FI63580B - Foerfarande foer rening av foerorenad klavulansyra och foer frmstaellning av rena klavulanatsalter - Google Patents

Description

RSrTI γβΙ m\ kuulutusjulkaisu

JSj lBJ utlAggningsskrift wiDoU

C Patentti myönnetty 11 07 1933 *^Sv3 ^ ' Patent meddelat ^ ; (51) Kv.ik?/int,ci.3 C 07 D 498/0^ SUOM I —Fl N L AN D (21) Pmnttlhikmm — Putunt»«watailn| 760285 (22) H»k*mlip*hrt—AmMtnlnpdftg 06.02.76 ' ' (23) Alkupllv·—GlMghuodag 06.02.76 (41) Tullut JuIMmIoI — BJhrtt off«ttflg 08.08.76

Patentti- ja rakistarlhallitut /aj\ _______________,, ... *

Patent· och rf irtarutyraluan ^ Aiwekan pubUcarud 31.03*83 (32)(33)(31) Pyydetty MuoHcms—Begird prlorlMC 07.02.75 17.03.75 Englanti-England(GB) 5^09/75 11076/75 (71) Glaxo Laboratories Limited, Greenford, Middlesex, Englanti-England(GB) (72) Ian Dunlop Fleming, Chalfont St. Peter, Buckinghamshire, David Noble, Marlow, Buckinghamshire, Hazel Mary Noble, Marlow, Buckinghamshire, Wilfred Frank Wall, High Wycombe, Buckinghamshire, Englanti-England(GB) (7¾) Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä epäpuhtaan klavulaanihapon puhdistamiseksi ja puhtaiden klavulanaattisuolojen valmistamiseksi - Förfarande för rening av förorenad klavulansyra och för framställning av rena klavulanat- salter Tämä keksintö koskee epäpuhtaan klavulaanihapon ja sen suolojen puhdistusmenetelmää ja puhtaiden klavulanaattisuolojen valmistamista.

Streptomyces clavuligeruksen ja erityisesti kannan NRRL 3585 käymisen tiedetään muodostavan joukon antibioottisia aineita; GB-patenttijulkaisussa 1 315 177 on kuvattu Streptomyces clavuli-gerus-kannan NRRL 3585 viljely, kunnes oleellinen määrä kahta antibioottia, joita nimitetään antibiooteiksi A 16886 I ja A 16886 II, on muodostunut.

Myöhemmin on havaittu, että tämä organismi tuottaa vielä yhtä antibioottia, nimittäin (2R,5R,Z)-3-(2-hydroksietylideeni)-7-okso-4-oksa-l-atsabisyklo/[3,2, Q7**heptaani-2-karboksyylihappoa, joka on kaavan I mukainen: 2 63580

H

m /ch2oh 7 |1 3>= (I)

4—X B

H COOH

jota nimitetään klavulaanihapoksi.

Klavulaanihappo ja sen erilaiset suolat ja esterit ovat tunnettuja FI-patenttijulkaisusta 54 144, jossa on myös esitetty erilaisia puhdistusmenetelmiä. Tämän patenttijulkaisun mukaan klavulaanihappo puhdistetaan pääasiassa ioninvaihtajalta eluoimalla natriumkloridiliuoksella, jolloin klavulaanihappo saadaan natrium-suolana, jonka puhtausaste entsyymi-inhibitiokokeella määritettynä, so. Ig0-arvo, osoittaa tuotteen sisältävän vielä 10-15 % ei-toivot-tua isomeeriä, joka on inaktiivinen.

Keksinnön kohteena on menetelmä klavulaanihappoa tuottavan mikro-organismin fermentointiliemestä eristetyn tai totaalisyntee-sillä valmistetun kaavan I mukaisen

H

—:-/H OH

n x X-nV h 0 /*·':.

n COOH

epäpuhtaan klavulaanihapon ja/tai sen emäksen tai emäksisen ionin-vaihtohartsin kanssa muodostaman suolan puhdistamiseksi ja puhdistetun suolan muuttamiseksi toiseksi suolaksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että epäpuhtauksia sisältävä klavulaanihappo ja/tai sen emäksen tai emäksisen ioninvaihtohartsin kanssa muodostama suola saatetaan reagoimaan ionisoituneen litiumyhdisteen vesiliuoksen, edullisesti litiumkloridin vesiliuoksen kanssa litiumklavulanaattia sisältävän vesiliuoksen saamiseksi, josta litiumklavulanaatti saostetaan ja sakka erotetaan epäpuhtauksia sisältävästä vesiliuoksesta, jolloin saadaan puhdas litiumklavulanaatti, joka muutetaan toiseksi suolaksi, kuten kaliumklavulanaatiksi.

On yllättävää, että litiumsuolaa käyttäen saadaan puhtaampaa 3 63580 klavulaanihappoa ja sen suoloja kuin aikaisemmin FI-patentista 54 144 tunnetulla menetelmällä käyttäen natriumsuolaa.

Keksinnön mukaisesti käytettäviä suoloja ovat alkalimetalli-suolat, esim. natrium-, kalium- ja litiumsuolat; maa-alkalimetalli-suolat, esim. kalsium-, magnesium- ja bariumsuolat; ammoniumsuola; ja orgaanisten emästen muodostamat suolat, esimerkiksi primäärisistä, sekundäärisistä tai tertiäärisistä N-kvaternäärisistä amiineista johdetut, esim. mono-, di- tai trialkyyliammoniumsuolat kuten metyyliammonium- ja trietyyliammoniumsuolat ja heterosyklisten emästen muodostamat suolat kuten piperidiinisuolat.

Epäorgaanisten emästen muodostamat suolat ja useimmat orgaanisten emästen muodostamista suoloista ovat yleensä stabiilimpia vesiliuoksessa kuin vapaa klavulaanihappo. Suolat voivat esiintyä solvaattien muodossa, so. niissä voi olla vettä ja/tai muuta liuotinta kidevetenä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä on valmistettu klavulaani-hapon suoloja, joissa ei ole oleellisia epäpuhtauksia ja isomeerejä, ja joiden puhtausaste on 98 % tai enemmän. Esim. litiumklavu-linaattia ja useita muita klavulinaattisuoloja on valmistettu kiteisessä muodossa. Nämä suolat olivat oleellisesti puhtaita, kuten niiden molaariset ekstinktiokertoimet (vähintään 16,200, määritetty 259-1 nm alueella 0,1M natriumhydroksidin vesiliuoksessa). Molaarinen kiertokyky /M7^4vesiliuoksessa oli vähintään +137-5°.

Vapaalla hapolla suoloistaan valmistettuna oli ekstinktiokerroin, 1%

Elcm ®'·*·Μ natriumhYdroksidin vesiliuoksessa, 590 tai suurempi ja optinen ominaiskierto dimetyylisulfoksidissa, noin +54°.

Termi "puhtaus" tässä käytettynä tarkoittaa klavulaanihapon ja/tai sen suolan prosenttiosuutta ilmoitettuna läsnä olevan kokonais-kiinteän aineen muodossa laskettuna painon perusteella, mutta pois lukien sitoutuneet vesi tai muut liuottimet.

Klavulaanihapolla ja sen suoloilla on antibakteerinen vaikutus moniin gram-negatiivisiin ja gram-positiivisiin mikro-orga-nismeihin, joista esimerkkeinä mainittakoon Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shighella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis,

Proteus morganii, Serratia marcescens, Providencia-laji, Citrobacter koseri, Haemophilus influenzae ja Bacteroides-lajit.

Klavulaanihappoon ja sen suoloihin eivät vaikuta gram-posi- 4 63580 tiivisten ja gram-negatiivisten organismien muodostamat ^6-lakta-maasit.

Yleensä on edullista käyttää klavulaanihapon suoloja, joiden puhtausaste on vähintään 98 %, so. jotka sisältävät vähemmän kuin 2 % valmistettaessa muodostuvia epäpuhtauksia ja isomeerejä, muita kuin liuottimia, yhdessä laajaspektrisen y6-laktaamiantibiootin kanssa.

Klavulaanihapon ja sen suolojen puhdistus

Klavulaanihappo ja sen suolat voidaan eristää GB-patentti-julkaisun 1 315 177 mukaan Streptomyces clavuligerus kannan NRRL 3585 käymisliuoksesta poistamalla fraktiointimenettelyllä esim. proteiinit, entsyymit ja varsinkin muut /0-laktaamiantibiootit liuoksesta. Viime mainittujen poistaminen on tavallisilla tavoilla vaikeaa johtuen näiden /3-laktaamikarboksyylihappojen samanlaisesta käyttäytymisestä (esim. antibioottien A 16886 I ja II). Antibiootin eristäminen helpottuu suuresti muuttamalla klavulaanihappo tai sen suola litiumklavulanaatiksi, joka voidaan saostaa tavallisesti kiteisessä muodossa. Klavulanaatti-ionien suuresta affiniteetista litiumioneihin johtuen mukana saostuu vähän tai ei lainkaan epäpuhtauksia, erityisesti muita /3-laktaameja. Edelleen eristämällä suoraan suola, välttämällä klavulaanihapon muuttamista orgaanisiksi johdannaisiksi kuten estereiksi, jota seuraa uudelleen hapoksi muuttaminen esimerkiksi pelkistysmenettelyillä, voidaan välttää klavulaanihapon toisiintuminen isomeereiksi. On huomattu, että klavulaanihappoestereiden pelkistävä lohkaisu voi tuottaa jopa 15 % isomeeristä ainetta.

On huomattava, että käymisliuoksissa ja muissa liuoksissa suunnilleen neutraalissa pH:ssa klavulaanihappo ja yhden tai useamman kationin kanssa muodostetut suolat esiintyvät tasapainossa ja klavulaanihapon ja/tai sen suolojen eristäminen on pH:sta ja muista olosuhteista riippuvainen. Yleensä klavulaanihappo ja sen suolat ovat melko epästabiileja vesiliuoksissa pH-alueen 5,5-8 ulkopuolella ja seuraavassa kuvatuissa menetelmissä on tarpeellista pitää pH tällä alueella, edullisesti noin pH-arvossa 6,5, mikäli toisin ei ole ilmoitettu.

