Flüssigkeit nebst Waschlösungen wiedergewonnen werden. Das Verhältnis der Gesamtfeststoffe zum Gesamtvolumen der Lösung ist nicht von besonderer Bedeutung. Es empfiehlt sich aber, bei der Hauptadsorption in Anwesenheit von Cyanid ein zu großes Volumen der zu behandelnden Lösung zu vermeiden. Beispielsweise zeigte sich, daß gute Ergebnisse dann erhalten werden, wenn die gemäß der Erfindung mit Anionenaustauschharzen behandelten Lösungen anfänglich etwa 1 bis S °/o Gesamtfeststoffe enthalten. Lösungen dieser Konzentration können als solche durch die einleitenden Verfahren zur Vitamin-B₁₂-Gewinnung erhalten werden, man kann auch feste Konzentrate von geeigneter Vitamin-B₁₂-Aktivität entweder in Wasser lösen oder mit Wasser oder anderen wäßrigen Lösungsmitteln extrahieren, um die Ausgangslösungen für das vorliegende Verfahren zu gewinnen.

Bei der Adsorption der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen in Anwesenheit von Cyanionen sowie bei der Adsorption der Verunreinigungen in Abwesenheit von Cyanionen wird die gleiche Art Von Anionenaustauschern. verwendet. Als Anionenaustauscher sind die organischen stickstoffhaltigen Anionenaustauscher besonders wirksam, deren Austauschkapazität im wesentlichen auf Gruppen von quaternärem Ammonium beruht und welche im allgemeinen als stark basische Anionenaustauschharze bezeichnet werden. Djese Harze können natürlich noch andere aktive Austauschgruppen enthalten, wie primäre, sekundäre und tertiäre Aminogruppen, Guanidingruppen u. dgl. Außer der Basizität des Harzes ist eine verhältnismäßig poröse Struktur wichtig. Bei der Auswahl des Harzes für seine Verwendung gemäß der Erfindung soll deshalb sowohl die Basizität als auch die Porosität beachtet werden. Eine maximale Adsorption und Reinigung von Vitamin B₁₂ wird mit stark basischen und hochporösen Austauschharzen erzielt, wenn auch zufriedenstellende, aber doch etwas weniger ausgeprägte Ergebnisse mit stark basischen Harzen geringer Porosität sowie mit Harzen von geringerer Basizität und hoher Porosität erzielt werden. So sind diejenigen Austauschharze für die erfindungsgemäße Verwendung als gut brauchbar anzusehen, welche mäßig bis stark basisch und mäßig bis stark porös sind.

Anionenaustauschharze, die zur Durchführung der Erfindung mit Erfolg verwendet werden können, sind im Handel erhältlich. Zu diesen gehören z. B. die stark basischen und hochporösen Anionenaustauschharze der Handelsbezeichnung »Amberlite XE-75« und »Amberlite XE-98« und das stark basische und mäßig poröse Anionenaustauschharz »Amberlite IRA-400«; diese drei Harze sind Modifikationen stark basischer Anionenaustauschharze, deren Austauschvermögen auf quaternäre Ammoniumgruppen im Polymerisat zurückgeht. Zu nennen ist ferner das mäßig basische und hochporöse Anionenaustauschharz »Ionac A-293«, ein Kondensationsprodukt vom Melanintypus. Die Herstellung dieser Austauschharze ist in den USA.-Patentschriften 2 597 494, 2 597 440, 2570822, 2567836 und 2 543 666 beschrieben. Mit »Amberlite XE-75« und »Amberlite XE-98« wurde eine Vitamin-B₁₂-Adsorption und -Gewinnung von 90% und mehr erzielt, während bei Verwendung von »Amberlite IRA-400« und »Ionac A-293« die Adsorption und Gewinnung von Vitamin B₁₂ annähernd 80% betrug. AndereHarze, die mit Erfolg gemäß der Erfindung verwendbar ,■ sind, obgleich sie eine etwas geringere Wirksamkeit haben, sind z.B. »Amberlite IR-4B«, ein harzartiges Kondensationsprodukt aus Phenolformaldehyd und Alkylenpolyamin mit primären, sekundären und tertiären Aminen und Phenolgruppen als funktioneile Gruppen, und »Amberlite XE-58«, ein harzartiges Kondensationsprodukt mit primären, uo sekundären und tertiären Aminen als funktionelle Gruppen.

Man kann bei der Hauptadsorption und der Voradsorption und -reinigung des Gesamtverfahrens das gleiche Harz oder verschiedene Harze verwenden. Es scheint indessen ein deutlicher Vorteil darin zu liegen, daß man in beiden Adsorptionsstufen das gleiche Harz verwendet. Dieser Vorteil kann darauf beruhen, daß die durch die Voradsorption entfernbaren Verunreinigungen von den verschiedenen Harzen in verschiedenem Ausmaß adsorbiert werden. Da eine Aufgabe dieser Voradsorption darin besteht, die Verunreinigungen zu entfernen, welche die Adsorption des Vitamins B₁₂ bei der Hauptadsorption stören würden,, werden diejenigen Verunreinigungen, die am wahrschein-

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lichsten störend wirken, dann am besten entfernt, wenn man bei der Voradsorption das gleiche Harz verwendet.

Vor de'r Verwendung in einer der Adsorptionsstufen wird das ausgewählte Harz in die Salzform umgewandelt,, indem man es mit einer Lösung wäscht, die das gewünschte Anion liefert. Wenn auch bei der Vorbehandlung des Harzes Anionen einer ganzen Anzahl anorganischer und organischer

ιό Säuren wirksam verwendet werden können, z. B. Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure und Glutaminsäure, lassen sich die besten Ergebnisse durch Verwendung von Essig- oder Salzsäure erzielen, wodurch das Harz in die Azetat- oder Chloridform umgewandelt wird. Es ist in diesem Zusammenhang darauf hinzuweisen, daß ein deutlicher Vorteil in der Verwendung eines Harzes für Vor- und Hauptadsorption zu liegen scheint, das in der Form eines Salzes der gleichen Säure vorliegt, die beim Eluieren verwendet wird. Wenn man z. B. die Eluierung nach der Hauptadsorption mit Essigsäure vornehmen will, empfiehlt es sich, daß das Harz in beiden Adsorptionsstufen anfänglich in Azetatform vorliegt.

