AT333422B

AT333422B - Verfahren zur herstellung von 6-aminopenicillansauresulfoxid

Info

Publication number: AT333422B
Application number: AT663472A
Authority: AT
Original assignee: Biochemie Gmbh
Priority date: 1972-08-01
Filing date: 1972-08-01
Publication date: 1976-11-25
Also published as: ATA663472A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd.

Die bereits bekannten Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd beruhen auf der
Oxydation von 6-Aminopenicillansäure. So wird in der USA-Patentschrift Nr. 3, 544, 581 die Oxydation mit Natriumperjodat in Ausbeuten von 8% der Theorie durchgeführt. Das im J. Org. Chem. Bd. 37 [1972], S. 793 bis 795, beschriebene Verfahren verwendet als Oxydationsmittel Ozon, und in der deutschen Offenlegungs- schrift Nr. 2153600 oxydiert man die 6-Aminopenicillansäure mit m-Chlorperbenzoesäure.

Die Verfahren haben den Nachteil, dass sie von der 6-Aminopenicillansäure ausgehen, welche primär durch Spaltung von natürlichen Penicillinen hergestellt werden muss. Weiters ist das in der deutschen Offenlegungsschrift 2140114 beschriebene Verfahren in seiner technischen Durchführung nicht ungefährlich, da das zur Oxydation verwendete Ozon äusserst toxisch ist. Ein weiteres in der deutschen Offenlegungsschrift 2107650 bekannt gemachtes Verfahren geht zwar von einem Penicillin V-Sulfoxyd aus, man muss aber, um zum gewünschten 6-AminopenicillansäuresulfoxycI zu kommen, vier zum Teil sehr aufwendige chemische Reaktionsschritte durchführen. Abgesehen von dem dazu notwendigen technischen Aufwand, z. B. Temperaturen um-70 C, ist auch die Umweltfreundlichkeit dieser Methode keineswegs zufriedenstellend.

Es war daher die Notwendigkeit gegeben, ein einfaches, billiges und umweltfreundliches Verfahren für die Herstellung von 6-AminopenicillansäuresulfoxycI zu finden.

Alle diese Voraussetzungen erfüllt das erfindungsgemässe Verfahren durch enzymatische Spaltung von Penicillin-Sulfoxyden und ist daher den chemischen Verfahren überlegen.

Die enzymatische Spaltung der Penicilline zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure ist aus der franz.

Patentschrift Nr. 1. 310. 857 bekannt. In der österr. Patentschrift Nr. 297923 wird hiezu die Verwendung des Mikroorganismus Bovista plumbea beschrieben. Die DDR-Patentschrift Nr. 75 052 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 6- Aminopenicillansäure durch Spaltung von Penicillinen mit Escherichia coli.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass eine Reihe von Mikroorganismen zur Spaltung von Penicillinsulfoxyden geeignet sind.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Penicillinsulfoxyd der Formel
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worin R1 Benzyl, Butoxymethyl, p-Kresoxymethyl, Phenoxymethyl oder Phenylmercaptomethy1 bedeutet und R2 für Wasserstoff, Alkali oder Erdalkali steht, mit Hilfe von Bovista plumbea, Escherichia coli, P eurotus ostreatus oder Fusarium semitectum spaltet.

Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass es zu äusserst hohen Ausbeuten von zirka 90% der Theorie an 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd führt.

Die zur Spaltung der Penicillinsulfoxyde verwendeten Mikroorganismen können beim erfindungsgemässen Verfahren als lebende Submerskultur oder auch in Form ihrer enzymaktiven Aufbereitungen bzw. daraus gewonnener Enzympräparate eingesetzt werden. Hierunter gehören beispielsweise Suspensionen abgetöteter Zellen, Myceltrockenpulver, Autolysate oder auch stabilisierte Enzym-, Mycel- oder Bakterienkörper.

Die Umsetzung kann in für solche enzymatische Reaktionen an sich bekannter Weise durchgeführt werden.

Nach einer ersten Verfahrensvariante werden die zu kultivierenden Mikroorganismen in einer üblichen Nährlösung, die neben assimilierbarem Kohlenstoff noch Stickstoff, Schwefel, anorganisches Phosphat sowie Spurenelemente und gegebenenfalls Vitamine enthält, saprophytisch herangeführt. Die Züchtung wird zweckmässigerweise durchgeführt in einer Submerskultur unter Belüftung bei Temperaturen zwischen 20 und 320C undbei einembestimmten, zum Teil stammabhängigen pH-Wert, vorzugsweise PH 5,5 bis 8,5. Je nach Grösse der verwendeten Kulturtanks werden eine oder mehrere vegetative Vorstufen eingeschaltet.