Keksinnön mukaisesti epäpuhtauksien poistamiseksi klavu-laanihaposta ja/tai sen suolasta mainittu happo ja/tai suola saatetaan reagoimaan ionisoituneen litiumyhdisteen vesiliuoksen kanssa, 5 63580 jolloin saadaan litiumklavulanaattia sisältävä vesiliuos, josta litiumklavulanaatti erotetaan.

Yleensä ionisoituva litiumyhdiste on suola. Litiumkloridi on edullinen, mutta sopivia ovat myös litiumbromidi, -jodidi tai -sulfaatti tai litiumkarboksylaatit, kuten asetaatti, propionaatti, formiaatti, bentsoaatti tai laktaatti. Suolan valintaan voivat vaikuttaa muut läsnäolevat aineet ja esimerkiksi, kun alunperin läsnäoleva klavulaanihapposuola on bariumsuola, voi olla edullista käyttää litiumsulfaattia, jolloin bariumsulfaatti alkaa saostua ennen litiumklavulanaatin saostumista.

Yleensä on edullista, että litiumklavulanaatin väkevyys ennen saostusta on vähintään 0,1 paino-%, edullisesti vähintään 2 paino-%, ja suuremmat väkevyydet, esimerkiksi 12 paino-%:iin tai jopa 20 paino-%:iin saakka antavat luonnollisesti suurempia prosentuaalisia saantoja.

Alunperin läsnäoleva puhdistettava klavulaanihapon suola voi olla esimerkiksi aikaiimetaliisuola (kuten natrium- tai kalium-suola tai jopa litiumsuola, jos tämä on läsnä pienempänä aineosana klavulaanihappoaineessa), maa-aikalimetallisuola (esim. kalsium-, barium- tai magnesiumsuola) tai orgaanisen emäksen muodostama suola, kuten yllä on kuvattu, tai suola, joka on muodostettu emäksisen ioninvaihtohartsin kanssa.

Huomiota, että litiumklavulanaatti saostuu helposti erittäin puhtaana, voidaan käyttää hyödyksi monella tavalla.

Litiumklavulanaatin ulossuolaus

Menetelmän erään sovellutuksen mukaan litiumklavulanaattia sisältävä vesiliuos voi myös sisältää riittävän määrän litiumsuolaa litiumklavulanaatin ulossuolaamiseksi nostamalla litiumionien väkevyyttä niin, että mainitussa lämpötilassa litiumklavulanaatin liukoisuustulo selvästi ylitetään. Koska klavulanaatti on niukka-liukoisempi alemmissa lämpötiloissa, on yleensä edullista alentaa liuoksen lämpötilaa saostumisen maksimoimiseksi, esimerkiksi noin välille 0-5°C.

Tällaisessa ulossuolauksessa litiumsuolan väkevyys litiumklavulanaatin sisältävässä vesiliuoksessa on edullisesti alueella 4M-10M, vaikka väkevyydet aina kyllästymiseen asti ovat käyttökelpoisia; erityisen edullinen alue on 5M-8M.

Kun ensimmäinen litiumklavulanaattierä on saatu talteen, 63580 saattaa olla edullista nostaa konsentraatiota ja ottaa talteen toinen erä.

Muiden klavulanaattien muuttaminen litiumklavulanaatiksi

Litiumklavulanaattia sisältävä liuos voidaan muodostaa yksinkertaisesti liuottamalla klavulaanihapon muu kuin litiumsuola, esimerkiksi natrium-, kalium-, magnesium-, barium-, kalsium- tai ammoniumsuola veteen ja lisäämällä liuokseen vesiliukoinen litium-suola kuten litiumkloridi. Bariumsuolan ollessa kysymyksessä suuren litiumkloridiväkevyyden käyttö voi johtaa bariumkloridin samanaikaiseen saostumiseen litiumklavulanaatin kanssa. Bariumkloridi voidaan kuitenkin poistaa helposti liuottamalla seos uudelleen veteen ja lisäämällä litiumsulfaattia bariumsulfaatin saostamiseksi, joka voidaan poistaa esimerkiksi suodattamalla, jolloin lisättäessä sen jälkeen litiumkloridia saostuu puhdas litiumklavulanaatti.

Litiumklavulanaatin muodostaminen ioninvaihtohartsin avulla

Keksinnön erittäin edullisessa sovellutuksessa alunperin käytetty klavulaanihapon suola on emäksisen ioninvaihtohartsin kanssa muodostettu suola, joka saatetaan kosketukseen litiumsuolan vesiliuoksen kanssa, jolloin saadaan litiumklavulanaatin vesiliuos. Hartsi on tavallisesti pylväässä, jonka päälle täytetään epäpuhdas klavulaanihappo ja/tai sen suola. Litiumklavulanaatin vesiliuos eluoidaan käyttäen vesiliukoisen litiumsuolan, esim. litiumkloridin, vesiliuosta. Hartsi pestään tavallisesti ennen eluointia esim. vedellä.

Hartsissa on yleensä amino- tai tertiäärisiä aminoryhmiä (heikosti emäksisiä) tai kvaternäärisiä ammoniumryhmiä (vahvasti emäksisiä). Hartsi voi olla esimerkiksi polystyreeni-, polyakryyli-, epoksipolyamiini-, fenolipolyamiini- tai verkkoutettu dekstraani-hartsi, ja se voi olla makroverkkomainen tai mikroverkkomainen.

Termiä "hartsi" käytetään tässä käsittämään myös selluloosa-johdannaiset ja yllä mainitut dekstraanijohdannaiset, jotka on johdettu luonnossa esiintyvistä polymeereistä. Tyypillisiin heikosti emäksisiin ioninvaihtohartseihin kuuluvat Amberlite IRA68 (mikroverkkomainen: polyakrylaatti verkkouttajana divinyylibentseeni: tertiäärisiä aminoryhmiä), Amberlite IRA93 (makroverkkomainen: polystyreeni verkkouttajana divinyylibentseeni: tertiäärisiä aminoryhmiä), joita myyvät Rohm & Haas (U.K.) Ltd. Tyypillisiä vahvasti emäksisiä ioninvaihtohartseja ovat Zerolit FF ja Zerolit FF(IP) (myy Zerolit Co. Ltd.).

7 63580

Emäksiset ioninvaihtohartsit ovat edullisesti suolan muodossa, kun ne saatetaan epäpuhtaan klavulaanihapon ja/tai suolan kanssa kosketukseen; anioni on edullisesti sama kuin eluenttina käytetyssä litiumsuolassa, sopivasti kloridi-ioni, mutta eri anione-ja voidaan käyttää ilman merkittäviä haittavaikutuksia.

Eluenttina käytetyn litiumsuolan vesiliuoksen väkevyys on edullisesti alueella 0,02M-8M. Alemmilla väkevyyksillä saadaan hyvin laimeita litiumklavulanaattiliuoksia, joista saostuminen vaikeutuu. Yleensä väkevyydet alueella 0,5-2,5M ovat edullisia.

Kun adsorbointi/eluointi yleensä suoritetaan siten, että halutulle tuotteelle suoritetaan kromatografiatyyppinen erottaminen muusta adsorboituneesta aineesta, on osoittautunut, että seuraava saostamisvaihe on niin tehokas erotettaessa litiumklavulanaattia häiritsevistä epäpuhtauksista, että on yleensä edullista käyttää suhteellisen suuria litiumsuolaväkevyyksiä eluentissa. Tämä antaa kapean klavulanaattijuovan pylvääseen, joka voidaan eluoida suhteellisen pieneen eluaattitilavuuteen siten mahdollistaen seuraavan saostamisen.

Eluaatti sisältää yleensä litiumsuolaa, esim. litiumkloridia väkevyydessä alueella 0,5-2,5M, kun taas, kuten yllä osoitettiin, ulossuolaus on tehokkaimmillaan väkevyyksissä alueella 5M-10M.

Siksi on edullista väkevöidä eluaatti esimerkiksi haihduttamalla tyhjössä, esim. noin 1/5-osaan. Litiumklavulanaatin liukoisuus noin 20°C:ssa eri väkevyyksissä litiumkloridin vesiliuoksissa on annettu seuraavassa taulukossa;

Taulukko I

LiCl-molaarisuus Litiumklavulanaatin liukoisuus ml/ml (suunnilleen) 2.5 23,5 3,75 10,2 5,0 4,1 6,25 1,8 7.5 0,8

Yllä mainittu väkevöintivaihe on litiumsuolalisäystä edullisempi, koska myös litiumklavulanaatti väkevöityy, ja emäliuos-tappiot siten vähenevät. Adsorboituneiden epäpuhtauksien eluoitu-misen vähentämiseksi hartsista voi olla edullista sisällyttää 8 63580 eluenttiin veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta väkevänä. Vaihtoehtoisesti, kun eluointi on suoritettu käyttämättä tällaista liuotinta, tämä voidaan lisätä eluaattiin eluoitujen epäpuhtauksien saostamiseksi ja sakka erottaa ennen jatkokäsittelyä. Liuotin voi olla esimerkiksi ketoni, kuten asetoni, alkoholi, kuten metanoli, etanoli, isopropyylialkoholi tai etyleeniglykoli, eetteri, kuten dioksaani tai tetrahydrofuraani tai substituoitu amidi, imidi tai sulfoksidiliuotin kuten dimetyyliformamidi tai dimetyylisulfoksidi. Yleensä alkoholit ovat edullisia tällaisina liuottimina, esim. etanoli tai isopropyylialkoholi. Tällaisten tarpeettomien epäpuhtauksien erottamiseksi alkoholin edullinen väkevyys eluentissa tai eluaatissa alkoholilisäyksen jälkeen on välillä 70-97 % tilavuudesta. Litiumklavulanaatin saostaminen käyttäen veteen sekoittuvaa liuotinta

On huomattava, että mikäli veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja litiumsuolojen väkevyys edellä kuvatussa menettelyssä on liian korkea, voi litiumklavulanaatti saostua liian aikaisin.

