DK146764B - Alkalimetalclavulanat til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af clavulansyre eller andre derivater deraf, samt blanding til anvendelse ved fremstilling af clavulansyre eller derivater deraf - Google Patents

Description

i 146764

Opfindelsen angår et hidtil ukendt alkalimetalclavula-nat til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af cla-vulansyre eller andre derivater deraf. Dette alkalimetalclavu-lanat er ifølge opfindelsen ejendommeligt ved at det er litiumel avulanat.

Opfindelsen angår tillige en blanding til anvendelse ved fremstilling af clavulansyre eller derivater deraf, og ifølge opfindelsen er denne blanding ejendommelig ved at indeholde mindst 98% litiumclavulanat. Så rent litiumclavulanat son muligt, altså med højst 2% urenheder, foretrækkes nemlig til fremstilling af clavulansyre.

Gæring af Streptomyces clavuligerus, navnlig stammen NRRL 3585, bevirker dannelse af forskellige antibiotiske stoffer, og GB patentskrift nr. 1.315.577 beskriver dyrkning af nævnte stamme til dannelse af antibiotikum A 16886 I og A 16886 II.

Organismen kan desuden danne det antibiotiske stof (2R,5R,Z)-3-(2-hydroxyætyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyklo[3,2,0]-heptan-2-karboxylsyre med formel I:

I _ CH-OH

H

H *COOH

og denne forbindelse kaldes her for clavulansyre. Opfindelsen angår således denne forbindelses litiumsalt.

Clavulansyre og forskellige syrer og salte deraf er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 1672/75, og her er også beskrevet hvorledes der kan ske nogen rensning af materialet.

Den bedste anviste rensningsmetode går ud på at man ud fra et salt af clavulansyre danner dens benzylester, der derpå renses på konventionel måde, hvorefter man frigør syren derfra. Det har vist sig at der ved reduktiv spaltning af benzylelavulanat dannes 10-15% af en inaktiv isomer. Det bedste materiale der kan vindes ved denne kendte rensningsmetode indeholder således 10-15% af den uønskede isomer; materiale tilvejebragt i henhold til nævnte ansøgning og uden forestringsprocessen indeholder 2 146764 mindst 1/3 urenheder.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en clavulan-syreforbindelse der ved anvendelse som mellemprodukt ved en rensningsproces kan føre til clavulansyre eller forskellige derivater deraf i en form der er væsentligt renere end hvad der kan opnås ved den ovenfor nævnte kendte teknik. Det har overraskende vist sig at dette kan opnås ved litiumsaltet, der har den uden sammenligning med andre clavulansyresalte enestående egenskab at være tungt opløseligt i vand, samtidig med at det let udfældes i høj renhed, hvorefter det kan omdannes til clavulansyre eller andre derivater af clavulansyre. Som det fremgår ovenfor fremstilles litiumclavulanat fortrinsvis i en renhed på mindst 98%.

Som nævnt er det overraskende at netop litiumsaltet let fremstilles i så høj renhed og derved kan føre til meget rene andre clavulansyreforbindelser. Det er nemlig fra eksempel 15 og 17 i forannævnte DK patentansøgning 1672/75 kendt at anbringe et råt kulturfiltrat indeholdende rå clavulansyre på en kolonne af en svagt basisk ionbytterharpiks og derpå eluere med NaCl. Herved sker ikke nogen udkrystallisation af natriumcla-vulanat, men dette salt vindes ved inddampning af eluatet. Herved opnås ingen nævneværdig adskillelse fra urenheder, og ifølge nævnte eksempel 17 har det inddampede produkt en renhed på ca. 1/3 af den bedste af de i ansøgningens eksempler angivne renheder. Hvis man derimod erstatter natriumklorid med litiumklorid som elueringsmiddel fra kolonnen af ionbytterharpiks-salt med clavulansyre, dannes der krystallinsk litiumclavulanat som udfældes og dermed skilles fra urenheder. De andre alkalimetaller danner ikke sådanne krystallinske salte med clavulansyre.

Eksempler på urene salte der foruden rå clavulansyre kan danne udgangsmateriale for fremstilling af litiumclavulanat er alkalimetalsalte som fx natrium-, kalium- og litiumsaltet; jordalkalimetalsalte som fx kalcium-, magnium- og bariumsaltet; ammoniumsaltet; og salte med organiske baser som fx salte afledet af primære, sekundære, tertiære eller N-kvaternære aminer, fx mono-, di- eller tri-alkylammoniumsalte såsom metyl- 146764 3 ammoniumsaltet og triætylammoniumsaltet samt heterocykliske basesalte såsom piperidiniumsaltet.