Man kann das Harz auch in Hydroxydform verwenden und zur Eluierung von Vitamin B₁₂ nach der Hauptadsorption eine Base, wie Natriumhydroxyd, verwenden. Dieses Verfahren ist indessen sowohl hinsichtlich der Vitamin-B₁₂-Adsorption als auch der Eluierung desselben weniger wirksam als das oben beschriebene Verfahren, bei dem das Harz in Salzform verwendet wird und mit einer Säure eluiert wird.

Das Cyanid kann durch Vorbehandlung des Anionenaustauschers mit einem ionisierbaren Cyanid und bzw. oder durch Zusatz eines ionisierbaren Cyanids zur Lösung der aktiven Substanzen, bevor diese mit dem Anionenaustauscher in Berührung gebracht wird, zugeführt werden.

Wenn der Vitamin-B₁₂-aktiven Lösung Cyanionen zugeführt werden und das Harz ganz oder teilweise in ein anderes Salz als Cyanid umgewandelt wird, dient das zuerst zugesetzte Cyanid sowohl zur Umwandlung des Harzes in die Cyanidform als auch zur Umwandlung der Vitamin-B₁₂-analogen Stoffe in Vitamin B₁₂. Dadurch wird eine merkliche Adsorption der aktiven Substanzen in Form eines Komplexes aus Harz, Cyanid und Vitamin B₁₂ ermöglicht. Daneben kann auch ein Komplex aus Harz, Cyanid und den Vitamin-B₁₂-analogen Stoffen gebildet werden. Wenn das Harz in Form eines anderen Salzes als Cyanid vorliegt und die Cyanionen ausschließlich der Vitamin-B₁₂-aktiven Lösung zugesetzt werden, kann ein gewisser Durchbruch der aktiven Substanzen erfolgen, bevor die Cyanionen ausreichend mit dem Harz in Reaktion getreten sind und dessen Adsorptionskapazität entwickelt haben. Es zeigte sich indessen, daß eine gute Adsorption und ein sehr geringer Durchbruch der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen erfolgen, wenn das Harz mit Cyanid vorbehandelt ist, um es zumindest zu 30% in die Cyanidform umzuwandeln.

Wenn die gewünschte Menge einer Vitamin-B₁₂-aktiven Lösung dem Harz zugeführt worden ist, empfiehlt es sich, die Zufuhr von Lösung zu unterbrechen und Harz und Lösung etwa 2 bis 3 Stunden in Kontakt zu belassen. Während dieser Zeit werden weitere Vitamin-B₁₂-aktive Substanzen auf dem Harz adsorbiert. Das Harz wird dann vor der sauren Eluierung mit Wasser ausgewaschen. Bei der angegebenen Verweilzeit ist die Menge an aktiven Substanzen, die mit der abströmenden Flüssigkeit entfernt wird, sehr gering, d. h. nur etwa 2 bis 10% gegenüber 5 bis 20% ohne Verweilzeit. Die abströmende, Flüssigkeit, welche aktive Substanzen enthält, wird zur Wiederverarbeitung gesammelt.

Bei der Voradsorption wird eine Lösung, welche die Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen und die Verunreinigungen enthält, mit dem säurebehandelten Harz in Kontakt gebracht. Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man die Lösung durch eine Harzsäule leitet. Dabei hängt die Lösungsmenge, die zugesetzt wird, von der experimentell ermitreiten Adsorptionskapazität des Harzes für die in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen ab. Die abströmende Lösung wird verworfen, bis die erste Färbung auftritt, welche die Anwesenheit Vitamin-B₁₂-aktiver Substanzen anzeigt. Darauf wird die weiter abströmende Flüssigkeit aufgefangen, während man weiter Lösung und/oder Wasser zuführt, bis die Farbe der abströmenden Lösung von Rot nach Hellrosa oder Gelb wechselt. Das Gesamtvolumen des angereicherten Schnittes der abströmenden Flüssigkeit kann das Vier- bis Fünffache des Volumens der Ausgangslösung sein, aber es enthält 95 °/o oder mehr der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen. Das Waschen wird fortgesetzt, bis die abströmende Lösung wieder im wesentlichen farblos geworden ist. Das Waschwasser hiervon wird gesondert aufgefangen und zur Aufarbeitung einer früheren Stufe des Verfahrens zugeführt.

Die Regenerierung der Austauschsäule läßt sich leicht vornehmen, indem man zuerst mit Säure auswäscht, wie oben beschrieben, und dann mit Wasser, um die überschüssige Säure zu entfernen. Die ersten Teile der sauren Regenerierungswäsche können auch Spuren von Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen enthalten. In diesem Fall können diese Anteile für die Aufarbeitung gesammelt werden.

Die in der oben beschriebenen Weise erhaltene angereicherte Flüssigkeit kann entweder als solche verwendet werden, indem man sie der Hauptadsorption zuführt, man kann auch aus ihr die aktiven Substanzen als teilweise gereinigtes festes Konzentrat abtrennen und aus diesem Konzentrat wiederum die Ausgangslösung für die Hauptadsorption herstellen.

Das Harz wird für die Hauptadsorption von Vitamin B₁₂ vorbereitet, indem man eine Lösung von vorzugsweise etwa 3 bis 6 g Kalium- oder Natrium-Cyanid je 100 g Harz durch das mit Säure ausgewaschene Harz leitet, um es teilweise in die Cyanidform umzuwandeln. Der aus der Vor

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adsorption abströmenden angereicherten Flüssigkeit oder der Lösung, die aus dem entsprechenden Konzentrat hergestellt ist, werden etwa o,i bis 3 g eines löslichen Cyanids, z. B. Kalium- -oder Natrium-Cyanids, je Gramm Vitamin-B₁₂-aktiver Substanz in der Ausgangslösung zugesetzt. Es werden also 2 bis 6o Mol Cyanid/Mol Vitamin-B₁₂-aktiver Substanz (errechnet unter der Annahme eines durchschnittlichen Molekulargewichtes von

1400) verwendet. Nach dem Zusatz von Cyanid läßt man die Ausgangslösung 10 bis 15 Minuten stehen und leitet sie dann durch das Harz, welches man anschließend mit Wasser auswäscht. Die Menge an Ausgangslösung, die dem Harz zugesetzt werden kann, ohne daß nennenswerte Mengen von aktiven Substanzen durchbrechen, variiert in einem gewissen Ausmaß je nach der relativen Wirksamkeit oder Reinheit der Ausgangslösung und der Adsorptionskapazität des Harzes. Im allgemeinen indessen ist es bei den bevorzugt verwendeten stark basischen und hochporösen Harzen"möglich, so viel Ausgangslösung zuzusetzen, daß etwa 1 g Vitamin-B₁₂-aktiver Substanzen auf 100 g Harz (trocken) kommt, bevor ein merklicher Durchbruch von aktiven Substanzen erfolgt.