On itse asiassa mahdollista saostaa litiumklavulanaatti vesiliuoksesta käyttämällä hyvin suuria väkevyyksiä sellaisia liuottimia ottamalla täten käyttöön vaihtoehtoinen menettelytapa, joka käyttää hyväkseen yllä kuvattua litiumklavulanaatin valikoivan saostuksen etuja. Siten klavulaanihappo ja/tai sen suola voidaan saattaa yhteyteen litiumsuolan kanssa suhteellisen alhaisessa väkevyydessä joko pylväästä eluoimalla tai liuottamalla suolat yhteen liuokseen ja suorittamalla haluttu saostus liuosta väkevöimättä lisäämällä veteen sekoittuvaa liuotinta. Täten esimerkiksi alkoholiliuokset väkevyydeltään vähintään 90 %, edullisesti vähintään 95 %, ovat tehokkaita litiumklavulanaatin saostamiseksi. Saattaa olla tarpeellista korjata ensimmäinen litiumklavulanaattierä ja sitten väke-vöidä tyhjössä, esim. 1/4 tilavuuteen, toisen erän saamiseksi.

Klavulaanihapon suolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla Klavulaanihapon suola emäksisen ioninvaihtohartsin kanssa voidaan valmistaa klavulaanihappoa ja/tai sen suolaa sisältävästä käymisliuoksesta, josta kiinteä aine on poistettu esim. suodattamalla tai sentrifugoimalla. Tämä mahdollisuus on olemassa litium-saostuksella saatavan huomattavan puhdistusvaikutuksen ansiosta. Kuitenkin saattaa olla edullista käsitellä liuosta kiinteiden aineiden poistamisen jälkeen adsorboivalla hiilellä klavulaanihapon 9 63580 ja/tai sen suolan adsorboimiseksi; tämä auttaa muiden suolojen erottamista klavulanaatista ja välttää emäksisen ioninvaihtohartsin turhaa täyttymistä tarpeettomalla ionisoituvalla aineella.

Yleensä kirkas liuos voidaan johtaa hiilikerroksen läpi esim. pylväässä, edullisesti käyttäen juuri riittävää määrää hiiltä kaiken halutun klavulaanihapon ja/tai suolan adsorboimiseksi, tavallisesti hiiltä ja kirkasta liuosta käytetään tilavuussuhteessa noin 1:3-1:10. Tavallinen hiili on sopivaa eikä ole tarpeellista käyttää erittäin aktiivia ainetta. Hiili voidaan sitten puhdistaa käyttämällä veteen sekoittuvan liuottimen vesiliuosta, esim. keto-nia kuten metyylietyyliketoni, metyyli-isobutyyliketoni tai edullisesti asetoni, edullisesti väkevyydessä ketonia 30 % - 95 %, edullisesti 50-70 %. Ennen puhdistusta hiili edullisesti pestään esim. vedellä käymisliuosjätteiden poistamiseksi.

Toisessa muunnoksessa valmistetaan klavulaanihapon hartsi-suola, ja eluoidaan tämä jollain muulla kuin litiumsuolalla, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai kalsiumsuolalla esimerkiksi kloridilla tai asetaatilla, tai ammonium- tai pyridiinisuolalla, esim. ammoniumformiaatilla tai -asetaatilla tai pyridiinihydrokloridillä, jolloin saadaan vastaavan klavulanaatin vesiliuos; sitten voidaan lisätä ylimäärin vesiliukoista litiumsuolaa eluaattiin ja saostaa litiumklavulanaatti yllä kuvatulla tavalla.

Streptomyces clavuligeruksen käyminen

Klavulaanihapon valmistus käyttäen Streptomyces clavuligerusta tapahtuu tavallisella tavalla, esim. viljelemällä Streptomyces clavuligerusta sopivien hiili-, typpi- ja mineraalisuolalähteiden läsnäollessa. Viljely suoritetaan edullisesti aerobisesti submerssi-viljelynä.

Sopivia hiilen lähteitä ovat glukoosi, tärkkelys, glyseroli, melassit, dekstriini, laktoosi tai sakkaroosi.

Typen lähteistä voidaan mainita soijapapujauhot, tislaamo-jäteliemet, hiivauutteet, puuvillansiemenjauho, peptonit, kaseiini tai aminohapposeokset. Ureaa ja muita amideja voidaan myös käyttää. Viljelyliemessä käytettäviä mineraalisuoloja ovat yleisesti käytetyt suolat, jotka tuottavat natrium-, kalium-, ammonium-, rauta-, magnesium-, sinkki-, nikkeli-, koboltti-, mangaani-, kalsium-, fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi- ja karbonaatti-ioneja.

Vaahdonestoaine on yleensä mukana säätelemässä liikaa vaah- 10 63580 toamista ja sitä voidaan lisätä tarvittavin väliajoin.

Streptomyces clavuligeruksen viljely suoritetaan yleensä lämpötiloissa 20-37°C, edullisesti 25-30°C, sekoittaen, esim. ravis-tusviljelmänä ja ilmattaen.

Mikro-organismin Streptomyces clavuligerus edullinen kanta klavulaanihapon valmistuksessa on NRRL 3585 ja sen mutantit.

Litiumklavulanaatin ja muiden klavulanaattien muodostaminen uuttamalla klavulaanihapon fenolipitoista liuosta Erään menetelmävaihtoehdon mukaan litiumklavulanaattia sisältävä vesiliuos saadaan uuttamalla klavulaanihapon fenolipitoista liuosta litiumhydroksidin vesiliuoksella, jonka jälkeen litium-klavulanaatti saadaan saostumaan edellä kuvatulla tavalla, edullisesti jäljelle jääneen fenolipitoisen liuottimen poiston jälkeen uuttamalla vesiliuos veteen sekoittumattomalla liuottimena kuten eetterillä, kloroformilla tai hiilitetrakloridilla.

Yleensä fenolipitoisen liuottimen uuttaminen suoritetaan edullisesti siten, että vesifaasin pH on noin 6,5.

Fenolipitoinen uute voidaan valmistaa uuttamalla vesipitoinen eluaatti edellä kuvatusta hiili- tai hartsiadsorbaatista fenolipitoisella liuottimena eluaatin väkevöimisen jälkeen ja haluttaessa orgaanisten haitallisten epäpuhtauksien saostamisen jälkeen, joka suoritetaan lisäämällä yhtä tai useampaa veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta ja/tai poistamalla sellaiset epäpuhtaudet uuttamalla veteen sekoittumattomalla liuottimena.

Tämän tyyppisessä menettelyssä joko hiilestä tai hartsista saatu eluaatti väkevöidään edullisesti haihduttamalla alennetussa paineessa. Yleensä käsittely puhdistuksen aikana suoritetaan edullisesti pH-alueella 6,0-7,0, esim. noin 6,5:ssä, hajoamisen minimoimiseksi. Sitten eluaatti voidaan edelleen puhdistaa saostamalla haitalliset aineet veteen sekoittuvalla ketonilla tai asetonilla, käyttäen edullisesti ketonia 50-90 tilavuus-%, edullisesti noin 85 %. pH on tällöin edullisesti noin 6,5 ja mikäli vesiliuos jo sisältää veteen sekoittuvaa ketonia, tämä poistetaan edullisesti pH-mittauk-sen mahdollistamiseksi. pH voidaan säätää emästä lisäämällä, esim. alkalimetallihydroksidia, kuten natriumhydroksidia lisäämällä.

Lisäpuhdistus voidaan suorittaa liuottimena uuttamisvai-heessa ei-toivottujen epäpuhtauksien poistamiseksi esim. väkevöimällä ja säätämällä ketonisaostuksesta saadun suodoksen pH noin 4 tään 11 63580 lisäämällä mineraalihappoa, kuten rikkihappoa tai kloorivetyhappoa, ja uuttamalla n-butanolilla tai suurimolekyylipainoisella nestemäisellä alkoholilla. Sopivasti voidaan käyttää 1-8 tilavuutta liuotinta.

Tämän uuttamisen jälkeen vesifaasi väkevöidään edullisesti noin pH 6,5;ssä, ja se voidaan puhdistaa edelleen uuttamalla haluttu antibiootti fenolipitoiseen liuottimeen, esim. fenoliin itseensä tai kresoliin, edullisesti sen jälkeen, kun pH on laskettu noin 4:ään mineraalihapolla. Fenolipitoinen liuotin sisältää edullisesti emästä, kuten Ν,Ν-dimetyylianiliinia, ja veteen sekoittumatonta liuotinta, kuten kloroformia tai hiilitetrakloridia. Uuttaminen suoritetaan edullisesti useita kertoja käyttäen 2/3 liuotintilavuutta kutakin uuttamista varten. Uutteet voidaan sitten yhdistää ja vettä lisätä noin 1/15 liuotintilavuudesta erillisen faasin muodostamiseksi. Sitten antibiootti voidaan uuttaa takaisin lisäämällä vesifaasiin emästä, edullisesti aikaiimetä11ihydroksidia, esim. litiumhydroksi-dia, tai maa-alkalimetallihydroksidia, esim. barium- tai kalsium-hydroksidia, noin pH-arvoon 6,5. Vesikerros ja fenolikerros erotetaan ja takaisinuuttamismenettely toistetaan edullisesti yhdistäen vesiuutteet. Sen jälkeen, kun kaikki sakka on erotettu, esim. barium-sulfaatti, kaikki jäljelle jäänyt fenoliliuotin voidaan poistaa vesiliuoksesta uuttamalla veteen sekoittumattomalla liuottimena kuten eetterillä, kloroformilla tai hiilitetrakloridilla, ja anti-bioottisuolan talteen ottamiseksi vesifaasi voidaan pakastekuivata tai suihkukuivata pHzssa 6,5.

Lisäpuhdistus voidaan suorittaa tavallisella tavalla, esim. kromatografisesti käyttäen erityisesti "Sephadexia" (Pharmacia Ltd.). Täten antibiootti, joka tässä vaiheessa on yleensä suolan muodossa, esim. bariumsuolana, voidaan lisätä "Sephadex"-pylvääseen (esim. "Sephadex" G 15) ja uuttaa vedellä, jolloin antibioottisesti aktiiviset fraktiot yhdistetään seuraavaa suolan talteenottomenettelyä varten, joka tapahtuu esim. pakastekuivaamalla.