Nach einer bestimmen Vorgärzeit, im allgemeinen nach Abschluss der Wachstumsphase, beispielsweise nach 48 h, wird das zu spaltende Penicillinsulfoxyd zugesetzt, worauf man solange weiterfermentiert, bis eine genügend grosse Menge des Substrats in das gewünschte 6-Aminopenlcillansäuresulfoxyd gespalten ist.

In manchen Fällen hat es sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, das bei der Züchtung erhaltene Zellmaterial von der Kulturflüssigkeit zu trennen und das Mycel in einem geeigneten Replacement-Medium zu resuspendieren. Hiezu wird der Fermentationsprozess in dem Zeitpunkt abgebrochen, in welchem der verwendete Mikroorganismus die höchste Enzymkonzentration erreicht hat, worauf man das Pilzmycel bzw. die

Zellen von der Kulturlösung trennt und den dabei erhaltenen Rückstand in einer nährstofffreien Losung bei- spielsweise in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung, mit dem zu spaltenden
Substrat in innigen Kontakt bringt. Zu diesem Zweck wird der Ansatz am besten geschüttelt oder gerührt, wobei die Spaltung durch das Enzym unter aeroben Bedingungen erfolgt.

Die Konzentration des eingesetzten Penicillinsulfoxyds, beispielsweise Kalium-Phenoxymethylpenicillin, welches kontinuierlich oder portions- weise während des Spaltprozesses zugesetzt werden kann, wird in Abhängigkeit von der Aktivität des Enzyms vorzugsweise so gewählt, dass die Einwirkungsdauer nur wenige Stunden, höchstens jedoch 2 Tage, beträgt.

Bei voller Ausnutzung der Enzymleistung wird hiedurch die Eigenzerstörung des eingesetzten Penicillinsulf- oxyds und des entstandenen 6-Aminopenicillansäuresulfoxyds möglichst gering gehalten.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die jeweiligen Mikroorganismen in Form eines angereicherten oder nicht angereicherten, physikalisch stabilisierten und/oder chemisch fixierten Enzyms oder Enzymsystems zu verwenden.

Für die physikalische Stabilisierung von Enzymen oder Enzymsystemen gibt es eine Reihe von Verfah- ren, welche je nach Art der zu stabilisierenden Produkte und der bei der Enzymreaktion anwesenden Substrate bzw. der entsprechenden Reaktionsprodukte mehr oder weniger zum Erfolg führen. Die Enzyme bzw.

Enzymsysteme können beispielsweise an inerte Träger adsorbiert werden, wie Kieselgel, poröses Glas, Aluminiumoxyd oder Bentonit. An Stelle inerter Träger lassen sich ferner natürliche oder künstliche Ionenaustauscher verwenden. Weiterhin können hiezu die jeweiligen Enzyme bzw. Enzymsysteme in semipermeable Membranen oder Gelpartikel eingeschlossen werden, deren Poren kleiner sind als die eingeschlossenen Enzymmoleküle. Als semipermeable Membranen eignen sich beispielsweise Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polyacrylharze oder Kollodium, und als Gelpartikel lassen sich beispielsweise Agar, Stärke, Polyacrylamidgel oder Siliciumdioxydgel verwenden.

Die chemische Fixierung der Enzyme bzw. Enzymsysteme erfolgt in der Regel durch Kovalentbindung an einen meist wasserunlöslichen Träger über funktionelle Gruppen im Enzymmolekül, die für dessen biologische Aktivität nicht essentiell sind. Der Träger kann dabei nach aussen entweder neutral, polyanionisch oder polykationisch sein. Geeignete Träger sind beispielsweise Bromacetylcellulose, mit Bromcyan akti- viertes Dextrangel, das Azidoderivat von Carboxymethylcellulose, eine 4, 6-Dichlor-s-triacinylce1lulose, diazotiertes Polyaminostyrol oder Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Äthylen. Zur chemischen Fixierung lassen sich ferner bifunktionelle Verbindungen verwenden, wie Glutaraldehyd, bis-Diazobenzidin, 3- Methoxydiphenylmethan-4, 4-diisocyanat oder Cyanurchlorid.