Während des Durchganges der Ausgangslösung und des Wassers durch das Harz kann die abströmende Flüssigkeit, die die Masse der Verunreinigungen einschließlich einiger gefärbter Verunreinigungen enthält, verworfen werden, bis eine rötlichorange oder purpurne Färbung auftritt, was ein Zeichen dafür ist, daß etwas Vitamin B₁₂ nicht mehr adsorbiert wurde. In diesem Fall müssen die gefärbten Anteile der abströmenden Flüssigkeit zur Aufarbeitung gesammelt werden. Nachdem die gewünschte Menge der Ausgangslösung dem Harz zugeführt ist, läßt man dieses mit der Lösung zweckmäßig etwa 2 bis 3 Stunden stehen, wie oben angegeben wurde, damit sich ein Gleichgewicht einstellt. Das Harz wird dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um die verbleibende Flüssigkeit und die mit dieser in Kontakt stehenden Verunreinigungen zu entfernen. Diese Wäsche wird so lange fortgesetzt, bis die abströmende Lösung im wesentlichen farblos geworden ist und der Feststoffgehalt weniger als 0,05 mg/ccm beträgt. Während der Wäsche werden natürlich alle Anteile, die rötlichorange oder purpurn gefärbt sind und damit die Anwesenheit Vitamin-B₁₂-aktiver Substanzen anzeigen, für die Aufarbeitung gesammelt. An diesem Punkt des Verfahrens sind die Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen, die von ihren meisten Verunreinigungen befreit sind, an das Harz anscheinend in Form eines Komplexes aus Vitamin, Cyanid und Harz gebunden. .

Zur Gewinnung von Vitamin B₁₂ aus dem Harzadsorbat dient als Eluierungsmittel die Lösung einer Säure, da Säuren die obengenannten Komplexe aus Vitamin, Cyanid und Harz anscheinend brechen. Man kann auch Salzlösungen zum Eluieren verwenden, aber sie sind weniger wirksam als Säuren. Man hat eine große Zahl von Säuren zum Eluieren verwendet, z. B. Schwefel-, Salz-, Phosphor- und Essigsäure. Diese alle eluieren mindestens 90%, häufig fast 100% des Vitamins B₁₂. Andere Säuren wie Glutamin- und Zitronensäure oder Salze wie Mononatrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- und Kaliumchlorid und Natrium- und Kaliumsulfat und Basen wie Natriumhydroxyd sind zwar ziemlich wirksam, entfernen aber im allgemeinen weniger als 90% des adsorbierten Vitamins B₁₂. Das Eluieren mit einer Base scheint das Vitamin B₁₂ in Form eines Cyanidkomplexes zu entfernen, wodurch eine Säurebehandlung erforderlich ist, um das Vitamin B₁₂ in Freiheit zu setzen.

Die Konzentration der zum Eluieren verwendeten Säure hängt natürlich von ihren Eigenschaften ab. Bei starken und weitgehend ionisierten Säuren, wie Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure, können Konzentrationen bis etwa zur Normalität verwendet werden. Höhere Konzentrationen sollten vermieden werden, um mögliche Schädigungen des Vitamins B₁₂ während der Eluierung zu vermeiden. Bei schwach ionisierten Säuren ist es dagegen möglich, viel höhere Konzentrationen zu verwenden. Beispielsweise kann man Essigsäure in jeder beliebigen Konzentration verwenden, sogar Eisessig, ohne daß Vitamin B₁₂ geschädigt wird.

Es empfiehlt sich, als Eluierungssäure die gleiche go Säure zu verwenden, die zur Vorbehandlung des Harzes verwendet wurde, SO' daß die Eluierung gleichzeitig auch der Regenerierung des Harzes für die Wiederverwendung in einem weiteren Adsorptionskreislauf dient. Hierfür sind 5°/oige wäßrige Lösungen von Essigsäure oder Salzsäure als be- vorzugte Eluierungsmittel zu betrachten.

Bei dieser Eluierung wird Cyanwasserstoff frei gemacht, so daß eine hinreichende Entlüftung erfolgen muß. Die abströmende Lösung wird so lange verworfen, bis eine purpurrote Färbung auftritt. Dann wird die abströmende Flüssigkeit als angereicherter Schnitt so lange gesammelt, bis sie ihre Farbe in. helles Orange oder Gelb ändert. Von da an wird die abströmende Flüssigkeit gesondert aufgefangen, bis sie im wesentlichen farblos geworden ist. Die letztgenannte Lösung kann 2 bis 3 % des Vitamins B₁₂ enthalten und, durch Rücklauf zurückgeführt werden zur Gewinnung des Vitamins in einer früheren Stufe des Verfahrens. · no

Die angereicherte Fraktion kann in bekannter Weise behandelt werden, um aus ihr das Vitamin B₁₂ abzuscheiden. Beispielsweise kann man hierfür etwa 10 Raumteile Aceton zusetzen und das Gemisch stehenlassen. Dabei kristallisiert die Masse des Vitamins B₁₂ direkt aus dem Gemisch aus. Die so erhaltenen Kristalle haben oft eine Reinheit von 90¹Vo oder mehr. Man kann auch die angereicherte Fraktion zwei- bis dreimal mit Chloroform-Kresol ■ (1:1) extrahieren, wobei man jedesmal 1 Volumen des Lösungsmittelgemisches verwendet, das etwa 0,1 Volumen der angereicherten Flüssigkeit entspricht. Nach Zusatz von etwa 2 Raumteilen Aceton und 2 Raumteilen Äther zu dem gewonnenen Extrakt wird Vitamin B₁₂ von einer Reinheit von etwa 80 bis 90% ausgefällt. Produkte höherer

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Reinheit lassen sich durch Umkristallisieren des 80- bis 90%'igen Produktes aus Wasser gewinnen. Die Möglichkeit der direkten Gewinnung eines Produktes von einer Reinheit von 80 bis 90% aus der angereicherten Fraktion hängt zu einem gewissen Grad von der Art und Weise der Eluierung sowie davon ab, wie der angereicherte Schnitt der abströmenden Lösung genommen wird. Die abströmende Flüssigkeit mit der höchsten Vita.min-B₁₂-Wirksamkeit kann häufig auf direkte Gewinnung eines Produktes von einer Reinheit von 80 bis 90°/o aufgearbeitet werden. Andererseits ist die Reinheit des direkt abgeschiedenen Produktes etwas geringer, wenn angereicherte Schnitte in größerem Umfang ausgewählt werden, die eine noch stärker quantitative Gewinnung von Vitamin B₁₂ ermöglichen.