Litiumklavulanaatin muuttaminen klavulaanihapoksi ja muiksi suoloiksi

Edellä mainitulla menettelyllä valmistettu puhdistettu litium-klavulanaatti voidaan muuttaa muiksi suoloiksi ioninvaihtomenette-lyillä käyttäen esim. ioninvaihtohartsia. Siten esimerkiksi litium-suolan vesiliuos voidaan lisätä kationinvaihtohartsiin (esim.''Bio Rad" AG50X8); (myy Bio Rad Laboratories, Richmond California) kationi- 12 63580 muodossa, jolloin kationi on se klavulaanihapon suola, jota halutaan, esim. natrium tai kalium, jota seuraa eluointi vedellä. Vapaa klavu-laanihappo voidaan muodostaa esim. tekemällä esim. natriumkloridilla tai ammoniumsulfaatilla kyllästetty litiumsuolan vesiliuos, jossa on suuri ionivahvuus, happamaksi noin pH:hon 2,6, veteen sekoittu-mattoman klavulaanihapon liuottimen läsnäollessa, esim. esteriliuotin kuten etyyliasetaatti. Tarvittaessa vesifaasi voidaan edelleen uuttaa liuottimena ja uutteet yhdistää. Yleensä mikä tahansa happo, jolla saadaan riittävän alhainen pH, on sopiva happamaksi tekemiseen, esim. mineraalihappo kuten kloorivetyhappo. Liuotin voidaan sitten poistaa vapaan hapon saamiseksi, yleensä öljyn muodossa. Vapaan hapon liuos veteen sekoittumattomassa liuottimessa voidaan käyttää laajan suolasarjan valmistamiseksi uuttamalla sopivan emäksen vesi-liuoksella, ja erottamalla suola siitä. Saattaa olla tarpeellista suodattaa kiinteä aine vesifaasista ennen kuin suolan eristämiseen ryhdytään. Koska vapaa happo on suhteellisen pysymätön, se olisi edullisesti käytettävä, esimerkiksi suolojen tai muiden johdannaisten valmistamiseksi, niin pian kuin mahdollista muodostumisensa jälkeen.

Seuraavissa valmistuksissa ja esimerkeissä klavulaanihappo-pitoisuudet mitattiin 1) UV-spektroskooppisesti, 2) biologisesti.

1. UV-spektroskooppinen määritys

Klavulaanihapon ja sen suolojen vesiliuoksilla on hyvin matala UV-absorptio 230 nm yläpuolella ja esimerkiksi molaarinen ekstinktiokerroin 280 nm:ssä on noin 60. Emäkseen liuotettuna kuitenkin voimakas UV-absorptio kehittyy nopeasti kohdalla Xmax259-1, ja tätä voidaan käyttää klavulaanihapon ja/tai sen suolojen määrittämiseen. Koetta varten kiinteä aine punnitaan tarkasti ja liuotetaan laimeaan natriumhydroksidiin (0,1M), jolloin saadaan tunnettu tilavuus liuosta, joka vastaa noin 0,01 mg/ml klavulaanihappoa. Liuoksen optinen tiheys absorptiomaksimikohdalla tai noin 259 nm mitataan sopivalla spektrofotometrillä; kiinteän aineen puhtaus voidaan laskea edellyttäen, että klavulaanihapon 6= 16,700. Molaari-set ekstinktiokertoimet voidaan laskea E^-arvoista, se on ekstinktio-kertoimet 1 % liuoksella 1 cm kyvetissä. Käymisnesteet, joista orgaaniset liuottimet tarvittaessa poistetaan, laimennetaan laimealla natriumhydroksidilla, jolloin saadaan sama emäksen ja klavulaanihapon väkevyys kuin edellä olevassa klavulaanihapon määrityksessä. Raakojen kiinteiden aineiden ja käymisnesteiden arvot korjattiin 13 63580 epäpuhtauksien absorptiot huomioiden käyttäen samanväkevyisiä liuoksia vedessä.

2, Biologinen aktiivisuus Määritettiin vertaamalla tunnetun klavulaanihappopitoisuuden omaavia liuoksia agar-petrimaljakokeessa Acinetobacter-lajiin seuraten oleellisesti Lees ja Tootill-menetelmää (Lees, K.A. & Tootill, J.P.R., Analyst, 1955, 80 (947), 95-110; ibid 110-123; 80 (952), 531-535).

Kaikki alustat steriloitiin höyryssä ennen käyttämistä.

Valmistus 1 a) Ymppiviljelmän valmistus

Steriiliin tislattuun veteen (10 ml) suspendoitiin 14 päivää vanha Streptomyces clavuligerus kannan NRRL 3585 vinoviljelmä mallas/hiivauuteagarilla.

Osalla (1,5 ml) suspensiota ympättiin 2 litran pullossa oleva 150 ml viljelyliemi, jolla oli seuraava koostumus: % (paino/tilavuus)

Sakkaroosi 2,0 tislaamojäteliemi 1,5 hiivauute 0,5 K2HP04 0,02 tryptoni 0,5 glyseroli 1,0 vesi ad 100,0 Tätä pulloa inkuboitiin 26°C:ssa 48 tunnin ajan 220 kierr./min. pyörösekoittimessa, jonka heilahduksen pituus oli 5 cm. 150 ml tätä viljelmää käytettiin ymppinä alustaan, jolla oli seuraava koostumus: % (paino/tilavuus)

Soijapapujauho 2,1 tislaamojäteliemi 0,52 kaseiinihydrolysaatti 0,52

FeS04*7H20 0,01 liukoinen tärkkelys 4,7 glukoosi 0,78 vesi ad 100,00 5 litran käymisastiassa, jota ilmastettiin (0,75 tilavuus/tilavuus/ min) ja pidettiin 28°C:ssa sekoittaen (750 kierr./min) 20 tunnin ajan.

14 63580 b) Käyminen 7,5 1:11a 20 tunnin viljelmää (a) istutettiin 150 1 alustaa, jolla oli seuraava koostumus; % (paino/tilavuus)

Liukoinen tärkkelys 4,7 soijapapujauho 2,1 tislaamojäteliemi 0,52 kaseiinihydrolysaatti 0,52 glukoosi 0,78

FeS04*7H20 0,01 polyglykoli (P.2000: Dow Chemical Co.) 0,05 vesi ad 100,00 220 litran astiassa ja käytettiin 90 tunnin ajan 28°C:ssa ilmastaen ja sekoittaen (350 kierr./min.).

Bariumsuolan valmistus

Edellä kuvatulla tavalla saatu käymisliuos puhdistettiin seuraavasti: käymisliuos (135 1) pH:ssa 6,25 kirkastettiin sentri-fugissa, jolloin saatiin neste (112 1) pH:ssa 6,3. Tämä johdettiin Pittsburgh CAL hiiltä (25 1) sisältävän pylvään läpi ja pylväs pestiin vedellä (50 1). Asetonia (10 1) kaadettiin varovaisesti massan pinnalle ja eluointi aloitettiin. Sitten eluoitiin 90-%:isella asetonin vesiliuoksella (60 1). Eluaatti kerättiin fraktioina (1 x 10 1, 2 x 25 1).

Kukin fraktio tislattiin alennetussa paineessa asetonin poistamiseksi. Jäljelle jääneen vesiliuoksen pH säädettiin 6,0:ksi IM natriumhydroksidilla. Sitten fraktiot yhdistettiin ja tislattiin edelleen 2,9 l:ksi, siirrettiin sopivaan astiaan ja täytettiin tislatulla vedellä 3,3 l:ksi. Asetonia (17 1) ja Celiteä (500 g) lisättiin ja massa pestiin 85-%:isella asetonin vesiliuoksella (4 1).

Yhdistetyt suodos ja pesuliuokset konsentroitiin alennetussa paineessa 4,0 l:ksi. pH säädettiin 5,65:stä 6,0:ksi IM natriumhydroksidilla ja tislausta jatkettiin, kunnes tilavuus oli 1,0 1.

Saatu väkevöite tehtiin happameksi pH 4,0:aan 20 % rikkihapolla ja pestiin butan-l-olilla (4 x 750 ml, 1 x 500 ml). Liuennut butan-l-oli tislattiin vesifaasista tyhjössä.

Kun väkevöite oli säädetty pH-arvoon 4,2 20 % rikkihapolla, se uutettiin 3 kertaa nestemäisen fenolin (farmakopealaatu, 265 ml), hiilitetrakloridin (75 ml), ja N,N-dimetyylianiliinin (25 ml) seok- 15 63580 sella. Jokaisen uutteen pH säädettiin 4,2:ksi. Yhdistetyt liuotin-uutteet sekoitettiin veden kanssa (250 ml) ja pH säädettiin 6,5:ksi bariumhydroksidin vesiliuoksella (70 ml), Kun faasit oli erotettu, liuotin uutettiin uudelleen vedellä (200 ml) ja kyllästettiin bariumhydroksidin vesiliuoksella (7 ml).

Yhdistetyt vesifaasit pestiin dietyylieetterillä (3 x 200 ml), haihdutettiin tyhjössä 200 ml:ksi ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin 29,4 g vaaleanruskeaa kiinteää ainetta. = 152. Puhtausaste alle 25 %.

Valmistus 2

Klavulaanihappoa sisältävän hiilieluaatin valmistus a) Ymppiviljelmän valmistus

Steriiliä tislattua vettä (10 ml) lisättiin 14 päivän Streptomyces clavuligerus NRRL 3585:n mallas/hiivauuteagar-viljel-mään ja tehtiin suspensio. 2,0 ml tätä suspensiota käytettiin seu-raavan viljelyväliaineen (150 ml) ymppinä: % (paino/tilavuus)

Sakkaroosi 2,0 tislattu alkoholi 1,5 hiivauute 0,5 K2HP04 0,02 tryptoni 0,5 glyseroli 1,0 vesi ad 100,0

Pulloa inkuboitiin 26°C:ssa 48 tunnin ajan pyörösekoittimessa (5 cm liike; 220 kierr./min.).