Saltene med uorganiske baser og de fleste af saltene med organiske baser er i almindelighed mere stabile i vandig opløsning end fri clavulansyre. Saltene kan eksistere i form af solvater, dvs. med krystalvand eller et andet krystallisationsopløsningsmiddel .

Ud fra litiumclavulanat ifølge opfindelsen og med en renhed på 98% eller derover, altså med et indhold af urenheder og/eller isomerer stammende fra produktionen på højst 2 vægt% er der fremstillet adskillige andre clavulanatsalte i krystallinsk form. Disse salte var i det væsentlige rene som det fremgik af de molære ekstinktionskoefficienter, målt ved 259+1 nm i 0,1M vandigt natriumhydroxyd, på mindst 16.200. Værdierne 24 for den molære rotation,[M]^ , i vandig opløsning var mindst +137°+5°. Den fri syre, fremstillet ud fra saltene, har udvist 1% en ekstinktionskoefficient, E^cm i 0,1M vandigt natriumhydroxyd ved 259 nm, på 590 eller derover og en specifik optisk rotation [a]^ i dimetylsulfoxyd på ca. +54°. Det vil forstås at fremstilling af materiale med denne renhedsgrad gør det muligt at bruge produkterne i farmaceutiske og veterinærmedicinske præparater, og også at en sådan renhed er meget ønskelig ved anvendelse af materialerne som mellemprodukter.

Udtrykket "renhed" i nærværende beskrivelse refererer til procenten af clavulansyre og/eller salt deraf, udtrykt i forhold til den samlede mængde tilstedeværende tørstof på vægtbasis, men uden hensyn til bundet vand eller andre bundne opløsningsmidler .

Clavulansyre og dens salte har antibakteriel virkning mod en række gramnegative og grampositive mikroorganismer, er stabile mod indvirkning af 3-laktamaser frembragt af grampositive og gramnegative organismer og har evne til at inhibere 3-laktamaseenzymer frembragt af grampositive og gramnegative bakterier. Desuden inhiberes et antal enzymer af klasse I.

Clavulansyre og dens salte har således evne til at beskytte B-laktamase-følsomme 3-laktam-antibiotika fra hydrolyse fremkaldt af 3-laktamase, og den er derfor af interesse til brug i forbindelse med 3-laktam-antibiotika som er følsomme 4 146764 for B-laktamaser både fra grampositive og fra gramnegative organismer.

Det foretrækkes i almindelighed at bruge salte af cla-vulansyre med renhed på mindst 98%, dvs. med under 2% urenheder eller isomerer stammende fra produktionen bortset fra opløsningsmidler, sammen med et bredspektret 8-laktam-antibiotikum.

Fremstilling af litiumclavulanat

Clavulansyre og dens salte kan udvindes fra et gæringsmedium frembragt ved dyrkning som angivet i britisk patentskrift nr. 1.315.177 af en stamme af Streptomyces clavuligerus, fx stammen NRRL 3585, ved en fraktioneringsteknik til fjernelse af uønskede bestanddele af næringsmediet såsom proteiner og enzymer og navnlig andre S-laktam-antibiotika. Konventionel teknik er vanskelig, navnlig på grund af den ensartede opførsel af de forskellige tilstedeværende B-laktam-karboxylsyrer såsom de ovennævnte antibiotika A 16.886 I og II. Udvindingen af antibiotiket lettes i høj grad hvis man omdanner clavulansyre eller dens salte til litiumclavulanat og udfælder sidstnævnte, normalt i krystallinsk form. En sådan udfældning kan gennemføres, muligvis på grund af en overraskende høj affinitet af clavulanationer til litiumioner, med ingen eller ingen væsentlig samtidig udfældning af urenheder, specielt andre 8-laktamer. Desuden kan man ved direkte isolation af saltet under undgåelse af omdannelse af clavulansyre til organiske derivater såsom estere med påfølgende genomdannelse til syren, fx ved en reduktionsteknik, undgå omlejring af clavulansyre til isomerer.

