DE2210155A1 - Antibiotikum Reinigung - Google Patents

Description

Patentanwälte ο März lQ-^9 1 Π 1

Dr. Ing. Walter Abitz ■ 14 198

Dr. Dieter F. Morf

Dr. Hans-A Brauns
8Müh

MERCK & CO., INC. 126 East Lincoln Avenue, Rahway, Ii. J. , V. St. A.

Antibiotikum-Reinigung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung der neuen antibiotischen »Substanz 7-ß-(D-5-Araino-5~ c arboxy val er ami do ) - J-( c arb amoy 1 oxym.e th.y 1)-7-me thoxy-J-c ephem-4-carbonsäure oder Salze derselben.

Antibiotika sind erhältlich, indem man Stämme eines speziellen Mikroorganismus in zweckentsprechenden, wässrigen Nährmedien bei gelenkten Bedingungen züchtet. Allgemein muss man solche Antibiotika, damit sie von praktischem Wert sein können, in gereinigter Poιήι erzielen, in der sie von den anderen organischen Materialien wie auch von einer Anzahl von anorganischen Verbindungen, die in Fermentationsbrühen oder deren Konzentraten vorliegen, im wesentlichen frei sind. Die vp-rliegende Erfindung ist auf die Gewinnimg eines solchen Antibiotikums in gereinigter Form gerichtet.

Es wurde gefunden, dass sich. 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)--3-(carbamoyloxymethyl)-7-niethoxy~3-cephem-4-carbon-

209839/1067

14198

säure und Salze derselben durch Anwendung eines mehrstufigen Reinigungsprozesses reinigen lassen.

Gemäss der Erfindung kann die Gewinnung und Reinigung der antibiotischen Substanz 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carb amoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder Salze derselben aus wässrigen, das Antibiotikum· enthaltenden Lösungen erfolgen, indem man zuerst die Fermentationsbrühe, in der das Antibiotikum gebildet wurde, mit einem Kationenaustauschharz zwecks Adsorption des Antibiotikums an diesem Harz zusammenbringt, zweitens das Antibiotikum von dem Harzadsorbat mit einer schwachen Base, einer wässrigen Lösung einer organischen Base oder einer anorganischen Base, eluiert, drittens die konzentrierten Eluate mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz zwecks Adsorption des Antibiotikums an diesem Harz zusammenbringt, viertens das Harz mit einer verdünnten Lösung einer Kiedermol.-alkansaure zwecks Entfernung von Verunreinigungen auf dem Harz wäscht und schliesslich das im wesentlichen reine Antibiotikum von dem Harzadsorbat unter Verwendung einer schwachen Base oder einer Pufferlösung eluiert. Als Pufferlösung sind alle gewöhnlichen wässrigen Puffer im pH-Bereich von 4,5 bis 9j5 verwendbar. Z. B. kann man mit Phosphat-, Acetat-, Borat- und Citratpuffern arbeiten.

Die Reihenfolge der Arbeitsschritte und die verschiedenen eingesetzten Reagentien sind bezüglich einer Ilaximierung der Ausbeute kritisch. Jeder der Schritte ist nachfolgend näher beschrieben.

Das Antibiotikum 7-ß-(^-ii^-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze vermögen das Wachsen verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen zu inhibieren.

— 2 209839/1067

Nachfolgend sind "bevorzugte Ausfülirungsformen beschrieben. Die 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)~7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure der folgenden Formel wird während der aeroben Fermentation zweckentsprechender, wässriger Nahrmedien bei gelenkten Bedingungen durch einen zur Bildung der Verbindung befähigten Stamm von Streptomyces lactamdurans gebildet, z. B. den unter Zugangsnummer KHEL 3802 unbeschränkt und bleibend hinterlegten Stamm in der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Branch des U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A., und ist in Form der Inhibierung des Wachsens von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen aktiv. Formel:

PCH,

COOH

Diese Verbindung ist amphoter, hat einen scheinbaren isoelektrischen Punkt von etwa pH 3>5 und zeigt in Lösung bei einem pH-Bereich von etwa 1,5 bis 9₅O die höchste Beständigkeit.