Kuuden tällaisen pullon sisältö (kaikkiaan 900 ml) käytettiin istutettavaksi kuusi 5 litran käyraisastiaa, joista kukin sisälsi 4,5 1 seuraavaa viljelyväliainetta: % (paino/tilavuus)

Soijajauho 2,1 tislattu alkoholi 0,52 kaseiinihydrolysaatti 0,52 rauta (II)sulfaattiheptahydraatti 0,01 liukoinen tärkkelys 4,7 glukoosi 0,78 silikonivaahdonestoemulsio 0,05 (til./til.) ja vettä ad 100 % 16 63580 Käymisastioita ilmastettiin (0,67 til./til./min.) ja sekoitettiin (750 kierr./min; kaksi melaa 7,5 cm halkaisija) 20 tunnin ajan 28°C:ssa.

b) Käyminen

Saadulla viljelmällä (25 1) ympättiin seuraavaa viljelyväli-ainetta: % (paino/tilavuus)

Soijajauho 3,0 rauta(II)sulfaattiheptahydraatti 0,01 k2hpo4 0,01 liukoinen tärkkelys 4,7 silikonivaahdonestoemulsio 0,05 (til./til.) ja vettä ad 100 % 700 1 ruostumattomassa teräsastiassa, jota sekoitettiin 350 kierr./min. (25 cm halkaisijaltaan mela ja neljä 7,5 cm lapaa) ja ilmastettiin 0,56 til./til./min. Käyttäminen suoritettiin 28°C:ssa 92 tunnin aikana ja vaahdonestäjää lisättiin tarvittaessa. Käymisen aikana pH pidettiin 6,5:ssä.

c) Eristäminen

Koko liuos vaiheesta (b) säädettiin pH-arvoon 5,45 väkevällä rikkihapolla ja suodatettiin pyörivässä rumpusuodattimessa, jossa oli selluloosapinnoite. Suodos (430 1), joka sisälsi antibiootin, adsorboitiin hiileen pylväissä (Pittsburgh CAL; 135 1). Hiili pestiin vedellä (90 1) suodatetun nesteen korvaamiseksi ja antibiootti eluoitiin asetonin vesiliuoksella (60 % til./til.; 180 1).

Esimerkki 1

Litiumsuolan valmistus kalsiumsuolasta i) Kalsiumsuolan valmistus a) Edellä valmistettua epäpuhdasta bariumsuolaa (8,83 g) lisättiin 50 ml:aan kyllästettyä (NH^^SO^ vesiliuosta.Etyyliasetaattia (50 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin. pH-mittari asetettiin seokseen ja pH säädettiin 6,8;sta 2,6:een noin 15 ml:11a IM H2S04. Vesiliuos erotettiin etyyliasetaatista ja sekoitettiin uudelleen tuoreeseen etyyliasetaattiannokseen (50 ml). Nämä kaksi etyyliasetaattiuutetta yhdistettiin, tislattua vettä (100 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin. Noin 40 ml kyllästettyä kalsium-hydroksidiliuosta lisättiin seoksen pH:n säätämiseksi 6,6:ksi. Vesiliuos erotettiin, suodatettiin suodatinmassan läpi ja pakaste- 17 63580 kuivattiin, jolloin saatiin 1,44 g kiinteää kalsiumsuolaa.

b) Kohdan (a) kiinteä aine liuotettiin 15 ml:aan tislattua vettä, suodatettiin Milliporesuodattimen läpi ja siirrettiin Sephadex G15 sisältävään pylvääseen, joka oli pakattu veden kanssa (Sephadex-kerros 15 x 2,5 cm). Eluointi suoritettiin tislatulla vedellä ja kerättiin 20 ml fraktioita. Fraktiot tutkittiin ohutlevy-kromatografisesti (selluloosa, Eastman Kodak 6065 levyt; liuotin asetonitriili-vesi, 7:3) ja sitten ravintoagarilla, joka sisälsi Staphylococcus aureusta. Fraktiot 33-37 yhdistettiin ja pakaste-kuivattiin, jolloin saatiin 490 mg. Kiinteä aine kuivattiin P20g:llä tyhjössä 60 tunnin ajan. Vaiheessa (b) saadulla kalsiumsuolalla oli seuraavat ominaisuudet; pKa;

Suola potentiometrisesti titrattaessa todettiin vastaavan hapon pKa-arvon olevan noin 2,4.

Optinen kierto; /oC7D 22°C;ssa, +44,9° (väkevyys, 0,287 g/100 ml vettä).

UV-spektri; Näytteellä (0,00148 g), joka oli liuotettu 100 ml:aan 0,1M NaOH, oli absorptiomaksimi ( \ ) kohdalla 258 nm E?"-arvon ollessa

luclX X

noin 550.

IR-spektri; Näytteen infrapunaspektrissä nujolissa oli absorptiomaksimit aaltoluvuilla (cm ^): 3300 s,br 2330 w 1788 s 1692 m 1604 s 1404 s 1305 s 1190 m 1118 m 1082 m 1060 m 1042 m 1012 m 992 m 968 m 892 m 848 w 790 w 740 m 654 w (s = voimakas, m = keskinkertainen, br = leveä ja w = heikko intensiteetti).

Koko spektri on esillä liitteenä olevien piirrosten kuviossa 3.

NMR-spektri: Näyteliuoksen protoni-NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli piikit (Q^-arvot) kohdilla noin 4,31, 5,10, 5,85, 6,46, 6,91.

Ohutlevykromatografia;

Veteen liuotetut näytteet pantiin lähtöviivalle joko Eastman-Kodak selluloosa TL-levyille (muovitaustainen, EK 6065) tai Eastman- 18 63580

Kodak pii TL-levyille (muovitaustainen, EK 6060) . Levyt kehitettiin liuottimena huoneen lämpötilassa, ilmakuivattiin ja tutkittiin päällystämällä ravintoagarilla, joka sisälsi Staphylococcus aureusta. Rf-arvot, jotka laskettiin ehkäistyn bakteerikasvun etäisyytenä kunkin vyöhykkeen alkupisteestä keskipisteeseen jaettuna alkupisteen etäisyydellä liuotinrintamasta, esitetään seuraavassa viidelle systeemille.

_Liuotin_ Kantaja_Rf_ propan-l-oli:vesi (7:3) selluloosa 0,60 butan-l-oli:etikkahappo:vesi (3:1:1) " 0,64 asetonitriili:vesi (7:3) " 0,68 asetonitriili:vesi:propan-2-oli (1:1:1) " 0,87 butan-l-oli:etikkahappo:vesi (3:1:1) silikageeli 0,63

Paperi-ionoforeesi: Näytteiden ionoforeesi suoritettiin Whatman 541 paperilla 1 tunnin ajan käyttämällä 400 V 20 cm:lie.

Aktiivisuus, joka todettiin päällystämällä ilmakuivattu paperi ravintoagarilla, joka sisälsi Staphylococcus aureusta, sai aikaan syaanokobalamiiniin verrattuna 4,5 cm liikkeen kohti anodia pH:ssa 4,8 (0,1M asetaatti), pH:ssa 6,9 (0,01M fosfaatti) ja pH:ssa 9,5 (0,01M pyrofosfaatti).

ii) Litiumsuolan valmistus

Kohdan (i) (b) mukaan valmistettua kalsiumsuolaa (1 g; UV-kokeen mukaan puhdasta) liuotettiin 10 ml:aan vettä ja liuokseen lisättiin 10 ml kyllästettyä litiumkloridin vesiliuosta. Kiteytyminen tapahtui raaputtamatta ja ilman kideytimien lisäämistä. Kun seos oli jäähdytetty 0°:een, kiteet suodatettiin, pestiin 5 ml:11a etanolia, 5 ml:11a asetonia ja 2 x 5 ml:11a dietyylieetteriä.

Kiteet kuivattiin alennetussa paineessa (0,1 mm Hg) silikageelillä 2 tunnin ajan, jolloin saatiin 495,5 mg kiinteää litiumsuolaa.

Tällä suolalla oli seuraavat ominaisuudet:

Alkuaineanalyysi:

Saatu (keskiarvot on annettu suluissa): C 45,5, 45,8 (45,65); H, 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1); Li 3,2 %.

Rikkiä ei todettu menetelmällä N.D. Cheronis & J.B. Entrikin (1947) Semimicro Qualitative Analysis, s. 93, Crowell, New York.

C8H8N05Li.1/4 H20 vaatii C, 45,84; H, 4,06; N, 6,68; Li, 3,31 %.

Yllä mainittu Li analyysiarvo, (3,2 %), määritettiin atomiabsorptio- 19 63580 spektrofotometrisesti. Sulfaattituhkaa oli 26/8 %, josta laskettuna Li2S0^ vastaa 3,38 % litiumia. pKa:

Suolan potentiometrisellä titrauksella todettiin vastaavan hapon pKa-arvon olevan noin 2,3.

Optinen kierto: 0,145 % paino/tilavuus vesiliuoksen arvo 24°C:ssa oli +66,0°.

Ultravioletti spektri: 0,00091 % liuoksen 0,1M natriumhydroksidissa uv-absorptio-spektrissä oli absorptiomaksimi (λ max) kohdalla 258 nm E^-arvon ollessa 788.

Infrapunaspektri:

Nujolissa ajetulla infrapunaspektrillä oli absorptiopiikit (cm noin kohdilla: 3420 (m) 1402 (s) 1200 (w) 1026 (m) 880 (w) 3012 (w) 1338 (m) 1129 (m) 992 (m) 850 (w) 1765 (s) 1325 (s) 1101 (m) 976 (m) 734 (m) 1683 (s) 1300 (m) 1062 (m) 950 (s) 708 (w) 1618 (s) 1224 (w) 1048 (s) 900 (m)

Koko spektri näkyy liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1. NMR-spektri:

Litiumsuolan 100 MHz protoni-NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli piikit ( arvot sekä piikkien lukumäärät ja kytkentävakiot (Hz) suluissa), joiden keskipisteet olivat noin 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd,3 ja 17) ja 6,89 (d,17).

(s = singletti, d = dubletti, dd = kaksoisdubletti, t = tripletti ja m = raultipletti).

iii) Litiumsuolan uudelleen kiteytys

Kohdassa (ii) valmistettua litiumsuolaa (0,1 g) liuotettiin veteen (1,0 ml) ja liuos laimennettiin varovaisesti isopropanolilla (19 ml). Tuote kiteytyi hitaasti 0°:ssa ja kerättiin kahtena saantona keittämällä alennetussa paineessa 5 ml:ksi toista saantoa varten. Litiumsuolakiteet kuivattiin silikageelillä tyhjössä 3 päivän ajan.

Saanto 1.

20,0 mg, Λ 259 nm. E?" * 814 natriumhydroksidiliuoksessa (0,1M) luaX 1 10 ^ig/ml.

20 63580

Alkuaineanalyysissä saatiin; C = 46/2, 46,0; H = 4,10, 3,85; N = 6,8, 6,7 %,

CgH8N05Li.l/4 H20 vaatii C = 45,84; H = 4,06; N = 6,68 %.

Saanto 2.