Det skal bemærkes at i gæringsmedier og andre opløsninger ved tilnærmelsesvis neutral pH vil clavulansyre og salte dannet med en eller flere kationer eksistere i ligevægt, og isolationsprocesser vil hyppigt blive udført på clavulansyre og/eller salte deraf i afhængighed af pH-værdien og andre betingelser. I almindelighed er clavulansyre og dens salte temmelig ustabile i vandig opløsning uden for pH-området 5,5 til 8, og under de i det følgende beskrevne processer er det ønskeligt at holde pH-værdien inden for dette område, fortrinsvis nær ved ca. pH 6,5 med mindre andet er angivet.

5 148764

Ved fremstilling af litiumclavulanat omsættes clavulan-syre, normalt rå clavulansyre i et råt gæringsmedium eller et urent, fra litiumsaltet forskelligt salt af clavulansyre med en vandig xonisk litiumforbindelse til frembringelse af en vandig opløsning indeholdende litiumclavulanat, der derefter udfældes derfra hvorefter bundfaldet skilles fra den vandige opløsning.

I almindelighed vil den ioniske litiumforbindelse være et salt. Det foretrækkes at bruge litiumklorid, men også liti-umbromid, litiumjodid eller litiumsulfat samt litiumkarboxylater såsom acetatet, propionatet, formiatet, benzoatet eller laktatet egner sig. Valget af salt kan påvirkes af andre tilstedeværende materialer, og hvis fx det oprindeligt tilstedeværende clavulansyresalt er bariumsaltet, kan det foretrækkes at bruge litiumsulfat til at bevirke en forudgående udfældning af bariumsulfat før udfældningen af litiumclavulanat.

I almindelighed foretrækkes det at koncentrationen af litiumclavulanat før udfældningen er mindst 0,1 vægt%, hensigtsmæssigt mindst 2%, og højere koncentrationer som fx op til 12% eller endog op til 20 vægt% giver naturligvis større procentuelle udvindinger.

Det oprindeligt tilstedeværende salt af clavulansyre, som behøver rensning, kan fx være et alkalimetalsalt såsom natriumsaltet eller kaliumsaltet eller endog litiumsaltet hvis dette er til stede som en kvantitativt mindre bestanddel af clavulansyrematerialet, eller det kan være et jordalkalimetal-salt som fx kalcium-, barium- eller magniumsaltet eller et salt med en organisk base som beskrevet foran, eller et salt dannet med en basisk ionbytterharpiks.

Det forhold at litiumclavulanat let udfældes i høj renhedsgrad kan udnyttes på flere forskellige måder.

Udsaltning af litiumclavulanat

Man kan i den vandige opløsning indeholdende litiumclavulanat indføre en tilstrækkelig mængde vandopløseligt litiumsalt, især det der bruges til dannelse af litiumclavulanat, til udsaltning af sidstnævnte; herved hæver man koncentrationen 6 146764 af litiumioner så at opløselighedsproduktet af litiumclavula-nat ved den givne temperatur overskrides i høj grad. Da clavu-lanatet er mindre opløseligt ved lavere temperaturer er det normalt hensigtsmæssigt at nedsætte temperaturen af opløsningen for at bringe udfældningen til maximum, fx til omkring 0-5°C.

Ved en sådan udsaltning ligger koncentrationen af den ioniske litiumforbindelse i den vandige opløsning indeholdende litiumclavulanatet fortrinsvis i området 4M til 10M, men koncentrationer op til mætning er brugbare; et særligt foretrukket område er 5M til 8M.

Det kan være fordelagtigt efter at have indhøstet første udbytte af litiumclavulanat at koncentrere yderligere og indhøste et næste udbytte.

Omdannelse af andre clavulanater til litiumclavulanat

Den opløsning som indeholder litiumclavulanat kan dannes ved at man opløser et andet salt af clavulansyre end litiumsaltet, fx natrium-, kalium-, magnium-, barium-, kalciumeller ammoniumsaltet, i en vandig opløsning og deri inkorporerer et vandopløseligt litiumsalt såsom litiumklorid. I tilfælde af bariumsaltet kan anvendelse af en høj koncentration af litiumklorid resultere i nogen samtidig udfældning af bariumklorid med litiumklavulanat. Bariumkloridet kan imidlertid let elimineres ved genopløsning af blandingen i vand og tilsætning af litiumsulfat for at udfælde bariumsulfat, der kan fjernes fx ved filtrering, efterfulgt af tilsætning af litiumklorid for at udfælde rent litiumclavulanat.