Ein weiterer Einfluß, der mit der Möglichkeit der direkten Abscheidung eines hochgereinigten Produktes aus der abströmenden Lösung in. Beziehung steht, ist der Grad und die Art der Reinigung, die vor der Hauptadsorption erreicht wurde. In diesem Zusammenhang ist indessen darauf hinzuweisen, daß das oben beschriebene Verfahren der Adsorption von Vitamin B₁₂ in Form eines Komplexes aus Cyanid, Harz und Vitamin B₁₂ selbst dann noch einen erheblichen Vorteil für die technische Durchführung bietet, wenn das direkt aus der abströmenden Flüssigkeit abgeschiedene Produkt eine Reinheit von nur 20 bis 30% hat.

Wenn auch Vitamin B₁₂ in einer Reinheit von etwa 80 bis 90% im allgemeinen selbst aus solchen von der Hauptadsorption abströmenden Flüssigkeiten hergestellt werden kann, welche eine Wirksamkeit von nur 20 bis 30% haben, indem man aus dieser Flüssigkeit Cyanwasserstoff entfernt und Vitamin B₁₂ in bekannter Weise wiederholt ausfällt und/oder kristallisiert, um Produkte von steigender Wirksamkeit zu erhalten, ist die weitere Reinigung des 80- bis 90°/»igen Vitamins B₁₂ zu einem Produkt von einem Reinheitsgrad bis zu 99% lediglich durch Kristallisation oft viel schwieriger zu erzielen. Wenn man eine Lösung, die aus einem Produkt hergestellt ist, in welchem 40 bis 50% oder mehr des gesamten Feststoffgehaltes aus Vitamin B₁₂ bestehen, der ergänzenden Behandlung mit einem Anionenaustauschharz in Abwesenheit von Cyanionen unterwirft, erhält man mittels der üblichen Verfahren zur Kristallisation von Vitamin B₁₂ leicht Produkte, deren Reinheit 99⁰An erreicht oder sogar überschreitet. Dies beruht anscheinend auf der Entfernung von Verunreinigungen durch das Harz, welche das Erreichen eines solchen Reinheitsgrades bei der Kristallisation stören.

Es ist in diesem Zusammenhang zu beachten, daß das oben beschriebene Verfahren der ergänzenden Behandlung von Vitamin-B ₁₂-Lösungen mit ' Anionenaustauschharz in Abwesenheit von Cyanionen sich außer auf die hier beschriebene Vitamin-B₁₂-Adsorption allgemein anwenden läßt. So können auch andere Vitamin-B₁₂-Lösungen, deren Feststoffe 40 bis 50% oder mehr Vitamin-B₁₂-aktive Substanzen enthalten, gleichgültig, ob sie mittels des hier beschriebenen Verfahrens oder auf anderem Wege erhalten wurden, mit einem Anionenaustauschharz in Abwesenheit von Cyanionen in Kontakt gebracht werden, um durch Adsorption der Verunreinigungen der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen eine Reinigung zu bewirken.

Nachfolgend wird die Durchführung der Erfindung an Hand einiger Beispiele gezeigt.

Beispiel 1

A. Entfernung der Verunreinigungen durch
Harzaustauscher

Eine Harzsäule wird wie folgt hergestellt: Man bringt 10 1 eines stark basischen Anionenaustausch-· harzes mit quaternären Ammoniumgruppen in einen Glaszylinder von einem Innendurchmesser von 10,2 cm und einer Höhe von 2,4 m. Man läßt etwa 36 1 einer wäßrigen 3%igen Natriumhydroxydlösung durch das Harz mit einer Geschwindigkeit von etwa 500 ccm/min von oben nach unten strömen. Dann wird Wasser von oben nach unten durch das Harz geleitet, um überschüssiges Natriumhydroxyd zu entfernen. Etwa 25 1 einer 25°/oigen wäßrigen Essigsäure werden dann durch das Harz mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 ccm/min von oben nach unten geleitet, worauf man anschließend mit destilliertem Wasser nachwäscht, um die Essigsäure zu entfernen. Dabei beläßt man genügend Wasser in der Säule, daß das Harz bedeckt bleibt. Nun liegt, die Säule in Form des Azetates vor.

500 g festes Konzentrat, das durch Konzentrierung und Reinigung einer. Gärungsbrühe gewonnen wird, die durch Gärung mit S. griseus auf einem geeigneten Nährboden erhalten wurde und etwa 150 g Diatomeenerde als Filterungshilfsmittel sowie Vitamin-B₁₂-aktive Substanzen von maximal etwa 20 g enthält (gemessen durch die Lichtabsorption in wäßriger Lösung bei 5500 Ä), werden mit Wasser extrahiert, bis man einen farblosen Extrakt erhält. Die Extrakte werden filtriert. Es sind etwa 4 1 Wasser erforderlich. Die vereinigten Extrakte werden durch die Säule von 10 1 Harz mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 ccm/min. abwärts strömend geleitet, worauf man anschließend mit der gleichen Geschwindigkeit mit Wasser nachwäscht. Die abströmende Flüssigkeit wird verworfen, bis sich eine erste Färbung zeigt. Dann sammelt man die abströmende Flüssigkeit als angereicherten Schnitt, bis die Farbe von Rot nach Hellrosa oder Gelb wechselt. Von diesem Zeitpunkt an wird die abströmende Flüssigkeit gesondert aufgefangen, bis sie im wesentlichen farblos geworden ist. Die letztgenannte, gesondert aufgefangene Flüssigkeit, deren Volumen etwa 20 1 beträgt, enthält einen kleinen Teil der Vitamin-B₁₂-a.ktiven Substanzen und wird zur Aufarbeitung einer früheren Verfahrensstufe zurückgeführt.