Hiezu kann man entweder einen Träger mit diesen Verbindungen zur Reaktion bringen und anschliessend das Enzym bzw. Enzymsystem über Kovalentbindung an dieses Reaktionsprodukt fixieren, oder man vernetzt die Enzymmoleküle intermolekular in Anwesenheit eines Trägers zu unlöslichen Aggregaten.

Die Verfahren zur Herstellung stabilisierter Enzyme oder Enzymsysteme sind an sich bekannt. Besonders vorteilhaft ist es, wenn man das Enzym bzw. Enzymsystem an einen inerten Träger adsorbiert oder in semipermeable Membranen bzw. Gelpartikel einschliesst, beispielsweise Hydroxylapatit, und diese Zubereitung dann mit einer bifunktionellen Verbindung, wie Glutaraldehyd, vernetzt.

Zur Herstellung der stabilisierten Enzyme bzw. Enzymsysteme können Zellwandfraktionen, Zytoplasmafraktionen, Autolysate, Plasmolysate, Trockenpulver, Enzymextrakte, Enzymanreicherungen, Rohenzyme oder Reinenzyme verwendet werden.

Durch die physikalische Stabilisierung und/oder die chemische Fixierung von Enzymen oder Enzymsystemen gelangt man zu stabilisierten Enzymkörpern, die wiederholt zur Spaltung angewendet werden können. Die Spaltung erfolgt dabei mit Vorteil in einer mit dem stabilisierten Enzymkörper gefüllten Säule, welche kontinuierlich mit einer Lösung der zu spaltenden Penicillinsulfoxyde beschickt wird. Spalttemperatur und Spaltkonzentration entsprechen dabei einer Spaltung im Kulturbrei.

Das erfindungsgemäss hergestellte 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd ist bekannt. Es stellt ein Heilmittel dar und wird insbesondere als antibakterielles Mittel verwendet. Das 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd ist ferner ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung entsprechender Penicillinsulfoxyde.

Beispiel l : Das Mycel einer 14 Tage bei 240C bebrüteten Stammkultur von Bovista plumbea (NRRL 3501) (Nährboden : Sabouraud-Dextroseagar, abgefüllt in 16 x 160 mm Eprouvetten zu je 5 ml, in Schräglage erstarren gelassen) wird mit 5 ml nachstehend angeführter Nährlösung abgeschwemmt, in einer sterilen Eprouvette mit einem Glasstab zerkleinert und in 20 ml nachstehend angeführter steriler Nährlö - sung, die in einen 100 ml Enghalskolben abgefüllt ist, übertragen.

Nährlösung :
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einer Glasröhre mittels eines gut eingepassten Schliffstempels unter sterilen Bedingungen zu breiige Kon- sistenz verrieben. Mit 10 ml dieser verriebenen Kultur wird eine zweite Submersstufe beimpft (500 ml Weit- hals-Erlenmeyerkolben, gefüllt mit 100 ml der oben beschriebenen Nährlösung). Man schüttelt auf einem
Rotationsschüttelwert mit 40 mm Hub und 260 Umdr/min 96 h bei 240C und homogenisiert die Kultur dann mit einem Tauchmixer unter sterilen Bedingungen bei 1000 bis 1500 Umdr/min 1 min lang.

Zu diesem Zweck wird der im Dampfautoklav während 30 min bei 1200C sterilisierte Dispergierkopf des Mixers in das unter sterilen Bedingungen geöffnete waagerecht gehaltene Kulturgefäss eingeführt. 10 mlhomogenisiertes Produkt aus dieser zweiten Submersstufe werden zur Beimpfung eines Kulturgefässes einer dritten Submersstufe ver- wendet (500 ml Weithals-Erlenmeyerkolben, der mit 100 ml der oben beschriebenen Nährlösung gefüllt ist).

Es wird unter den gleichen Bedingungen wie in der zweiten Submersstufe 96 h bei 240C geschüttelt und homo- genisiert. Zur Spaltung von Kalium- Phenoxymethylpenicillinsulfoxyd werden jeweils 500 ml Erlenmeyerkolben verwendet, die mit 45 ml der oben angegebenen sterilen Nährlösung gefüllt sind, wobei man mit je 10% der vorstehend beschriebenen dritten Submersstufe beimpft. Nach 96-stündigem Schütteln auf einer Rundschüttel- maschine mit 40 mm Hub und 260 Umdr/min sowie bei einer Temperatur von 240C werden 50 mg Kalium-
PhenoxymethylpenicillinsulfoxydinfesterFormpro ml zugefügt. In Abständen von 3 bis 6 h wird zur Bestim- mung des gebildeten 6-Aminopenicillansäuresulfoxyds jeweils ein kleiner Teil zur Prüfung entnommen.