Dannelse af litiumclavulanat på en ionbytterharpiks Særlig rent litiumclavulanat vinder man, hvis det salt af clavulansyre, der bruges som udgangsmateriale, er et salt med en basisk ionbytterharpiks og det bringes i kontakt med en vandig opløsning af et litiumsalt til frembringelse af en vandig opløsning af litiumclavulanat. Harpiksen vil normalt blive anvendt i form af en kolonne på hvilken uren clavulansyre og/eller et salt deraf påføres, og hvorfra der elueres en vandig opløsning af litiumclavulanat under anvendelse af en 1Λ6764 7 vandig opløsning af et vandopløseligt litiumsalt som fx litiumklorid. Harpiksen vil normalt blive vasket, fx med vand, før elueringen.

Harpiksen vil i almindelighed indeholde aminogrupper eller tertiære aminogrupper (svagt basisk) eller kvaternære ammoniumgrupper (stærkt basisk). Harpiksen kan fx være en polystyrenharpiks, polyakrylharpiks, epoxy-polyaminharpiks, feno-lisk-polyaminharpiks eller tværbundet dekstranharpiks, og den kan være makroretikulær eller mikroretikulær.

Betegnelsen "harpiks" bruges her af praktiske grunde således at den også omfatter cellulosederivater og de foran nævnte dekstranderivater, der er afledet af naturligt forekommende polymerer. Typiske svagt basiske ionbytterharpikser er (Ri bl.a. "Amberlite" ^IRA68 (mikroretikulær; polyakrylat tværbundet med divinylbenzen; tertiære aminogrupper) og "Amberlite" ILA93 (makroretikulær; polystyren tværbundet med divinylbenzen; tertiære aminogrupper). Typiske stærkt basiske ionbytterharpikser er bl.a. "Zerolit" ^FF og "Zerolit" FF (iP) (forhandlet af Zerolit Co. Ltd.).

Basiske ionbytterharpikser er med fordel i saltform når de bringes i kontakt med en uren clavulansyre og/eller et salt deraf; anionen er fortrinsvis den samme som i det l'itiumsalt der bruges som elueringsmiddel, hensigtsmæssigt kloridionen, men der kan også bruges anderledes anioner uden afgørende ugunstige virkninger.

Koncentrationen af det vandige litiumsalt der bruges som elueringsmiddel er fortrinsvis i området 0,02M til 8M, men . de lavere koncentrationer giver dog meget tynde opløsninger af litiumclavulanat og gør den påfølgende udfældning vanskeligere. I almindelighed foretrækkes det at bruge koncentrationer i området 0,5 til 2,5M.

Selv om adsorptions/eluerings-teknik konventionelt udføres på en sådan måde at det ønskede produkt underkastes en separation af den kromatografiske type fra andre adsorberede materialer, har det vist sig at det påfølgende trin med udfældning er så effektivt ved adskillelse af litiumclavulanat fra uønskede urenheder, at det sædvanligvis må foretrækkes i det væsentlige at strippe kolonnen ved at bruge forholdsvis høje 8 U6764 koncentrationer af litiumsalt i elueringsmidlet. Dette giver et smalt bånd af clavulanat på kolonnen, der kan elueres til et forholdsvis lille rumfang eluat, hvorved man letter den påfølgende udfældning.

Eluatet vil normalt indeholde litiumsaltet, fx litiumklorid i en koncentration i området 0,5 til 2,5M, mens som nævnt foran udsaltningsvirkningen er mest effektiv ved koncentrationer i området 5M til 10M. Det foretrækkes derfor at koncentrere eluatet, fx ved inddampning i vakuum til ca. 1/5 af rumfanget. Opløseligheden af litiumclavulanat ved ca. 20°C i forskellige koncentrationer af vandigt litiumklorid fremgår af nedenstående tabel:

Tabel 1

Molaritet af Opløselighed af litiumclavula-

LiCl_ nat, mg/ffil (tilnærmet)_ 2.5 23,5 3,75 10,2 5,0 4,1 6,25 1,8 7.5 0,8

Det foran nævnte trin med koncentrering foretrækkes frem for tilsætning af yderligere litiumsalt, da litiumclavulanat også koncentreres og tab i moderluden derfor nedbringes.

