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Verfahren zur Herstellung von neuen Penicillinen auf biologischem
Wege Die Penicilline sind eine Antibiotikagruppe, bei der sich die einzelnen Glieder
voneinander durch die Seitenkette unterscheiden, die an einem besonderen heterozyklischen
Kern verkettet ist, der den Namen 6-Amino-penicillansäure trägt. Die Art der Seitenkette,
die mit dem Penicillinkern während der Fermentation verkettet wird, hängt in erster
Linie von der Gegenwart der Komponente im Kulturmedium und von der Konzentrationshöhe
ab, welche die genannte Kette bilden soll, und von der genetischen Spezifität des
Wachstums des Sehimmelpilzstammes.
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In einer Kultur können mehr als eine Penicillinart gebildet werden.
Kürzlich wurde ein hydrophiles Penicillin entdeckt, das als Cephalosporin N bezeichnet
wurde. Es zeigt eine Seitenkette die D-«-aminoadipinsäure und wurde von bestimmten
Cephalosporium- und Emericellopsis-Arten gebildet.
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Das Penicillium chrysogenum ist ungeeignet, die genannte Kette einzuverleiben,
selbst wenn die Komponente in hohen Konzentrationen dem Kulturmedium zugegeben wurde.
Das Cephalasporium N hat ein antibiotisches Spektrum, das sich merklich von dem
der bisher bekannten Penicilline unterscheidet und das gegenüber den letzteren eine
größere Aktivität gegen die gramnegativen Bakterien (z. B. Klebsiena pneumoniae)
und eine sehr verminderte Aktivität gegen die grampositiven Bakterien (z. B. Bacillus
subtilis) zeigt.
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von co-Carboxylalkyl-penicillinen
aus Kulturen von sorgfältig ausgewählten Stämmen von Penicillium chrysogenum, die
in einem flüssigen Medium in Gegenwart von aliphatischen Bicarbonsäuren gewachsen
sind. Diese Penicilline haben infolge der Gegenwart einer Carboxylgruppe, in der
an den Kern angehängten Kette einen starken hydrophilen Charakter und können infolgedessen
selbst bei niedrigen pH-Werten aus dem Kulturmittel durch organische Lösungsmittel
nicht extrahiert werden. Diese Penicilline zeigen antibakterielle Eigenschaften,
die denen des Cephalosporins ähnlich sind, d. h., ihre Aktivität ist gegenüber den
grampositiven Bakterien, z. B. dem Staphylococcus aureus und dem Bacillus subtilis,
vermi,n.dert und gegenüber den gramnegativen Bakterien, z. B. Salmonella und Klebsiella
pneumoniae, verstärkt.
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Nach dem Verfahren nach dieser Erfindung wird eine aliphatische Dicarbonsäure
der Formel H02C-(CH2)"-C02H in der n eine ganze Zahl von 0 bis 15 bedeutet, einem
Kulturmedium von Penicillium chrysogenum in Mengen von 0,1 bis 1,0 g je 100 ml zugesetzt.
Das Kulturmedium kann ein natürliches sein, das z. B., wie üblich, den Auszug aus
gequollenem Getreide oder Mais oder pflanzliche Proteine enthält. Das Medium kann
aber auch andererseits synthetisch sein, wobei es nach den bekannten Verfahren zubereitet
ist. Die Fermentation des P. chrysogenum wird dann unter Umrühren und üblichen aeroben
Bedingungen bei etwa 25 bis 30° C durchgeführt. Nach 96 bis 120 Stunden sind die
Penicilline im Kulturfiltrat zu finden, nachdem die Penicilline X, G, K, F und das
Dihydropenicillin F mit organischen Lösungsmitteln bei saurem pH extrahiert wurden.
Die Penicilline werden auf geeigneten Adsorbtionsmitteln (aktive Kohle, Tonerde
u. a.) fixiert, wovon sie durch Aceton oder durch andere mit Wasser mischbare organische
Lösungsmittel wieder gelöst werden. Die erhaltene Lösung wird bei niedrigen Temperaturen
und bei vernnindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird mit 75o/oigem Aceton
wieder gefällt und auf Tonerde oder einen anderen adsorbierenden Stoff chromatographiert.