67,0 mg ^max 259 nm. = 800 natriumhydroksidissa (0,1N) 10yjg/ml.

Alkuaineanalyysissä saatiin C = 46,15, 46,5; H = 3,9, 4,0; N = 6,65, 6,5. Litium 3,4 % (sulfaattituhka). CgHgNOgLi 1/4 H20 vaatii: C = 45,84; H = 4,06; N = 6,68; Li = 3,31 %.

Esimerkki 2

Litiumsuolan valmistus natriumsuolasta

Valmistuksessa 1 saatua bariumsuolaa (30 g; E^ 274) liuotettiin veteen (40 ml), ja liuokseen lisättiin kyllästettyä ammonium-sulfaattiliuosta (300 ml). Liuos säädettiin pH-arvoon 2,4 rikkihapolla (20 %, 23,0 ml) ja uutettiin sitten etyyliasetaatilla (2 x 300 ml). Vettä (200 ml) lisättiin yhdistettyihin uutteisiin. Seosta sekoitettiin voimakkaasti ja natriumhydroksidiliuosta (IM; 89,3 ml) lisättiin, kunnes pH oli 6,8, vesifaasi erotettiin ja tislattiin alennetussa paineessa 33 ml:ksi. Butan-l-olia (770 ml) lisättiin vesiväkevöitteeseen ja sekoitettiin sitten, seos lämmitettiin 40°C:seen ja sitä ravistettiin voimakkaasti. Liukenematon aine suodatettiin pois ja uutettiin uudelleen vesi:butan-l-oli-seoksella (1:23 til./til.) kunnes kaikki oli liuennut. Yhdistettyjä liuoksia pidettiin 4°C:ssa yli yön. Muodostunut kiteinen kiinteä aine suodatettiin, pestiin butan-l-olilla ja asetonilla ja ilmakuivattiin, jolloin saatiin 3,34 g natriumsuolaa (E^ 648).

2,92 g tätä natriumsuolaa liuotettiin veteen (20 ml) ja liuos suodatettiin. Suodosta sekoitettiin 0°C:ssa, samalla kun litium-kloridiliuosta (20 ml, kyllästetty 20°C:ssa) lisättiin 5 minuutin aikana. Sekoittamista ja jäähdyttämistä jatkettiin 1 tunnin ajan, jonka jälkeen kiteet kerättiin suodattamalla, pestiin etanolilla (20 ml), asetonilla (2 x 20 ml), dietyylieetterillä (2 x 25 ml) ja ilmakuivattiin, jolloin saatiin litiumsuola (2,275 g) valkeina pitkulaisina Iitteinä kiteinä (E^ 770). Puhtausaste yli 90 %.

Esimerkki 3

Litiumsuolan valmistus bariumsuolasta

Valmistuksen 1 mukaan valmistettu raaka bariumsuola (7,99 g; 288) liuotettiin veteen (60 ml) ja liuos suodatettiin. Suodokseen lisättiin annoksittain litiumsulfaattia (4,0 g) huoneen lämpötilassa 63580 21 sekoittaen, kunnes bariumin toteamisreaktiossa natriumroditsonaa-tilla saatiin negatiivinen tulos. Suspensio kirkastettiin sentri-fugoimalla ja neste kaadettiin pois ja keitettiin kokoon noin 35 ml;ksi alennetussa paineessa. Litiumkloridia (9,0 g) lisättiin annoksittain sekoittaen ja jäähdyttäen; 1 tunnin kuluttua 0°:ssa litiumsuola kerättiin suodattamalla, pestiin etanolilla (10 ml), asetonilla (2 x 25 ml), dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja ilmakui-vattiin suodatinsuppilossa, jolloin saatiin 1,590 g valkeita kiteitä (E^ 790). Litiumklavulanaatin puhtausaste oli yli 95 %.

Esimerkki 3

Litiumsuolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla

Valmistuksessa 2 hiilieluaattinäyte väkevöitiin alennetussa paineessa asetonin poistamiseksi. Saatu väkevöite (1 1; joka bio-kokeen mukaan sisälsi 1,28 g klavulaanihappoa) kaadettiin "Amberlite" IRA68-hartsipylvääseen (kloridimuoto; 100 ml). Pylväs pestiin vedellä (300 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridin vesiliuoksella keräten eluaattia 100 ml fraktioina.

Fraktiot 1 ja 2 yhdistettiin (200 ml), haihdutettiin alennetussa paineessa 40 mlsksi ja jätettiin 4°C:seen yli yön. Muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla (10 ml), asetonilla (50 ml) ja dietyylieetterillä (50 ml) ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 530 mg valkoista kiinteää ainetta (E^ 802), mikä vastaa 40,8 %:n saantoa hiilieluaatista. Lisäämällä sama tilavuus kyllästettyä litiumkloridin vesiliuosta emäliuokseen, ja seisottamalla 4°C:ssa saatiin toinen erä, josta edellä kuvatulla tavalla edelleen käsittelemällä 178 mg (E^ 740), mikä vastaa 12,7 % lisä-saantoa. Puhtausaste 90 %.

Sarjassa samanlaisia kokeita, joissa vaihdeltiin litium-kloridieluentin väkevyyttä, ioninvaihtohartsia ja eluenttikationia saatiin seuraavat tulokset.

Hartsi Kierto Eluentti e| Tuotteen Puhtaus- (molaarisuus) saanto % 1 aste 22 6 3 5 8 0

Amberlite kloridi litiumkloridi 750 51,8 >90 % IRA 68 (0,5M)

Amberlite kloridi litiumkloridi 760 55,6 >90 % IRA 68 (0,25M)

Amberlite kloridi litiumkloridi 560 50,3 >65 % IRA 93 (1,OM)

Amberlite kloridi litiumkloridi 640 44,5 >75 % IRA 93 (0,5M)

Amberlyst kloridi litiumkloridi 630 54,3 >75 % A 21 (1,OM)

Amberlite . asetaatti 0 litiumasetaatti 660 56,8 >80 % IRA 68 (0,5M)

Amberlite formiaatti 0 ammoniumformi- 520 55,8 >60 % IRA 68 aatti (0,5M) *)

Tuotteen saanto on laskettu hiilieluaatin lähtömäärästä.

0) v Näissä kokeissa litiumsuola oli valmistettu väkevöimällä eluaatit x6 ja lisäämällä sama tilavuus 50 % (paino/tilavuus) litium-kloridiliuosta. Saadut litiumsuolat käsiteltiin kuten edellä. Esimerkki 4

Litiumsuolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla Valmistuksen 2 mukaan valmistettu hiilieluaattinäyte (4 litraa) ajettiin "Amberlite" IRA68-pylvään (kloridimuoto; 250 ml) läpi, joka pestiin sitten vedellä (250 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/tilavuus) litiumkloridiliuoksella. 200 ml eluaattia, joka sisälsi 73 % lähtöaineen biologisesta aktiivisuudesta, kerättiin. Näyte (70 ml) tätä eluaattia käsiteltiin 5 tilavuudella propan-2-olia sekoittaen, jolloin saatiin tervamainen sakka. Neste kaadettiin pois ja väke-vöitiin alennetussa paineessa 7 mlrksi. Seisottuaan 4°C:ssa yli yön kiteinen tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä, ja kuivattiin tyhjössä. Kuivan kiinteän aineen (870 mg) puhtausaste biokokeella oli 95 %; saanto 94 % hartsipylvään eluaatista.

Esimerkki 5

Litiumsuolan valmistus Ioninvaihtohartsin avulla "Amberlite" IRA68-hartsipylväs (kloridimuoto; 50 ml) täytettiin hiilieluaatilla (840 ml), joka oli valmistettu valmistuksen 2 tavalla, pestiin vedellä (100 ml) ja eluoitiin 5 % (paino/tilavuus) 23 6 3 5 8 0 litiumkloridllla propan-2-oli:vesiseoksessa (5;1). Ensimmäiset 5 pylvään tilavuutta väkevöitiin alennetussa paineessa, antibiootti kiteytettiin kuten esimerkissä 4. Kiinteä aine painoi 292 mg, (Biokoe: 970 yug litiumklavulanaattia/mg kiinteää ainetta); saanto 45 % hiilieluaatista.

Esimerkki 6

Litiumsuolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla

Liuos käytettiin ja suodatettiin kuten valmistuksessa 2 ja näyte suodatettua liuosta (1 1), joka sisälsi 0,43 g klavulaani-happoa (biologinen koe) ajettiin "Amberlite" IRA93-hartsipylvään läpi (kloridimuoto; 100 ml). Pylväs pestiin laimealla etikkahapolla (0,25M; 200 ml), vedellä (750 ml) ja eluoitiin litiumkloridin vesi-liuoksella (IM). Ensimmäinen 150 ml eluaattia, joka sisälsi 0,28 g klavulaanihappoa (biologinen koe) väkevöitiin alennetussa paineessa 15 ml:ksi ja varastoitiin 4°C:ssa yli yön. Tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ennen kuivaamista ilmassa, jolloin saatiin 668 mg kiinteää ainetta (E^ 245); saanto 47 % suodatetusta liuoksesta.

Esimerkki 7

Litiumsuolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla

Liuos käytettiin ja suodatettiin kuten valmistuksessa 2 ja suodatettua liuosta (2 1), joka sisälsi 1,23 g klavulaanihappoa (biologinen koe) ajettiin "Amberlite" IRA93-hartsipylvään läpi (kloridimuoto; 240 ml). Pylväs pestiin vedellä (500 ml), propan-2-olizvesiseoksella (5:1; 400 ml) ja eluoitiin sitten 5 % (paino/tila-vuus) litiumkloridilla propan-2-oli:vesiseoksessa (5:1). Ensimmäiset 970 ml eluaattia väkevöitiin alennetussa paineessa 100 mlzksi ja varastoitiin 4°C:ssa 2 päivän ajan. Tuote suodatettiin ja pestiin kuten esimerkissä 6, jolloin saatiin 286 mg kiinteää ainetta (E^ 662), joka vastasi 19 % saantoa suodatetusta liuoksesta. Puhtaus-aste >80 %.