Die emphotere Natur dieser .Verbindung erlaubt die Anwendung sowohl von Kationen- als auch von Artioneriaustauschharzen bei der Reinigung der Verbindung. Jedoch liegen auf Grund der komplexen Natur* der rohen Fermentetionsbrühe viele andere saure und/oder basische Substanzen "vor.

Die vorliege·,:!.e Lrfinäur<£ macht somit eiri Seinigungsverff'h-

7 U 9 8 3 9 / 1 0 ß 7

ren verfügbar, das zur Isolation des Endproduktes in hoher Ausbeute bei Anwendung einer nur geringen Zahl von Manipulationsstufen führt. Sie ermöglicht die Isolierung des Endproduktes in einer Form, die direkt bei weiteren chemischen Synthesen einsetzbar oder direkt als Antibiotikum anwendbar ist, ohne dass es einer zusätzlichen chemischen Modifizierung bedarf.

Das zu reinigende Ausgangsmaterial wird regelmässig die Form der rohen Fermentationsbrühe haben. Zwar kann man bei dem vorliegenden Verfahren auch partiell gereinigte Brühen einsetzen, aber ein besonderer Vorzug des Verfahrens gemäss der Erfindung liegt darin, dass die rohe Brühe keiner Vorbehandlung unterworfen zu werden braucht.

Lie das Antibiotikum enthaltende Brühe wird durch eine kationische Ionenaustauschsäule geleitet. Ein typisches Harz ist Harz des Sulfonattyps mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, z. B. das Polystyrol-Kernsulfonsäure-Harz Dowex 50 im Η-Zyklus, wobei vorzugsweise das Harz Dowex $0 χ k (diese Angabe besagt, dass das Harz 4- % Vernetzung aufweist) eingesetzt wird. Auch andere im Handel verfügbare Sulfonsäureharze sind verwendbar. '

Vor dem Zusammenbringen mit dem Harz wird die Brühe auf pH-Werte von unter 7» etwa zwischen 1,5 und 7> eingestellt. Vorzugsweise stellt man den pH-Wert durch Zusatz kleiner Mengen irgendeiner anorganischen oder organischen Säure auf 2 bis 4 ein. Als Säure bevorzugt wird Phosphor-, Salz- oder Schwefelsäure, wenngleich diese Auswahl naturgemäss nicht entscheidend ist.

Das anfallende Harzadsorbat wird dann mit einer wässrigen Lösung einer r.chininJien Base eluiert. Die Stärke des Eluierungsai.ittels r.ol.l 0,1- bis 2,Omolar entsprechen. Die Wahl der

_ i\ _
209839/1067

14198

Base ist nicht weiter kritisch";, so kann man mit einer organischen Base wie Pyridin, Trialkylamin, wie Triethylamin, ein Picolin, Triäthanolamin oder ein Lutidin arbeiten oder eine wässrige Lösung einer organischen oder anorganischen Base we NH^OH einsetzen. Als Eluierungsmi'ttel bevorzugt wird flüchtige organische Base, da sie sich leicht wieder entfernen lässt. Pyridin wird besonders bevorzugt.

Die Eluate werden in Fraktionen gesammelt, wobei die Grosse der Fraktion von der Säulengrösse abhängt. Zur Bestimmung der Bioaktivität der Eluate untersucht man das Eluat unter Anwendung von Vibrio percolans als Bewertungsorganismus. Die den grössten Teil des aktiven Materials enthaltenden Fraktionen werden dann, im allgemeinen im Vakuum, eingeengt, um jegliche flüchtige Base und organischen Lösungsmittel zu entfernen. Diese Reinigung unter Einsatz des Kationenaustauschharzes ist naturgemäss nicht auf Fermentationsbrühen beschränkt, sondern kann auch bei jeglicher unreinen Lösung der Verbindung nach der obigen Formel Anwendung finden.