Eine andere Möglichkeit ist die Methanolextraktion, aus der das aktive Material
wieder mit Aceton gefällt wird. Eine andere Reinigung wird durch Chromatographie
auf einem Anionenaustauschharz durchgeführt, wobei eine Salzlösung als Lösungsmittel
benutzt wird. Der genannten Chromatographie kann eine
Elektrophorese
in einer Zellulosesäule folgen oder vorausgehen.
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Die Penicilline, zu denen die Erfindung führt, haben eine Formel wie
folgt:
n ist hierbei eine ganze Zahl von 0 bis 15. Die folgenden Beispiele werden zum besseren
Verständnis des Verfahrens der Erfindung gegeben. Beispiel 1 Ein synthetisches Kulturmedium
wurde benutzt mit folgender Zusammensetzung (g/1): Laktose 30, Glukose 5, Ammoniumlactat
5, Ammoniumacetat 3, zweibasisches Kaliumphosphat 3, Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat
0,1, Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,25, Zinksulfat 0,3, Natriumsulfat 0,5, Magnesiumsulfat
0,02, Kupfersulfat 0,005, Kaliumchlorid 0,05, Kalziumkarbonat 10, Adipinsäure 4.
Der pH-Wert wurde auf 6,8 mit 100/aigem Natriumkarbonat eingestellt. Dieses Kulturmedium
wurde mit Mycel von Penicillium chrysogenum beimpft und bei 25 bis 28° C unter ständigem
Rühren und Belüften gehalten. Nach 100 Stunden wurde die Fermentation unterbrochen
und das Mycel abfiltriert. Bei der biologischen Analyse entsprach die Aktivität
gegen Bacillus subtilis der von 50 Einheiten je Milliliter von Benzyl-Penicillin
und gegen Klebsiella pneumoniae der von 600 Einheiten je Milliliter von Benzyl-Penicillin.
Das Kulturfiltrat, das auf den pH-Wert 2 angesäuert wurde, wurde mit dem doppelten
Volumen Butylacetat oder Amylacetat extrahiert, mit Natriumhydrat wieder auf einen
pH-Wert von 6,5 gebracht und bei 3 ° C auf einer Säule, die adsorbierende Holzkohle
in einer Menge enthält, die einem Drittel des Volumens des Kulturfiltrates beträgt,
zum Durchfluß gebracht. Danach wurde die Säule mit einem Drittel ihres Volumens
mit Wasser ausgewaschen und die aktiven Substanzen mit 700/aigem Aceton eluiert.
Die Acetonlösung wurde schnell bei 40° C und 10 mm Druck verdampft und der Rückstand
in 7(M/oigem Aceton übertragen. Die Lösung wurde bei 5° C in einer Säule, die aktive
Tonerde in einer Menge von einem Viertel des Volumens der Lösung enthält, zum Durchfluß
gebracht. Die aktive Substanz wurde mit 20%igem Aceton ausgewaschen, nachdem die
Säule mit 70%igem Aceton in der halben Menge der ausgewaschenen Lösung gewaschen
war. Durch Verdampfung bei 40° C und 10 mm Druck wurde ein Produkt erhalten, das
15 % aktive Substanzen enthält. Dieses Produkt wurde auf eine Elektrophoresesäule
mit Zellulosepulver übertragen, die thermostatisch bei 5° C gehalten wurde und für