Esimerkki 8

Litiumsuolan valmistus ioninvaihtohartsin avulla

Liuos käytettiin ja suodatettiin kuten valmistuksessa 2, 500 ml suodosta täytettiin "Amberlite" IRA93-pylvääseen (kloridi-kierto; 50 ml). Pylväs pestiin vedellä (50 ml) ja 95 % etanolin vesiliuoksella (100 ml) ennen eluointia litiumkloridilla (1 % paino/ tilavuus 95 % etanolin vesiliuoksessa; 50 ml fraktiot). Fraktiot 2 24 63580 ja 3 yhdistettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa, kunnes kiinteä aine alkoi saostua. Väkevöite jäähdytettiin +4°C:seen 3/4 tunnin ajaksi ja kiinteä aine kerättiin sintterisuodattimelle. Kiinteä aine pestiin etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin 1/2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa tyhjöuunissa, jolloin saatiin 89 mg litiumklavulanaattia (E^ 770), joka vastaa 32 % saantoa suodatetusta liuoksesta. Puhtausaste >90 %.

Esimerkki 9

Litiumsuolan valmistus loninvaihtohartsin avulla

Valmistuksen 2 mukainen hiilieluaatti {5 litraa) ajettiin "Amberlite" IRA68 pylvään (500 ml tilavuudeltaan) kloridikierrosta 1 litran tuntivauhtia. Pylväs pestiin vedellä (1 litra) ja eluoitiin 0,5M natriumkloridiliuoksella. Ensimmäinen eluaattilitra väkevöitiin pyöröhaihduttimessa 90 ml:ksi. Annos väkevöitettä (10 ml) käsiteltiin propan-2-olilla (50 ml) sekoittaen. Neste kaadettiin tervamaisesta muodostuneesta sakasta, väkevöitiin pyöröhaihduttimella 3 ml tilavuuteen ja käsiteltiin 3 ml;11a 30 % paino/tilavuus litium-kloridiliuoksella. Seisottuaan 4°C:ssa yli yön tuote suodatettiin, pestiin peräkkäin etanolilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin valkean jauheen saamiseksi, 280 mg, E^ 770. Puhtausaste >90 %.

Esimerkki 10

Litiumklavulanaatin puhdistaminen

Litiumklavulanaattia (E^ 667; 2,0 g valmistettu kuten esimerkissä 6, jota seurasi käsittely isopropyylialkoholilla) liuotettiin veteen (16 ml) ja suodatettiin; etanolia (64 ml) lisättiin varovaisesti ja seosta sekoitettiin ympäröivässä lämpötilassa 1 tunnin ajan. Aluksi muodostunut sakka ei sisältänyt litiumklavulanaattia UV-spektroskooppisesti tutkittuna ja se hävitettiin. Neste laimennettiin kyllästetyllä litiumkloridiliuoksella (16 ml) ja asetettiin syrjään kiteytymään 2 1/2 tunniksi. Kiteet kerättiin suodattamalla, kuivattiin imulla, pestiin asetonilla (2 x 15 ml), dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja kuivattiin tyhjössä vakiopainoon (1,350 g)(E^ 735).

Seuraavat esimerkit kuvaavat litiumklavulanaatin muuttamista muiksi klavulanaattisuoloiksi.

A. Natriumsuolan valmistus litiumsuolasta

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettua litiumsuolaa (3,5 g) liuotettiin 20 ml:aan tislattua vettä ja liuos siirrettiin pylvääseen, joka sisälsi 50 ml AG50x8 kationinvaihtohartsia (Bio-Rad, Na+; 25 63580 200-400 mesh koko). Eluointi suoritettiin vedellä ja 8 ml fraktiot kerättiin. Fraktiot tutkittiin Staphylococcus aureusta sisältävällä ravintoagarilla päällystetyllä paperilla. Aktiiviset fraktiot (4-13) yhdistettiin ja pakastekuivattiin. Pakastekuivattu kiinteä aine liuotettiin tislattuun veteen, jolloin saatiin 19 ml liuosta, sitä ravisteltiin butan-l-olin (450 ml) kanssa ja lämmitettiin (vesi-haude) , kunnes liuos oli melkein kirkas. Lämmin liuos suodatettiin sintterin läpi keltaisen kiinteän aineen poistamiseksi ja suodosta pidettiin 4°C:ssa 60 tunnin ajan. Muodostuneet kiteet suodatettiin, pestiin butan-l-olilla (2 x 10 ml), sitten asetonilla (2 x 10 ml) ja kuivattiin alennetussa paineessa 40°C:ssa 1 tunnin ajan, jolloin saatiin 2,18 g kiinteää ainetta. Kiinteä aine kiteytettiin uudelleen vesi-butan-l-olista (1:23,3) esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

Kiteet kuivattiin alennetussa paineessa silikageelillä 44°C:ssa 1,5 tunnin ajan, jolloin saatiin 1,8 g kiinteää natriumsuolaa.

Kiinteä aine oli hygroskooppista. Se jauhettiin survimessa ja huhmaressa ja sen annettiin imeä ilmakehästä vettä 18°C:ssa.

Kun noin 22 % (paino/paino) vettä oli imeytynyt, oli saavutettu tasapaino. Tällä suolalla oli seuraavat ominaisuudet:

Alkuaineanalyysi (tasapainossa oleva kostea aine)

Saatu (keskiarvot on annettu suluissa): C, 33,3, 33,2 (33,25); H, 4,6, 4,6 (4,6); N, 4,6, 4,7 (4,65); Na, 7,3 (absorptiospektrofotometrisesti), 7,9 (laskettu sulfaattituhkasta); vettä, 21,95 %.

C8H8°5NNa,4H2° vaatii c' 32,76; H, 5,46; N, 4,78; Na, 7,8; vettä, 24,57 %.

Metallianalyysi: 1) Saatu atomiabsorptiospektrofotometrisesti:

Na 7,3 - 0,2 % (tämä arvo on ilmoitettu alkuaineanalyysin kohdalla).

2) Olettaen, että sulfaattituhka on Na2SO^, laskettiin Na-pitoisuus 7,9 %.

Optinen kierto: 0,134 % (paino/tilavuus) vesiliuoksen /y?(7D-arvo 24°C:ssa oli +47°.

Ultraviolettispektri: 0,00098 % liuoksen 0,1M NaOH:ssa UV-absorptiospektrissä oli absorptiomaksimi (^max) aaltopituudella 258 nm E^ = 555.

26 63580

Inf rapunaspek.tr 1;

Nujolissa ajetussa IR-spektrissä oli absorptiopiikit (cm-1) noin kohdilla: 3400 s 1592 s 1288 m 1080 w 986 s 850 w 3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 w 1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 w 753 m 1690 s 1310 s 1138 m 1015 s 902 m 1665 m 1302 sh 1120 m 998 m 880 w

Koko spektri on esitetty liitteenä olevien piirroksien kuviossa 2.

NMR-spektri:

Liuoksen protoni-NMR-spektrissä raskaassa vedessä oli piikit (^arvot), joiden keskipisteet olivat noin 4,28/ 5,07, 5,82, 6,44 ja 6,88.

B. Kaliumsuolan valmistus litiumsuolasta

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettu litiumsuola (3,0 g) liuotettiin veteen (100 ml) ja liuos johdettiin Dowex 50W x 2-pylvään (450 ml; K-muoto) lävitse. Esieluaatti (150 ml) hävitettiin. Seu-raava 400 ml eluaattia kerättiin ja haihdutettiin 15 ml:ksi alennetussa paineessa. Butan-l-olia (340 ml) lisättiin ja seosta lämmitettiin ja ravistettiin hyvin. Hiukan liukenematonta kiinteää ainetta suodatettiin pois. Suodos tislattiin alennetussa paineessa 200 ml:ksi, varastoitiin sitten 4°C:ssa yli yön. Kiteinen sakka suodatettiin, pestiin butan-l-olilla (2 x 10 ml), asetonilla (2 x 50 ml) ja dietyylieetterillä (2 x 50 ml) ja kuivattiin lopulta vakuumieksikkaattorissa huoneen lämpötilassa. Saanto 2,34 g kalium-suolaa. (E1 = 704). E1 määritettiin liuottamalla 7,1 mg kalium-suolaa 100 ml:aan vettä. Tämä liuos laimennettiin suhteessa 1:10 0,1M natriumhydroksidilla, jolloin saatiin lopullinen liuos 7,1 yjg/ml.

Alkuaineanalyysi:

Saatu: (keskiarvot on annettu suluissa): C, 40,0, 40,14 (40,07); H, 3,5, 3,55 (3,53); N, 6,0, 5,82 (5,91); K (absorptiospektrofotometrisesti) 16,0 (sulfaattituhkana) 15,9; vettä 1,75, 1,95 (1,85 %).

CgHgNOgK.1/4 H20 vaatii C, 39,7; H, 3,5; N, 5,8; K, 16,2, vettä 1,96 %.

Optinen kierto: 0,276 % paino/tilavuus vesiliuoksen -arvo oli +58,4°.

63580

Klavulaanihapon kalsium-/ barium- ja magnesiumsuolat valmistettiin samalla tavalla litiumklavulanaatista ja niillä todettiin olevan arvot 530/ 576 ja 713 vastaavasti.

C. Vapaan klavulaanihapon valmistus litiumsuolasta

Esimerkin 1 (ii) mukaan valmistettu litiumsuola (500 mg) jaettiin etyyliasetaatin (10 ml) ja kyllästetyn natriumkloridin vesiliuoksen (10 ml) välillä. 2N kloorivetyhappoa (1 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin nopeasti. Vesifaasi erotettiin, pestiin etyyliasetaatilla (10 ml) ja yhdistetyt orgaaniset uutteet pestiin kyllästetyllä natriumkloridin vesiliuoksella (15 ml). Saatu orgaaninen liuos kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin melkein kuiviin, jolloin saatiin vapaa happo öljynä (352 mg), joka sisälsi noin 0,5 moolia etyyliasetaattia. Yhdisteellä oli seuraavat ominaisuudet: Coil}} (c 1,0; DMSO) + 54,5°, X 0,00098 % liuokselle 0,IN vesiliuoksessa on 258 nm (E^ 590). Nujolissa on infrapunapiik-kejä kohdilla 3350, 1790 ja 1722 cm \ NMR-piikkejä (DMSO-dg) kohdilla T!4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s), 5,23 (t, 7Hz), 5,97 (d, 7 Hz), 6,37 ja 6,93 (dd, 3 ja 17 Hz; d, 17 Hz); piikit, joiden keskipiste on kohdilla 8,82 ja 8,00 ja 5,95 osoittavat, että näyte sisälsi noin 0,5 moolia etyyliasetaattia klavulaanihappomoolia kohti.