Dieses Konzentrat wird dann auf etwa pH 5 bis 7 eingestellt und durch ein Anionenaustauschharz des schwach basischen Typs, wie ein Tertiäramin-Harz auf einer Acryl-Matrix oder Styrol-Divinylbenzol-Matrix, geleitet. Ein Beispiel für das erstgenannte Harz ist das IEA-68 im Chlorid-, Formiat- oder Acetatzyklus. Während der pH-Wert nicht weiter entscheidend ist, hat sich ergeben, dass der optimale pH-Wert dieses Ha rzes zwischen 6 und 7 liegt.

Das anfallende Harzadsorbat wird dann mit einer verdünnten, wässrigen Lösung einer Niedermol.-alkansäure "gewaschen". Die Niedermol.-alkansäure ist vorzugsweise eine Säure mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wobei von diesen die Essigsäure besonders bevorzugt wird. Ohne die Erfindung auf eine Theorie zu beschränken, wird angenommen, dass die "Waschstufe" zur Bildung eines konkurrierenden Prinzips für die basischen Stellen

- 5 - . 209839/106?

auf dem Harz führt. Die weniger sauren Substanzen, die Verunreinigungen des antibiotischen Produktes darstellen, werden durch diese Säurewaschstufe entfernt, während überraschenderweise das basische Antibiotikum adsorbiert auf dem Harz bleibt. Diese Adsorption und Waschung führen daher in ihrer Kombination zu einer starken Erhöhung der Reinheit des Endproduktes.

Es hat sich gezeigt, dass die wässrige Lösung der Niedermol.-alkansäure zwischen 0,1- und 1,0molar arbeitsfähig ist, wobei ein Bereich von etwa 0,5- bis O,75molar bevorzugt wird. Das Gesamtvolumen bei der Säure-"Waschung" ist naturgemäss eine Funktion der Säulengrösse und lässt sich im Versuch bestimmen. Z. B. hat sich gezeigt, dass 5 Säulenvolumina 90 % der Verunreinigungen entfernen, wobei ein Verlust an aktiver Substanz unter 6 % liegt. Bei der Säurewaschung können 3 bis 10 Säulenvolumina Anwendung finden.

Das "gewaschene" Harzadsorbat wird dann eluiert, wobei verschiedene Substanzen zufriedenstellend wirken. Nach einer bevorzugten Arbeitsweise setzt man eine schwache organische Base oder ein Salz derselben, wie Pyridin oder Pyrxdinhydro-' chlorid, in wässriger Lösung ein.

Ein anderes Eluierungsmittel ist ein wässriger, anorganischer Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von etwa 8.

•\

Die das aktive Material enthaltenden Eluatfraktionen sind mittels der obigen Bewertungsmethode identifiziert worden. Im allgemeinen wird der grösste Teil der Aktivität in den Eluatfraktionen 1 bis 7 erhalten, wobei die Fraktionen 2 bis 5 einen noch engeren bzw. spezifischeren Bereich bilden.

Das gereinigte Antibiotikum kann dann z. B. durch Abdampfen, aus dem Eluierungsraittel gewonnen werden, aber man kann es auch einer weiteren chemischen Behandlung zur Bildung von

209839/t~067

14198

antibiotisch aktiven, chemischen Derivaten unterwerfen.

Die vorliegende antibiotische Verbindung und ihre Salze zeigen Resistenz nicht nur gegenüber Penicillinase, sondern auch gegenüber den Cephalosporinasen und bieten eine verstärkte Aktivität gegen gram-negative Mikroorganismen. Ungleich Cephalosporin C, dessen antibakterielle Aktivität relativ gering ist, ergeben die Produkte geiaäss der Erfindung einen wesentlichen In-vivo-Gramnegativeffekt mit einem Wirkungsvermögen, das allgemein dasjenige von Cephalothin übersteigt. Zu dieser Aktivität gehören In-vivo-Virksamkeit bei Proteus morganii und darüberhinaus Wirksamkeit gegen die gram-negativen Bakterien Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsieila pneumoniae AD, Klebsieila pneumoniae B und Paracolobactrum arizoniae.