24 Stunden einer Spannung von 8 V/cm in einem Phosphatpuffer (0,1 Mol, pH 7,0) unterworfen.
Auf diesem Wege wurde das 4-Carboxy-n-butylpenicillin vollkommen von anderen Penicillinen
getrennt und mit dem gleichen Phosphatpuffer ausgelöst. Die vereinten aktiven Fraktionen
wurden lyophilisiert und der trockene Rückstand anschließend zweimal kalt mit Äthanol
extrahiert, wobei jedesmal 1 ml Äthanol für 10 000 Einheiten benutzt wurde. Durch
Ausfällung mit 4 Volumteilen Aceton wurden die 60 bis 7011/o reines, 4-Carböxy-n-butylpenicillin
wiedergewonnen. Dieses Penicillin ist durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:
a) vollkommene Inaktivierung nach Einwirkung von Penicillinase, b) elektrophoretisehe
Beweglichkeit auf Papier (PhosphatpufEerm/10, pn 6,5, Spannung25 V/cm) zweimal größer
als die des Benzyl-Penicillins, c) Bildung von Adipinsäure in einem stöchiometrischen
Verhältnis durch Hydrolyse mit n-HCl (6 Stunden bei 100° C), d) Unmöglichkeit der
Extraktion mit Äther, Butylacetat oder n-Butylalkohol aus p11-2-Lösungen. Beispiel
2 Es wurde ein Kulturmedium benutzt, bestehend aus (g/1): Laktose 30, Glukose 5,
Kalziumkarbonat 10, Auszug aus gequollenem Getreide oder Mais 40. Die Adipinsäure
wurde während der Fermentation als Natriumsalz in einer Menge von 8 g/1 zugegeben.
Das Medium wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, beimpft und bei 26 bis 28° C unter
ständigem Rühren und mit einem Luftzusatz von einem 1 Vol/1 Vol/1 Minute gehalten.
Nach 95 Stunden wurde die Fermentation unterbrochen und das Mycel abfiltriert. Bei
der biologischen Analyse entsprach die Aktivität gegenüber dem Bacillus subtilis
der von 150 Einheiten je Milliliter von Benzyl-Penicillin und gegenüber Klebsiella
pneumoniae der Aktivität von 2000 Einheiten je Milliliter von Benzyl-Penicillin.
Die Penicilline wurden auf .einer Säule von aktiver Holzkohle adsorbiert und in
der im Beispiel 1 beschriebenen Weise eluiert. Das Eluat, das unter vermindertem
Druck konzentriert wurde, wurde lyophilisiert und bei 5° C in drei Stufen mit Methanol
(4 ml je Gramm Substanz) extrahiert. Die höchste Akitivität wurde gesammelt und
fraktioniert mit Aceton gefällt. Es wurde zwischen 70 und 9511/o des Acetons und
etwa 45 0l0 der aktiven Substanz gegen Klebsiella pneumoniae, das 17,% 4-Carboxy-n-butylpenicillin
enthält, wiedergewonnen.
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Die in der Lösung zurückbleibenden aktiven Substanzen gehörten hauptsächlich
zu den Penicillinen, die mit saurem Lösungsmitteln extrahierbar sind. Die Ausfällung
wird mit Wasser aufgenommen und auf einem Ionenaustauschharz (200 bis 400 Maschen)
aufgenommen, wobei man eine Säule von 1 111 Kunstharz für 8000 bis 9000 Einheiten
benutzt. Nach dem Auswaschen mit Wasser wurde das Antibiotikum mit Salzlösungen
ausgelöst. Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden lyophilisiert und der trockene
Rückstand kalt mit Äthanol extrahiert, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Eine
Ausbeute von 70 0/0 eines 60 bis 80,% reinen 4-Carboxy-n-butylpenicillins wurde
erreicht, das durch Eigenschaften, wie sie im Beispiel 1 beschrieben sind, gekennzeichnet
ist.
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Beispiel 3 Unter den gleichen Bedingungen, wie sie im Beispiel 2 benutzt
wurden, wurde eine Fermentation in
Gegenwart von Pimelinsäure an
Stelle von Adipinsäure durchgeführt. In dem Kulturmedium wurden biologische Aktivitäten
erreicht, die, ausgedrückt in Benzyl-Penicillin-Einheiten,1370 gegenüberKlebsiella
pneumoniae und 70 gegenüber Bacillus subtilis entsprechen.