Nach
Extraktion des Phenoxymethylpenicillinsulfoxyds wird das Verhältnis der Konzentration des Substrates zur Konzentration des Spaltproduktes jodometrisch bestimmt. Nach 8 h sind etwa 90% des eingesetzten Kalium- Phenoxymethylpenicillinsulfoxyds gespalten und liegen als 6-AminopenicillansäuresuIfoxyd vor.

Beispiel 2 : Mit einem nach Beispiel 1 erhaltenen Impfgut werden Submerstanks aus Nirosta-Stahl beimpft, die mit einer Einrichtung zum Rühren und Belüften ausgestattet und mit 5 1 der im Beispiel 1 be- schriebenen Nährlösung gefüllt sind. Man fermentiert 96 h, trennt das erhaltene Mycel von der Kulturlösung ab, wäscht es mit Wasser, suspendiert es in 21 0, 15m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7, 5 und setzt schliesslich 100000 E/ml Kalium-Phenoxymethylpenioillinsulfoxyd zu. Während der Spaltungwird der PH-Wert automatisch auf dem ursprünglichen pH-Wert gehalten. Nach 7-stündigem Rühren und Belüften sind etwa 88% des eingesetzten Kalium-Phenoxymethylpenicillinsulfoxyds gespalten.

Beispiel3 :40gPenicillinamidase-haltiges,durchAcetonbehandlunggetrocknetesMycelvonBovista plumbea (NRRL 3501), werden mit 50 ml einer 4% igen Losung von Kollodium in Diäthyläther versetzt und unter Abdampfen des Diäthyläthers und dauerndem Kneten zu einer plastischen Masse verformt. Kurz vor dem vollständigen Erhärten wird die Masse durch ein Nylonsieb mit einer lichten Maschenweite von 750 ja gedrückt. Man erhält ein formstabiles Mycel, das genügend mechanische Festigkeit für eine gleichmässige Säulenfüllung besitzt. 35 g des so überzogenen Mycels werden in 500 ml Phosphatpuffer nach S#rensen pH 7, 5 aufgeschlämmt und in eine mit einem Temperiermantel versehene Glassäule (2, 5 x 50 cm) gefüllt.

Die ge- packte Säule mit einer Füllhöhe von etwa 33 cm und einem Volumen von 162 ml wird bei Raumtemperatur mit Phosphatpuffer pH 7, 5 bei einer Raumgeschwindigkeit von 0, 5 etwa 4 bis 5 h gewaschen. Zur Spaltung wird eine Lösung von etwa 40 mg Kalium-Phenoxymethylpenicillinsulfoxyd pro ml in Phosphatpuffer pH 7, 5, der 40 g Na2 HPO 4. 12 H20 und 2,5 gKH2PO4 pro Liter enthält, über eine Pumpe kontinuierlich der auf 33'b temperierten Säule zugeführt. Die Raumgeschwindigkeit beträgt dabei 0, 3 bis 0, 35. Die bei einem Dauerversuch über 17 Tage erhaltenen Werte ergeben eine durchschnittliche Spaltleistung von 87%. Aus den fast farblosen Spaltlösungen kann 6-Aminopenicillansäuresulfoxydnach üblichen Verfahren in reiner Form isoliert werden.

Beispiel 4 : In fünf 2 1-Erlenmeyerkolben werden je 200 ml folgender, steriler Nährlösung gefüllt :
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<tb>
<tb> Com-steep-liquor1) <SEP> -Stickstoff <SEP> 0,05%
<tb> Bierhefeautolysat2) <SEP> -Stickstoff <SEP> 0,05%
<tb> Asparagin <SEP> 0,05%
<tb> Glukose <SEP> 1%
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 0,5%
<tb> Phenoxyessigsäure <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb>
Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 6,0 eingestellt.

1) Corn steep liquor = Maisquellwasser, d. i. eine verdünnte wässerige Lösung, die man durch 48-stun- diges Einweichen von Maiskörnern in warmer 0, 2% Schwefeldioxydlösung erhält.