Die Biobewertungen des vorliegenden Antibiotikums erfolgen nach einer Scheiben-Platten-llethode unter Verwendung von 1,3-cm-Filtrierpapierscheiben. Man bereitet die Bewertungsplatten unter Einsatz von Difco-Kahragar zuzüglich 2,0 g Difco-Hefeextrakt je 1 mit 10 ml/Platte vor. Das Übernacht anfallende Wachstum des Bewertungsorganismus, Vibrio percolans ATCC 8461, wird in steriler Kochsalzlösung zu einer Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit bei 660 iau Wellenlänge von 40 % verdünnt. Diese Suspension gibt man vor dem Aufgiessen auf die Platten mit 20 ml /1 Medium hinzu.

Die Bewertungsplatten werden bis zur Verwendung auf 4° C gehalten (maximal 5 Tage). Hach der Aufbringung der antibiotikumgesätti^ten Bewertungsscheiben werden die Platten 8 bis 24 Std. bei 28° C inkubiert. Die Inhibierungszonen werden in l'oj'm des in ilillineter ausgedrückten Durchmessers ermittelt uixj zur Bestimmung des relativen Wirkungsvermögens odor, boam Vergleich mit einem gereinigten Bezugsstandard, den W;i x-üntMgs vermögen ε in γ/'.jl herangezopjen.

- V 2098 3 9/1067

JJßP .ORIGINAL

Die 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido) -3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-J-cephem-4-carbonsäure wird während der aeroben Fermentation zweckentsprechender, wässriger Nährmedien bei gelenkten Bedingungen über die Beimpfung mit dem Organismus Streptomyces lactamdurans NERL 5802 erhalten. I¹Ur die Erzeugung der antibiotischen 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-^arbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure eignen sich wässrige Medien, wie die auch zur Erzeugimg anderer Antibiotika verwendeten. Solche Medien enthalten durch den Mikroorganismus assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze.

Allgemein kann man als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedien Kohlenhydrate, wie Zucker, z. B. Traubenzucker, Arabinose, Maltose, Raffinose, Xylose,'Mannit und dergleichen, und Stärken, wie von Getreide, z. B. Hafer-, Roggen- und Maisstärke, Maismehl und dergleichen allein für sich oder in Kombination einsetzen. Die genaue Einsatzmenge an Kohlenhydratquelle(n) in dem Medium hängt zum Teil von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, aber im allgemeinen liegt die Kohlenhydratmcnge zwischen etwa 1 und 6 % von Gewicht des Mediums. Man kann diese Kohlenstoff quellen einzeln für sich einsetzen oder in dem Medium mehrere derselben vereinigen. Als Stickstoffquelle bei dem Fermentationsprozess kann allgemein jedes proteinhaltige Material dienen. Stickstoffquellen sind z. B. Hefehydrolysate, "Amber"-liefe, Sojabohnenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenpaste und dergleichen. Man setzt die Stickstoffquelle(n) allein für sich oder in Kombination in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 % vom Gewicht des wässrigen Mediums ein.

Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 37° 0 durchgeführt, aber zur Erzielung optimaler Ergebnisse arboi Let man vorzugsweise bei etwa 24 bis 32° C.

- 8 209839/1067

Der pH-Vert der Nährmedien für das Züchten der Streptomyceslactamdurans-Kultur und Bildung des Antibiotikums soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen. %

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne dass diese auf sie beschränkt ist.

Beispiel 1 A) fermentation

Mit einem lyophilisierten Röhrchen Streptomyces-lactamdurans-Kultur (NRRL J802) wurden 50 ml keimfreies Medium I der Zusammensetzung

Hefeautolysat (Ardamin) Traubenzucker

Phosphatpuffer (aus 91,0 g 95,Og Na₂HPu₄ und 1000,β ml destilliertem Wasser)

10,0	B
10,0	S
2,0	ml
0,05	ε
1000,0	ml

destilliertes Wasser pH-Wert: 6,5

in einem mit Unterteilungen versehenen 200-ml-Erlenmeyerkolben beimpft.