Aus dem zuerst aufgefangenen angereicherten Schnitt, dessen Volumen etwa 20 1 beträgt und. der etwa 90 bis 95 % der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen'enthält, wird das aktive Material entfernt,

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indem man die Lösung zwei- oder dreimal mit Kresol-Kohlenstoff tetrachlorid, (i : i) behandelt, wobei man jedesmal etwa 0,1 Raumteil Lösungsmittel nimmt. Die verbrauchte wäßrige Schicht ist im wesentlichen farblos. Den vereinigten Extrakten setzt man unter Rühren etwa ioo g Diatomeenerde als Filterungshilfsmittel, etwa 2 Raumteile Aceton und etwa 2 Raumteile Äthyläther zu. Das entstandene Gemisch von Präzipitat und Filterungshilfsmittel wird durch einen Filter filtriert, welcher zuvor mit etwa 50 g Filterungshilfsmittel überzogen wird. Der Feststoff wird mit etwa 4 1 Aceton und anschließend etwa 1 1 Äthyläther ausgewaschen und dann bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.

Der getrocknete Feststoff, etwa 400 g, wird mit Wasser extrahiert, bis man einen farblosen Extrakt erhält, und die Extrakte werden filtriert Es sind etwa 2 1 Wasser erforderlich.

B. Entfernung von Vitamin B₁₂ durch

Harzaustauscher

Es wird eine zweite Harzsäule, wie unter A beschrieben, hergestellt. Es werden etwa 120 g Kaliumcyanid in etwa 1 1 Wasser gelöst. Man läßt diese Lösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 bis 10 ccm/min durch die 10 1 Harz nach unten fließen. Nun liegt die Säule zum Teil in Acetat- und zum Teil in Cyanidform vor (etwa 63 °/o Acetat und 37% Cytanid). .

Den kombinierten wäßrigen Extrakten des Präzipitats, welches man aus der Flüssigkeit erhält, die von der ersten Harzsäule abströmt, setzt man etwa 60 g Kaliumcyanid zu und rührt die Lösung etwa 15 Minuten. Diese Lösung wird dann auf die Säule des Acetat-Cyanid-Harzes geleitet, und zwar mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 bis 10 ccm/min, worauf man mit etwa der gleichen Geschwindigkeit mit etwa 2 1 destilliertem Wasser nachwäscht. Dann wird die Säule mit destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 ccm/min gewaschen!, bis die abströmende Flüssigkeit im wesentlichen farblos ist und ihr Gesamtgehalt an Feststoffen weniger als etwa 0,05 mg/ccm beträgt. Bald nachdem der erste Teil der vorerwähnten cyanidbehändelten Extrakte in der abströmenden Flüssigkeit erscheint, folgt eine rötli'chorange oider oriangepurpurn gefärbte Fraktion, welche eine kleine Menge von Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen enthält. Diese Fraktion wird gesondert aufgefangen und zur Aufarbeitung einer früheren Stufe des Verfahrens zugeführt. (Wenn das gleiche Verfahren ausgeführt wird, man jedoch zwischen dem Zusatz der cyanidbehandelten Extrakte zur Säule und dem Auswaschen derselben mit Wasser 2 bis 3 Stunden stehenläßt, ist der obenerwähnte anfängliche Durchbruch kleiner Mengen von Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen im wesentlichen beseitigt. Die Verweilzeit von 2 bis 3 Stunden scheint eine noch stärker quantitative Adsorption, der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen durch das Harz zu ermöglichen).

Dann wird wäßrige Essigsäure, deren Konzentration etwa 5'°/o beträgt und die vorzugsweise auf etwa 5° abgekühlt ist (während des Eluierens wird Wärme entwickelt), durch das mit Wasser ausgewaschene Harz mit einer Geschwindigkeit von etwa 75 cm/min von. oben nach unten geleitet, um das Vitamin B₁₂ zu eluieren. Die abströmende Flüssigkeit wird verworfen, bis die erste rötlichpurpurne Färbung auftritt. Die abströmende Flüssigkeit wird nun als angereicherter Schnitt aufgefangen, bis sich ihre Farbe in ein helles Orange oder Gelb ändert. Von da an wird die Flüssigkeit wiederum gesondert aufgefangen, bis sie im wesentlichen farblos geworden ist. Die letztgenannte, gesondert aufgefangene Fraktion, deren Volumen etwa 8 1 beträgt, enthält nur einen kleinen Bruchteil des vorhandenen Vitamins B₁₂. Sie wird zur Aufarbeitung einer früheren Verfahrensstufe zugeführt.

Aus der angereichterten Fraktion, die etwa 8 1 ausmacht, wird Vitamin B₁₂ dadurch entfernt, daß man sie etwa dreimal mit Kresol-Kohlenstofftetrachlorid (1 : 1) extrahiert, wobei man. zuerst mit etwa 0,1 Raumteil Lösungsmittel und darauf jedesmal, mit 0,05 Raumteilen. Lösungsmittel auswäscht, bis die verbrauchte wäßrige Schicht im wesentlichen farblos ist, Den. vereinigten Extrakten werden unter Rühren etwa 2 Raumteile Aceton, und 2 Raumteile Äthyläther zugesetzt, Es bildet sich ein Präzipitat, welches durch Filtration auf einem Filter entfernt wird, das zuvor mit einem Filterungshilfsmittel überzogen ist. Dann wäscht man mit Aceton und trocknet im Vakuum bei Raumtemperatur.

C. Gewinnung von reinem Vitamin B₁₂

Der getrocknete Feststoff wird mit Wasser extrahiert, bis man einen farblosen Extrakt erhält. Die Extrakte werden filtriert und auf eine Konzentration von etwa 5 bis 10 mg Vitamin B₁₂ je ecm, die durch Messung der Lichtabsorption bei 5500 Ä bestimmt wird, verdünnt. Die Kristallisation des Vitamins B₁₂ wird durch Zusatz von etwa 7 bis 10 Raumteilen Aceton bewirkt, die man langsam unter leichtem Rühren" zusetzt. Man erhält eine optimale Ausbeute an kristallinem Vitamin. B₁₂, indem man das Gemisch etwa 16 bis 24 Stünden stehenläßt. Darauf werden die ■ Kristalle durch Filtration abgetrennt, mit Aceton gewaschen, und getrocknet, Die so erhaltenen Kristalle stellen Vitamin B₁₂ von. einer Reinheit von etwa 85 bis 90% dar. Das Produkt wird durch einfache Urnkristallisation aus Wasser weiter gereinigt, wodurch man eine Reinheit von über 95% erhält.