Nämä arvot osoittavat, että näyte sisälsi vähintään 85 % painosta klavulaanihappoa.

D. Ammoniumsuolan valmistus litiumsuolasta "Dowex" 50W-pylväs (240 ml) muutettiin ammoniummuotoon käsittelemällä ammoniumsulfaatilla ja pestiin puhtaaksi sulfaatista vedellä. Litiumsuola (1,0 g) liuotettiin veteen (15 ml), siirrettiin pylvääseen ja pylväs kehitettiin vedellä. Fraktioita (25 ml) tutkittiin UV-absorptiolla 0,1N natriumhydroksidissa. Aktiiviset fraktiot (4-7) yhdistettiin ja tislattiin lähes kuiviin (2 ml) alennetussa paineessa, ja niihin lisättiin n-butanolia (85 ml). Seos tislattiin varovaisesti 25°C:ssa 0,1 mm paineessa, kunnes kiteinen aine saostui. Ammoniumsuola kerättiin suodattamalla, pestiin hyvin pienellä määrällä etanolia, asetonia ja dietyylieetteriä ja kuivattiin 0,1 mm:ssä 2 3 6 tunnin ajan, jolloin saatiin valkeita kiteitä (0,54 g). CoiJ^ (c 0,39 % vedessä) +60,1°; Amax (0,1N natriumhydroksidi, 8,8yjg/ml) 258 nm (E^ 745); IR-piikkejä nujolissa oli kohdilla 3360, 1780, 1700 ja 1580 cm-1; ^(5 % D20): 4,27 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,09 (t,7Hz), 5,84 (d, 7Hz), 6,43 (dd, 17Hz, 3Hz) ja 6,89 (d, 17Hz).

28 63580

Saatu C, 44,4; H, 5,6; N, 13,3 %.CgHgN05NH4 vaatii C, 44,4; H, 5,6; N, 13,0 %. Karl Fischer-analyysillä todettiin jäänteitä vedestä (0,6 %).

E, Metyyliäni!inisuolan valmistus litiumsuolasta "Amberlite" IR 120 H+-pylväs (200 ml) muutettiin metyyli- ammoniummuotoon käsittelemällä 0,5M metyyliamiiniliuoksella vedessä. Pylväs pestiin neutraaliksi vedellä, ja pylvääseen lisättiin metyyli-ammoniumkloridia (3,0 g) vedessä (10 ml). Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja oli valmis käyttöön.

Litiumsuola (1,50 g) liuotettiin veteen (15 ml) ja kaadettiin pylvään yläpinnalle. Pylväs kehitettiin vedellä ja fraktioita (25 ml) kerättiin. Fraktiot 3-7 yhdistettiin (161 ml pesuliuoksineen), tislattiin 35°/l,0 nutussa noin 2 ml:ksi ja n-butanolia (200 ml) lisättiin. Kirkas liuos tislattiin samanlaisissa olosuhteissa 20 ml:ksi, jolloin kiteytyminen tapahtui. Kiteet kerättiin suodattamalla 1 tunnin seisotuksen jälkeen 2°:ssa, pestiin dietyylieetterillä (2 x 15 ml) ja kuivattiin 3 tunnin ajan 1 mm:ssä, jolloin saatiin metyyliamiinisuola (1,2 g) valkeina prismoina. C°^JD (c 0,23 % vedessä) +56,1°, Xmax (0,1N natriumhydroksidi, 9,5^ig/ml) 260 nm, (E^ 584); IR-piikkejä nujolissa oli kohdilla 2500, 1790, 1692, 1632 ja 1576 cm ^(8 % D2O); 6,40 ja 6,86 (dd, 17Hz, 3Hz; d, 17Hz), 4,24 (d, 3Hz), 5,06 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s).

Saatu c, 46,7; H, 6,1; N, 12,5 %. cgHi4N25 vaatii C, 47,0; H, 6,1 ja N, 12,2 %.

F. Piperidiinisuolan valmistus litiumsuolasta / R\

Ioninvaihtohartsipylväs (200 ml "Bio-Rad Laboratories, AG 50Wx2, 100-200 mesh H+-muoto) muutettiin piperidiinimuotoon piperi-diiniliuoksella (75 ml) vedessä (1500 ml). Hartsi pestiin neutraaliksi vedellä ja käsiteltiin piperidiinikloridilla (3 g) vedessä (10 ml). Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja oli valmis käyttöön.

Litiumsuola (1,50 g) kaadettiin pylvään yläpinnalle vedessä (15 ml) ja pylväs kehitettiin vedessä keräten 25 ml:n fraktioita. Fraktiot 3-6 yhdistettiin pesuliuosten kanssa (172 ml).

Liuos haihdutettiin lähes kuiviin 35°/l,0 mmtssä, ja puhdasta tolueenia lisättiin, öljymäinen suspensio haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa kuten yllä ja saatu kiteinen kiinteä aine jauhettiin hienoksi etyyliasetaatissa (90 ml). Kiteinen piperidiini- 29 63580 suola kerättiin suodattamalla, pestiin etyyliasetaatilla (3 x 30 ml) ja jäljelle jäänyt liuotin poistettiin 0,1 mm Hg paineessa 3 tunnin λ aikana, jolloin saatiin 1,775 g lähes valkoisia kiteitä.

(c 0,35 % vedessä) +42,2°; \max (0,1N natriumhydroksidi, 10 yug/ml) 259,5 nm (E^ 474); IR-piikkejä nujolissa oli kohdilla 3380, 2540, 1782, 1682 ja 1608 cm”1; Τ(8 % D20) : 6,90 (d, 17Hz) , 6,44 (dd3, 17Hz), 4,28 (d, 2Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8 Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (monimutkainen multipletti), 8,0-8,5 (monimutkainen multipletti). Saatu C, 52,8; H, 7,2; N, 9,3 %· .C13H20N2°5*0'6 H20 vaatii C, 52,9; H, 7,4; ja N, 9,5 %.

G. Trietyyliamiinisuolan valmistus litiumsuolasta Esimerkissä F kuvattu ioninvaihtohartsipylväs (Bio-Rad AG 50W) muutettiin trietyyliammoniummuotoon trietyyliamiinin vesi-liuoksella (0,5N, 1,5 1) ja pestiin neutraaliksi vedellä. Trietyyli-ammoniumkloridin (3 g) vesiliuosta (15 ml) lisättiin pylvääseen. Pylväs pestiin vapaaksi kloridista vedellä ja se oli valmis käyttöön.

Litiumsuola (1,5 g) kaadettiin pylvään yläpinnalle vedessä (15 ml) ja pylväs kehitettiin vedellä keräten 25 ml:n fraktioita. Fraktiot 4-9 yhdistettiin (175 ml pesuliuoksineen).

Liuos keitettiin kokoon alennetussa paineessa (35°/l,0 mm), jolloin saatiin öljy, joka keitettiin kokoon kolme kertaa tolueenin kanssa samoissa olosuhteissa. Saatuja kiteitä hierrettiin etyyliasetaatissa (50 ml), kiteet suodatettiin, pestiin kahdesti dietyyli-eetterillä (2 x 20 ml) ja vapautettiin jäljelle jääneestä liuotti- mesta eksikkaattorissa 3 tunnin ajan 0,1 mm:ssä, jolloin saatiin 25 trietyyliammoniumsuola (1,588 g) lähes valkoisina kiteinä.

(c 0,22 % vedessä) +44,3°; Xmax (0,1N natriumhydroksidi, 9,7 yjg/ral) 258 nm (E1 485); IR-piikkejä nujolissa on kohdilla 3250, 2080, 1784, 1700 ja 1640 cm”1; ^(10 % D20); 6,41 ja 6,87 (dd, 17Hz, 3Hz; d, 17Hz), 4,26 (d, 3Hz), 5,07 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,07 (s), 8,74 (t, 7Hz) ja 6,78 (q, 7Hz). Saatu C, 55,2; H, 7,9; N, 9,2 %, C14H24^2°5·X/4 H2° vaatii C, 55,2; H, 8,0 ja N, 9,2 %.

Claims (4)

30 63580

1. Menetelmä klavulaanihappoa tuottavan mikro-organismin fermentointiliemestä eristetyn tai totaalisynteesillä valmistetun kaavan I mukaisen H C _XH-OH 6. c m 7 vr1 3/ " \ττ ° /N H 'COOH epäpuhtaan klavulaanihapon ja/tai sen emäksen tai emäksisen ionin-vaihtohartsin kanssa muodostaman suolan puhdistamiseksi ja puhdistetun suolan muuttamiseksi toiseksi suolaksi, tunnettu siitä, että epäpuhtauksia sisältävä klavulaanihappo ja/tai sen emäksen tai emäksisen ioninvaihtohartsin kanssa muodostama suola saatetaan reagoimaan ionisoituneen litiumyhdisteen vesiliuoksen, edullisesti litiumkloridin vesiliuoksen kanssa litiumklavulanaattia sisältävän vesiliuoksen saamiseksi, josta litiumklavulanaatti seostetaan ja sakka erotetaan epäpuhtauksia sisältävästä vesiliuoksesta, jolloin saadaan puhdas litiumklavulanaatti, joka muutetaan toiseksi suolaksi, kuten kaliumklavulanaatiksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että litiumklavulanaatin saostuminen saadaan aikaan lisäämällä mainittuun vesiliuokseen, joka sisältää litiumklavulanaattia, riittävä väkevyys vesiliukoista litiumsuolaa litiumklavulanaatin ulossuolaamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ionisoitunut litiumyhdiste ja/tai vesiliukoinen litiumsuola siinä on litiumkloridi.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aluksi reagoiva klavulaanihapon suola on emäksisen ioninvaihtohartsin kanssa muodostettu suola ja hartsin suola eluoidaan mainitulla ionisoituvalla litiumyhdisteen, parhaiten litiumkloridin vesiliuoksella, jota käytetään ylimäärin, jolloin saadaan vesipitoinen litiumklavulanaattia sisältävä eluaatti, joka erotetaan ulossuolaamalla ionisoituneesta litiumyhdisteestä ja erotetaan jäljelle jäävästä hartsista.