Der beimpfte Kolben wurde dann auf eine mit 220 U/Min, arbeitende Rotationsschuttel vorrichtung mit 5,1 cm-Hub aufgegeben und 72 Std. bei 28° C inkubiert.

Aliquote 5-ml-Anteile (10 % Inoculum) dieses Wachstums wurden dann unter Verwendung keimfreier -Pipetten in vier Zweitstufe-Impfkolben übergeführt, welche die gleiche Grosse wie oben hat ton und dar, gleiche Medium enthielten und dann in der obengenannten V/eise geschüttelt wurden. Diese Kolben wurden dann asepticch in einen Kolben entleert und zur Be-

impfung von elf 2-1-Erlenmeyerkolben mit Unterteilungen, deren jeder 350 ml Medium II der Zusammensetzung

"Amber"-Hefe Nr. 3OO 10,Og

Lösliche Schiempebestandteile 20,0 g

Dextrose 10,0 g

Destilliertes Wasser 1000,0 ml· pH-Wert: 7,0

enthielt, unter Verwendung keimfreier Pipetten mit 2 bis 3 °/° Inoculum eingesetzt. Die hierbei verwendete Hefe ist eine Fraktion autolysierter Brauereihefe (Herstellerin die Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, U.S.A.).

Die Produktionskolben wurden dann auf einer mit 145 U/Min, arbeitenden Schüttelvorrichtung mit 5,1-cm-Hub 4 Tage bei 28 C geschüttelt. Am Ende der Inkubationsperiode wurde der Inhalt zwanzig solcher Kolben vereinigt und zur Entfernung des Myceliums eine Probe geschleudert.

B) Adsorption auf Kationenaustauschharz

Eine Säule stark saures Kationenaustauschharz des Sulfonattyps mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix (Dowex 50-X-4) im H-Zyklus von 103 cm Höhe und 12,44 cm Durchmesser (enthaltend 480 ml Harz) wurde einer Rückwaschung unterworfen, um Peinstoffe loszulösen und zu entfernen.

Die in Stufe A erhaltene Brühe wurde filtriert. Die Feststoff-Aktivität betrug 60 bis 100 Einheiten/mg.

Durch die Harzsäule wurden mit etwa 60 ml/Min. 5 l(ca. 10 Säulenvolumina) der gefilterten, auf pH 2,5 eingestellten Brühe hindurchgopumpt; die Abbrühe wurde gesammelt. Nach Waschen mit 1 1 Wasser stand die Säule für die Eluierung bereit.

- 10 209839/1067

C) Eluierung

Als Eluierungsmittel diente Pyridin (O,5molar) in Wasser. Die Pyridinlo'sung wurde mit 40 ml/Min, durch die Säule geleitet, vio"bei 100-ml-Proben gesammelt wurden. Die die biologisch aktive Substanz gemäss der Erfindung enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. In den aktiven Fraktionen wurden 94 % der biologischen Aktivität gewonnen.

Das Eluat enthielt das Pyridiniumsalz der 7-ß-(D-5 carboxyvaleramido)-5-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-5-cephem 4-carbonsäure. Die vereinigten Schnitte wurden auf einem Drehverdampfer auf etwa 100 ml eingeengt, ein brauner Feststoffniederschlag wurde abfiltriert und das E¹Utrat und die Vaschiösungen wurden wieder auf etwa 30 ml eingeengt, worauf der pH-Wert mit 2,5 η NaOH (3 ml) auf etwa 4 bis 7 eingestellt und das Volumen auf 100 ml gebracht wurde.

D) Adsorption an schwach basischem Anionenaustauschharz

Eine 250-ml-Säule schwach basisches Tertiäramin-Harz auf Acrylharz-Iiatrix (IRA-68) wurde in die Acetatform gebracht. Das in Stufe C erhaltene Konzentrat wurde mit 10 ml/Hin, durch die Säule geleitet, die dann mit 250 ml Wasser und hierauf mit 1250 ml 0,5molarer Essigsäure gewaschen wurde.