Die Wiederholung des vorgeschriebenen Ve-rf ahriens unter Verwendung verschiedener Ausgangskonzentrate hat zuweilen als anfängliches Produkt ein Vitamin B₁₂ von einer Reinheit von etwas unter 85% ergeben. Derartige Produkte geringerer Reinheit werden zweckmäßig dadurch gereinigt, das man eine wäßrige Lösung des Produktes durch ein Harzbett leitet, wie es unter A beschrieben ist. Nach einer derartigen ergänzenden Harzbehandlung bewirkt der Zusatz von Aceton zu der abströmenden angereicherten Fraktion, häufig die

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direkte Ausfällung von Vitamin B₁₂ von einer Reinheit von 99¹Vo und mehr.

Beispiel 2

A. Entfernung der Verunreinigungen durch
Harzaustauscher

Man stellt eine Harzsäule nach folgender Vor-' schrift her: Es werden 230 ecm des gleichen Harzes wie nach Beispiel 1 in eine Glassäule eingebracht, deren innerer Durchmesser 2,54 cm und deren Höhe 61 cm beträgt. Man leitet etwa 700 ecm einer wäßrigen 3^<Voigen Natriumhydroxydlösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 ccm/min abwärts strömend durch das Harz, daran anschließend eine wäßrige Natriumchloridlösung mit der gleichen Geschwindigkeit, bis die abströmende Flüssigkeit wird nun als angereicherter Schnitt der gleichen Geschwindigkeit mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser keine Chlörionen mehr enthält. Man beläßt in der Säule ausreichend Wasser, damit das Harz bedeckt bleibt.

Nun liegt das Harz in Form des Chlorides vor.

41 g eines Vitamin-B^-Konzentrates, welches maximal etwa 3¹ZWo Vitamin-B₁₂-aktiver Substanzen enthält, wird in etwa 115 ecm Wasser gelöst. Die nicht gelösten Feststoffe werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von etwa 4 ccm/min abwärts strömend durch das Harz geleitet, worauf man Wasser mit der gleichen Geschwindigkeit folgen . läßt. Das Waschwasser wird so lange verworfen, bis eine Färbung auftritt. Dann wird es als angereicherter Schnitt so lange gesondert aufgefangen, . 35 ■ als es noch gefärbt ist. Auf diese Weise erhält man etwa 475 ecm einer angereicherten Flüssigkeit.

. B. Entfernung von Vitamin B₁₂ durch

Harzaustauscher
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Das Harz, das zur Entfernung der Verunreinigung dient, wird in der gleichen Weise regeneriert, wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist. Es werden etwa 3 g Natriumcyanid in 30 ecm

45- Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von etwa 4 ccm/min abwärts strömend durch das. Harz geleitet. Dann liegt das Harz teilweise als Chlorid, teilweise als Cyanid vor.

Der von der ersten Harzbehandlung abströmenden angereicherten Flüssigkeit werden etwa 3 g Natriumcyanid zugesetzt. Die Lösung wird etwa 10 Minuten gerührt. Diese Lösung wird nun mit einer Geschwindigkeit von etwa 4 ccm/min oben auf die Harzsäule geleitet. Dieser Lösung folgen etwa 450 ecm destilliertes Wasser mit gleicher Geschwindigkeit. Dann wird die Säule mit einer Geschwindigkeit von etwa 12 bis 15 ccm/min mit destilliertem Wasser ausgewaschen, bis das Waschwasser im wesentlichen farblos und der gesamte Feststoffgehalt des Waschwassers unter etwa 0,05 mg/ccm liegt.

Nun läßt man eine 5°/oige wäßrige Lösung von Essigsäure mit einer Geschwindigkeit von etwa ι ccm/min abwärts durch das Harz fließen. Das Waschwasser wird so lange verworfen, bis in ihm eine rotpurpurne Färbung auftritt.. Dann wird es in Anteilen von je 50 ecm als angereicherter Schnitt gesammelt, bis es im wesentlichen farblos geworden ist. Es werden etwa fünf solche Anteile aufgefangen. Die ersten beiden Fraktionen enthalten die Masse des Vitamins B₁₂. Sie werden mit 10 Raumteilen Aceton verdünnt und stehengelassen, worauf die Kristallisation einsetzt. Die erhaltenen Kristalle (etwa 1,383 g vor der Trocknung) stellen Vitamin B₁₂ von einer Reinheit von etwa 90% (auf wasserfreier Basis) dar. Die verbleibende Fraktion geringerer Reinheit wird erneut aufgearbeitet.

Die Aufteilung der Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen auf die verschiedenen Verfahrensstufen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgezeigt. Die in der Spalte »Gramm aus Gesamtfärbung« angegebenen Zahlenwerte sind ein Maß für die Konzentration von Vitamin-B₁₂-aktiven Substanzen. Die Werte sind aus Messung der optischen. Dichte der Lösung bei 5500 Ä berechnet, wobei der Bezugswert für reines Vitamin B₁₂ EJ⁹⁴ = 64, ist.

Bestandteil Gramm aus Gesamtfärbung

Säule I g₀

Beschickungsgut i,35o

Vitaminreicher Durchbruch *)

(Beschickungsgut für

Säule II) 1,310

Restschnitt 0,023

Wäsche mit 55%iger

Essigsäure 0,062

Säule II

Beschickungsgut 1,310

Durchbruch 0,126

Eluat ι 0,630 (0,750 g Kristalle)

Eluat 2 0,425 (0,633 g Kristalle)

Eluat 3 0,136

Eluat 4 0,029 .

Eluat 5 0,008

* Vitaminreicher Durchbruch bezeichnet den Sättigungspunkt des Harzes. Bei der adsorptiven Bindung aktiver Stoffe an Harze ist die Grenze der Adsorptionsfähigkeit des Harzes gewöhnlich dann erreicht, wenn keine weiteren aktiven Substanzen von dem Harz adsorbiert' werden, die aktiven Substanzen mithin die Harzsäule ungebunden passieren. Dieser Punkt wird als »Durchbruch« bezeichnet.