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Das Penicilllin, das durch das gleiche Verfahren, wie im Bespiel 2
beschrieben ist, isoliert wurde, entspricht dem 5-Carboxy-n-amylpenicillin und ist
dadurch gekennzeichnet, daß es durch Säurehydrolisierung Pimellinsäure in stöchiometrischem
Ausmaß ergibt. Beispiel 4 Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 2 wurde
eine Fermentation in Gegenwart von »Korksäure« an Stelle von Adipinsäure durchgeführt.
Indem Ku#l#turmedium wurden biologische Aktivitäten erreicht, die, ausgedrückt in.
Benzyl-Penicillin-Einheiten, 1000 gegenüber Klebsiella pneumoniae und 54 gegenüber
Bacillus subtilis entsprechen. Das Penicillin, das durch das Verfahren nach dem
Beispiel isoliert wurde, entspricht dem 6-Carboxy-n-Hexylpenicillin und ist dadurch
gekennzeichnet, daß es durch Säurehydrolisierung »Korksäure« in stöchiometrischem
Verhältnis ergibt.
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Durch fast die gleichen Vorgänge, wie sie im Beispiel 2 beschrieben
sind, wurde die Fermentation. durchgeführt, indem man dem Medium eine der angegebenen
Verbindungen zusetzte, die in der nebenstehenden Tabelle angegeben sind; dort sind
auch die antibakteriellen Aktivitäten der Kulturfiltrate am Ende der Fennentation
angegeben.
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Wachstumsbedingungen: Das Kulturmedium (Laktose 3 %, Glukose 0,5 0/0,
Auszug aus gequollenem Getreide oder Mais 4 %, KaMumkarbonat 10/0) wird beimpft
mit 10 % einer 48 Stunden alten Mycel suspansion, die auf einem Maisaufschwemmnährboden
(8'%) mit Dextrinzusatz (61%) gewaschen ist, der mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert
von 5,4 eingestellt ist. Diese wurde beimpft mit einer Konidiensuspension, die auf
feuchter Gerste mit Sporulationslösung nach Whiffen und Savage gewachsen war. Eine
500-ml-Erlenmeyer-Schüttelflasche wird mit 60 ml des Kulturmediums bei 25° C auf
einem umlaufenden Schüttler behandelt, wobei die Belüftungsrate 35 ml Sauerstoff
auf 100 ml Flüssigkeit je Stunde beträgt.
| End- Aktivität) |
| konzen- gegenüber |
| B. subtilis |
| Zuvor zugesetzte Säure tration in 0/n J. pneumoniae |
| von freier (Benzyl- |
| Säure s) Pemcillm |
| Einheiten/ml) 2) |
| Oxalsäure (Kaliumsalz) 0,7 200 300 |
| Malonsäure (Natriumsalz) 0,6 175 340 |
| Bernsteinsäure |
| (Natriumsalz) 0,65 170 290 |
| Glutarsäure (Natriumsalz) 0,7 170 300 |
| Azelainsäure (Kaliumsalz) 1,0 110 1030 |
| Sebacinsäure(Kaliumsalz) 1,1 100 900 |
| 1,10-Decanedicarbonsäure |
| (Kaliumsalz) 1,25 100 650 |
| 1,12-Dodecanedicarbon- |
| säure (Kaliumsalz) 1,4 100 800 |
| 1) Mittelwerte von zwei Schüttelflaschen, die untereinander |
| gut übereinstimmende Ergebnisse ergaben. |
| 2) Die Angaben sind Benzyl Penicillin-Einheiten, die gleiche |
| Inhibitionszonen geben wie diejenigen durch unverdünnte |
| Brühe. |
| 3) Zugegeben in zwei Mengen von je 1 bis 4 ml (ent- |
| sprechend der Löslichkeit) bei 24 und 72 Stunden auf |
| eine wässerige Lösung des Natrium- oder Kaliumsalzes |
| in Konzentrationen, die die oben angegebenen End- |
| konzentrationswerte ergeben. |