E) Eluierwjp; mit Pyridin

Die Säule wurde nun mit 250 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,5molare:n I'yriuin eluiert. Bei der Gefriertrocknung der ersten 5 Säulenvo] uiriina, die etwa 70 ^c/'° der biologischen Aktivität aufu-lesen, fielen J25 mg eines hell gelbbraunen Feststoffs an, der uln dan Pyridin-SaIζ der 7-ß-(^~5-Araino-5-carboxyval orsraido )-J- ( carbamoyloxymGthyl)-7-methoxy-3-cep.liem-4-carbonsRUx¹G iat einer Aktivität von 5400 Einheiten/mg i d ei 11 i f i ζ i ort v; u ν d e.

- 11 -209839/1067

Beispiel 2

Im wesentlichen wie in Beispiel 1 wurden die Stufen A bis D durchgeführt. In der letzten Eluierungsstufe E wurde anstelle des Pyridin-Eluierungsmittels von Beispiel 1 hier ein Phosphatpuffer als Eluierungsmittel eingesetzt.

Zur Herstellung des Phosphatpuffers wurden (a) 14,2 g Na₂HPO₄ in 100 ml Wasser und (b) 13,2 g KH₂PO₄ in 100 ml Wasser gelöst, was molaren Lösungen entspricht. 75 ^ml (⁸O und 5 ml (b) wurden gemischt und auf 1600 ml verdünnt, um einen etwa 0,05molaren Phosphatpuffer von pH 8 zu erhalten.

Dann wurde die Tertiäraminharz-Säule mit dem obigen Phosphatpuffer eluiert. Etwa 73 % der biologischen Aktivität fanden sich in 4 Säulenvolumina Eluat, wobei diese biologische Aktivität auf dem Vorliegen der 7-ß-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure beruhte.

- 12 -·
209839/1067

Claims (6)

1. Pat entansprüche

   Verfahren zur Gewinnung der antibiotischen 7~ß~(D-5-Aiiiino-5-carlDoxyvaleramido)-3-(car'bainoyloxymethyl)-7- * methoxy-J-cephem-^carbonsäure oder eines Salzes derselben aus unreinen, wässrigen Lösungen, welche diese antibiotische Substanz enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man

   a) Fermentationsbrühe oder eine Lösung, welche das Antibiotikum enthalten, durch ein saures Kationenaustauschharz leitet,

   b) das Harzadsorbat mit einer schwachen Base eluiert,

   c) die Eluate durch ein schwach basisches Anionenaustauschharz leitet,

   d) das adsorbierte Harz mit einer wässrigen, verdünnten Lösung einer Niedermol,-alkansäure \\^räscht,

   e) das adsorbierte Harz mit einer Lösung schwach basischen Eluierungsmittels oder mit einem Puffer eluiert und

   f) die Eluate sammelt, die aktiven Fraktionen vereinigt und zur Produktgewinnung die Lösungsmittel entfernt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Anionenaustauschharz mit an einem Acrylpolymergitter sitzenden Tertiäramin-Austauschgruppen verwendet.
3. 3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass iTiBj-j ein Kationenaustauschharz mit an einem Styrol-Mvinylbenzol-Polymergitter sitzenden Kernsulfonsäure-Austau schgrupp en verwendet.
4. 4. Verfahren nach eineiri oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, dor»s man in »Stufe (b) wässriges Pyiiuin uΊ η schwach b^.r.isclio EluierungfjlÖGimr; verwendet.

   - 13 209839/1067
5. 5· Verfahren nach, einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Niedermol.-alkansäure Essigsäure verwendet.
6. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (e) Pyridin als schwach basisches Eluierungsmittel verwendet.

   7· Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (c) wässrigen
   Phosphatpuffer als schwach basisches Eluierungsmittel
   verwendet.

   - 14 20y839/1067