In der vorstehenden Tabelle ist zu beachten, daß die Werte für »Gramm aus Gesamtfärbung« auf Messung der optischen Dichte beruhen, die infolge ihrer Natur stets Näherungswerte sind. Die Tatsache, daß die Gesamtfärbung in den Eluatfraktionen (Säule II) die Gesamtfärbung des Beschickungsgutes übersteigt, beruht auf der An-Wesenheit von Vitamin-B₁₂-analogen Stoffen, wie Vitamin B_12a, im Beschickungsgut. Die Messungen der optischen Dichte erfolgen bei 5500 A, wo· Vitamin B₁₂ maximal absorbiert. Bei dieser Wellenlänge ist indessen die Absorption durch die Vitamin-B₁₂-analogen Stoffe nicht so groß, und

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infolgedessen ergeben Berechnungen, die den für Vitamin B₁₂ charakteristischen Wert von E₁* = 64 zugrunde legen, einen etwas niedrigeren Näherungswert, als Vitamin-B₁₂-&ktive. Substanzen, die tatsächlich im Beschickungsgut enthalten sind. Nach dieser Erläuterung sieht man, daß die Werte für Säule II eine erhebliche Umwandlung von Vitamin-B₁₂-analogen Stoffen, wie Vitamin B_{12 a}, in Vitamin B₁₂ in der Hauptadsorptionsstufe(Säule II) anzeigen.

Beispiel 3

Eine wäßrige Lösung von. Vitamin B₁₂, die etwa io mg Vitamin B₁₂ und Vitamin-B₁₂-ähnliche Verbindungen sowie 90 mg nicht identifizierte Verunreinigungen je ecm enthält, wird mit 60 mg Kaliumcyanid je ecm behandelt. Dann werden Anteile von je 5 ecm der erhaltenen Lösung, deren jeder 51,5 mg Vitamin B₁₂ (gemessen bei 5500 Ä) enthält, durch Säulen eines stark basischen Anionenaustauschharzes mit quaternären Ammoniumgruppen iim Molekül geleitet, welche 25 ecm Harz enthalten und in Form des 'Hydroxydes, des Acetates bzw. des Cyanid-Acetates vorliegen. Die Säulen werden mit Wasser gewaschen und mit 5°/»iger wäßriger Essigsäure eluiert. Das Verfahren entspricht dem im Beispiel 2, B beschriebenen Verfahren. Es wurde gefunden, daß in jedem Beispiel Vitamin B₁₂ adsorbiert, die Eluierung. leicht be-

wirkt und eine erhebliche Reinigung erzielt wird. Vergleichswerte zeigen, daß sowohl die Adsorption je Einheit Harz als auch die Reinigung entsprechend der Form Variiert, in welcher das Harz vorliegt.

mg Vitamin B₁₂ (Färbung)

Form des Harzes

Cyanid-Acetat

Acetat

Hydroxyd

Im Eluat

Im Eluat durchbruch

Adsorption*)

41 56 80 —90%

37 54 60 — 80%

24 48 weniger

als 50%

* Unter der Annahme einer ioo°/₀igen Eluierung des adsorbierten Vitamins B₁₂.

. Beispiel 4

Man leitet durch eine Säule aus dem gleichen Harz wie im Beispiel 3, welche 95 ecm Harz als Cyanid enthält, etwa 5 ecm einer wäßrigen Lösung, die etwa 10 mg Vitamin-B₁₂-aktive Substanzen und 90 mg nicht identifizierte Verunreinigungen je ecm^; enthält. Die Säule wird mit Wasser ausgewaschen und mit einer 5°/oigen wäßrigen Essigsäurelösung eluiert. Das Verfahren entspricht demjenigen, gemäß Beispiel 2, B. Es wurde gefunden, daß Vitamin B₁₂ adsorbiert, die Eluierung leicht bewirkt und eine erhebliche Reinigung erzielt wird. Bei der Eluierung enthält das angereicherte Eluat 39 mg Vitamin B₁₂ im Vergleich zu einer Gesamtmenge von 51 mg in dem Eluat + dem Durchbruch, woraus zu ersehen ist, daß die Adsorption (unter der Annahme einer ioo%igen Eluierung) etwa 70 bis 80% beträgt,.

Beispiel 5

Man leitet durch eine Säule von dem gleichen Harz wie im Beispiel 3, welches in Form des Cyanid-Acetates vorliegt' und mit Methanol gefüllt ist, eine mit Kaliumcyanid behandelte methylalkoholische Lösung eines Vitamin-B₁₂-Konzentrates. Die Säule wird anschließend mit Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und dann mit einer methylalkoholischen ioVoigen Essigsäurelösung eluiert. Dieses Verfahren entspricht im übrigen demjenigen gemäß Beispiel 2, B. Es wurde gefunden, daß Vitamin B₁₂ adsorbiert, die Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption beträgt: in diesem Fall, be^: zogen auf das Verhältnis von Vitamin B₁₂ im Eluat (angereicherter Schnitt) /Vitamin B₁₂ im Eluat + Durchbruch, d.h. auf 23:37mg, etwa 60.bis 8o'°/o. .

Man leitet durch eine Säule von dem gleichen Harz wie im Beispiel 3, welches in Form des Cyanid-Acetates vorliegt und mit Wasser gefüllt ist, eine mit Kaliumcyanid behandelte wäßrige Lösung eines Vitamin-B₁₂-Konzentrates. Die Lösung wird anschließend mit Wasser und Methanol gewaschen und dann mit 5°/oiger methylalkoholischer Essigsäure eluiert. Das Verfahren entspricht im übrigen dem im Beispiele, B be- ·■■■> schriebeneil· Verfahren. Es wurde gefunden, daß Vitamin B₁₂ adsorbiert, die Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption beträgt in diesem Fall über 90%, d.h. 47,7 mg Vitamin B₁₂ im Eluat (angereicherter Schnitt) je 49,7 mg Vitamin B₁₂ im Eluat + Durchbruch, was ein Anzeichen dafür ist, daß als Ausgangsgut eine wäßrige Lösung besser als eine methylalkoholische ist.

Beispiel 6

Eine mit Kaliumcyanid, behandelte wäßrige Lösung eines Vita.min-B₁₂-Konzentrates wird in drei gleiche Teile geteilt. Die Teile werden auf p_H 4, 7 bzw. 9 eingestellt, und jeder dieser Teile wird gemäß Beispiel 2, B behandelt. Es wurde gefunden, daß bei den verschiedenen p_H-Werten im wesentlichen die gleiche Adsorption, Eluierung und Reinigung erzielt wird.