2) Bierhefeautolysat = ein Eiweiss-Hydrolysat, das hergestellt wird, indem von Brauereien bezogene ab- gepresste Bierhefe mit über 2% Gesamt-N durch NaC1-Zusatz zunächst plasmolysiert wird. Sodann wird unter Zusatz von zirka 20% Leitungswasser und 0, 75% KSOg (Kaliummetabisulfit) mit Hilfe der he- feeigenen Proteasen 80 bis 90% des Gesamt-N in lösliche Form gebracht.

Zur Beimpfungwird jeder Kolben mit einer von Schrägagar gewonnenen Sporensuspension einer Fusarium semitectum-Kultur versetzt. Nach 96-stündigem Wachstum bei 28 C unter Schütteln auf einer Rundschüttelmaschine mit 50 mm Hub und 200 Umdr/min wird das Mycel über eine Glassinternutsche abgetrennt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 250 ml 0, 15m Phosphatpuffer PH 7, 5 resuspendiert. Sodann werden 8, 0 g Kalium-PhenoxymethylpenIcllUnsulfoxyd zugesetzt, und der Ansatz wird unter leichtem Rühren etwa 6 h auf 32 C gehalten. Der pH-Wert wird gegebenenfalls gelegentlich auf den Ausgangswert von 7, 5 korrigiert.

Am Ende der Spaltung sind dünnschichtchromatographisch neben dem gebildeten 6-Amino- penicillansäuresulfoxyd nur noch Spuren des Ausgangsmaterials nachzuweisen. Das Spaltprodukt wird in üblicher Weise isoliert.

Beispiel 5 : In fünf 2 1-Erlenmeyerkolben werden je 200 ml folgender steriler Nährlösung gefüllt :
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<tb>
<tb> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP> Stickstoff <SEP> (in <SEP> Form <SEP> von <SEP> filtriertem <SEP> Bierhefeautolysat)
<tb> 50, <SEP> 00 <SEP> g <SEP> Glukose <SEP>
<tb> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP> KH2P04 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 50 <SEP> g <SEP> MgS04. <SEP> 7H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 50 <SEP> g <SEP> Ca <SEP> (NO3) <SEP> 2-2H2 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> g <SEP> NaCl <SEP>
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> g <SEP> FeS04. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP>
<tb> - <SEP> mit <SEP> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml <SEP> aufgefüllt, <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 0.
<tb>

Zur Beimpfung verwendet man eine auf derselben Nährlösung herangeführte vegetative Vorstufe von Pleurotus ostreatus.

Die Einsaat beträgt 10%. Die Kultivierung des Spaltorganismus und die anschliessende enzymatische Hydrolyse des Substrats erfolgten wie im Beispiel 4 angegeben.

Beispiel 6 : 100ml einer Zellsuspension von Escherichia coli (A. T. C. C. 11105), die etwa 1010 Kei- me pro ml enthält, und die man über Nacht mit 0,2 Vol.-% Toluol bei 370C vorinkubierte, werden mit 4 g Natrium-BenzylpenicillinsuIfoxydversetzt. Die Suspension wird 4 h auf 37 C und einen pH-Wert von 7,5 gehalten. Sodann werden die Zellen abzentrifugiert, die klare Lösung wird zur Entfernung von Phenylessigsäure sowie nicht umgesetztem Benzylpenicillinsulfoxyd extrahiert und das entstandene 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd in üblicher Weise isoliert.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäuresulfoxyd, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Penicillinsulfoxyd der Formel
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worin R1 Benzyl, Butoxymethyl, p-Kresoxymethyl, Phenoxymethyl oder Pheny1mercaptomethyl bedeutet und R2 für Wasserstoff, Alkali oder Erdalkali steht, mit Hilfe von Bovista plumbea, Escherichia coli, Pleurotus ostreatus oder Fusarium semitectum spaltet.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Bovista plumbea, Escherichia coli, Pleurotus ostreatus oder Fusarium semitectumin Form eines angereicherten oder nicht angereicherten, physikalisch stabilisierten und/oder chemisch fixierten Enzyms oder Enzymsystems verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzym oder Enzymsysteme Zellwandfraktionen, Cytoplasmafraktionen, Autolysate, Plasmolysate, Trockenpulver, Enzymextrakte, Enzymanreicherungen, Rohenzyme oder Reinenzyme verwendet.