Beispiel 7

Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wird mit der Maßgabe wiederholt, daß man ein stark basisches Anionenaustauschharz mit quaternären Ammoniumgruppen verwendet. Es wurde gefunden, daß die Verunreinigungen durch Behandlung mit dem Harz in Abwesenheit von Cyanid entfernt werden und daß in Anwesenheit von. Cyanid die Adsorption von Vitamin B₁₂ erfolgt, daß die anschließende Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption beträgt in diesem Fall

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etwa 60 bis 80 °/o, d. h. etwas weniger, als sie mit »Amberlite XE-75« oder »XE-98« erzielt wird,

Beispiel 8

Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wird in drei getrennten Versuchsreihen wiederholt, wobei an Stelle eines stark basischen Anionenaustauschharzes mit quaternären Ammoniumgruppen nunmehr ein harzartiges Kondensationsprodukt aus Phenolformaldehyd und Alkylenpolyamin mit primären, sekundären und tertiären Aminen und Phenolgruppen sowie ein stark basisches PoIyaminharz als Anionenaustauschharze nunmehr verwendet werden. Es wurde gefunden, daß die Verunreinigungen durch Behandlung mit dem Harz in Abwesenheit von CyanM entfernt werden und in seiner Anwesenheit Vitamin B₁₂ adsorbiert wird, daß die anschließende Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption war indessen bei Verwendung dieser Harze verhältnismäßig niedrig, d. h., es wurden weniger als 50% der aktiven, Substanzen adsorbiert und als Eluat (angereicherter Schnitt) gewonnen.

Beispiel 9

Das Verfahren, gemäß Beispiel 2 wird mit der Maßgabe wiederholt, daß ein Kondensationsprodukt vom Molamintypus verwendet wird. Es wurde gefunden, daß die Verunreinigungen durch Behandlung mit dem Harz" in Abwesenheit von Cyanid entfernt werden und daß in seiner Anwesenheit die Adsorption von; Vitamin B₁₂ erfolgt, daß die anschließende Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption an diesem Harz war verhältnismäßig hoch; es werden etwa 70 bis o.o°/o der aktiven Substanzen adsorbiert und als Eluat (angereicherter Schnitt) gewonnen.

Beispiel 10

Das Verfahren gemäß Beispiel 2, B wird mit der Maßgabe wiederholt, daß gleiche Teile des Harzadsorbates getrennt mit je einer wäßrigen Lösung von Schwefel-, Salz-, Phosphor-, Glutamin-, Zitronensäure, einbasischem Kaliumphosphat bzw. Natriumhydroxyd eluiert werden, Mit den ersten drei Lösungen erzielt man eine gute Eluierung (90% oder mehr), mit den nächsten drei Lösungen eine annehmbare Eluierung (60 bis 90 %) und mit Natriumhydroxydlösung eine recht schlechte Eluierung (weniger als-50%).

Das oben beschriebene Verfahren, wird wiederholt, und das Harzadsorbat wird abwechselnd mit wäßriger Natriumchloridlösung, Wasser, Natriumchloridlösung, Wasser, einbasischem Natriumphosphat, Wasser, Natriumsulfat und Wasser eluiert und gewaschen, und zwar in jedem Fall so lange, bis die abströmende Flüssigkeit im wesentlichen farblos geworden ist. In jeder Fraktion ist Vitamin B₁₂ in verschiedenen Anteilen enthalten, und. das gesamte Vitamin B₁₂ wird im wesentlichen eluiert.

Beispiel 11

Es werden mehrere wäßrige Vitamin-B₁₂-aktive Konzentrate nach dem gleichen Verfahren gewonnen und gereinigt, indem man sie durch eine Säule leitet, die 45 1 eines stark basischen Anionenaustauschharzes mit quaternären Ammoniumgruppen in Acetatform enthält. Die Konzentrate haben ein Volumen von 151 bis 227 1. Die Leitung der Lösungen durch die Säulen und das Auffangen, der Fraktionen erfolgt im allgemeinen gemäß den Beispielen i, A und 2, A. In jedem Fall zeigen Farbmessungen, daß die gefärbten Verunreinigungen im wesentlichen entfernt werden. Die weiteren Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle, dargestellt.

	B₁₂-aktive	Substanzen, g*	Gesamte	Feststoffe, g*
Versuchs-
Nr.	Beschickung		Beschickung
	der Säule		der Säule

	87,3		8140
.2	64,0		51OO
■ 3'	77.6		6730
■ 4 ■ .	64,3		4470
5	38,2		65OO
6	48,4		8050
(angereicherte	(angereicherte
Fraktion)	Fraktion)
abströmende	abströmende.
Flüssigkeit '	Flüssigkeit
76,7	52OO
64,0	4270
7²>°	52OO
59,5	3120
35.9	5550
48,8	5950

* Die·· Harzeinlägen sind in allen Beispielen in Raumteilen angegeben, gemessen unter Verwendung von radioaktivem VitaminB₁₂ als Spurensubstanz.

Claims

PAT E N TAN SPRÜCHE:

ι. Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Vitamin B₁₂"'aus einem Verunreinigungen enthaltenden Vitamin-B₁₂~aktiven Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Vitaminsubstanz ■ und die Verunreinigungen enthaltende Lösung in, Gegenwart von Cyänionen mit einem mäßig bis stark basischen und mäßig bis stark porösen Anionenaustauschharz behandelt, dessen Austauschkapazität im wesentlichen auf quaternären Ammoniumgruppen beruht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung der Vitaminsubstanzen und der Verunreinigungen zunächst

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in Abwesenheit von Cyanionen einer Vorbehandlung mit einem in Salzform vorliegenden Anionenaustauschharz unterwirft, um einen Teil der Verunreinigungen zu entfernen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Adsorption von Vitamin B₁₂ ein Harz verwendet, das zumindest teilweise in Form des Cyanidsalzes vorliegt, bevor man es mit der Lösung behandelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Cyanionen mindestens teilweise dadurch liefert, daß man einen Cyanionen entwickelnden Stoff der Ausgangslösung zusetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Adsorbat mit einem sauren Eluierungsmittel wäscht und dadurch das gereinigte Vitamin B₁₂ gewinnt.