For at nedbringe eluering af adsorberede urenheder fra harpiksen kan det være fordelagtigt i elueringsmidlet at inkorporere et vandblandbart organisk opløsningsmiddel i høj koncentration. Det er også muligt efter eluering under fravær af et sådant opløsningsmiddel at tilsætte dette til eluatet for at udfælde eluerede urenheder, hvorefter det således dannede bundfald fraskilles før videre behandling. Opløsningsmidlet kan fx være en keton såsom acetone, en alkohol såsom metanol, ætanol, isopropylalkohol eller ætylenglykol, en æter såsom dio-xan eller tetrahydrofuran eller et substitueret amid-, inddeller sulfoxyd-opløsningsmiddel såsom dimetylformamid eller dimetylsulfoxyd. I almindelighed foretrækkes alkoholer som sådanne opløsningsmidler, fx ætanol eller isopropylalkohol.

U6764 9

Til brug ved en sådan fraskillelse fra uønskede urenheder er den foretrukne koncentration af alkoholen i eluerings-raidlet eller eluatet efter tilsætning af alkoholen dertil 70 til 97 rumfangs%.

Udfældning af litiumclavulanat ved hjælp af et vandblandbart opløsningsmiddel__

Hvis koncentrationen af det vandblandbare organiske opløsningsmiddel og litiumsalte i den netop beskrevne procedure er for høj, kan litiumclavulanatet blive udfældet for tidligt.

Det er muligt at udfælde litiumclavulanat fra en vandig opløsning ved at bruge meget høje koncentrationer af sådanne opløsningsmidler, og dette betegner en alternativ udfældningsmetode der udnytter fordelene ved den beskrevne selektive udfældning af litiumclavulanat. således kan clavulansyre og/eller et salt deraf bringes i kontakt med et litiumsalt med forholdsvis lav koncentration, enten ved eluering fra en kolonne eller ved opløsning af saltene i en enkelt opløsning, hvorefter den ønskede udfældning kan udføres uden koncentrering ved tilsætning af vandblandbart opløsningsmiddel. Således er fx koncentrationer af alkohol på mindst 90 rumfangs!, fortrinsvis mindst 95%, effektive til udfældning af litiumclavulanat. Det kan være nødvendigt at indhøste et første udbytte af litiumclavulanat og derefter at koncentrere i vakuum, fx til 1/4 rumfang, for at opnå et andet udbytte.

Fremstilling af et salt af clavulansyre med en ionbytterharpiks.

Saltet af clavulansyre med en basisk ionbytterharpiks kan være dannet ved kontakt mellem harpiksen og et gæringsmedium indeholdende clavulansyre og/eller et salt deraf, hvorved et adsorptions-/elueringstrin kan spares. Fast materiale er normalt fjernet i forvejen, fx ved filtrering eller centrifugering. Denne mulighed eksisterer på grund af den bemærkelsesværdige rensning der sker ved fældning med en ionisk litiumforbindelse. Efter fjernelse af faste stoffer kan man behandle næringsmediet med adsorberende trækul for at adsorbere clavulansyre og/eller saltet deraf; dette bidrager til at skille andre salte fra clavulanatet og undgå for kraftig belastning 146764 ίο af den basiske ionbytterharpiks med uønsket ionisk materiale.

I almindelighed kan det klarede medium føres gennem et trækulleje, fx i en kolonne, fortrinsvis under anvendelse af lige netop tilstrækkelig meget trækul til at adsorbere al den ønskede clavulansyre og/eller salt deraf, sædvanligvis i et forhold på ca. 1 rumfangsdel trækul til 3-10 rumfangsdele klaret medium. Almindelige trækul er egnede, og det er ikke nødvendigt at bruge højaktiveret materiale.

Trækullene kan derefter strippes med et vandigt vandblandbart opløsningsmiddel, fx en keton såsom metylætylketon, metylisobutylketon eller fortrinsvis acetone, fordelagtigt ved en koncentration på fra 30 til 95% keton, fortrinsvis 50 til 70%. Før stripningen vaskes trækullene fortrinsvis fx med vand, for at fjerne tilbageværende komponenter fra mediet.

En anden variation af den netop beskrevne fremgangsmåde består i at fremstille et harpikssalt af clavulansyre som beskrevet foran og at eluere dette med et andet salt end et litiumsalt, fx natriumsalt, kaliumsalt, magniumsalt eller kalci-umsalt, fx et klorid eller acetat, eller et ammoniumsalt eller pyridiniumsalt, fx ammoniumformiat eller -acetat eller pyridin-hydroklorid, til dannelse af en vandig opløsning af det tilsvarende clavulanat; overskud af et vandopløseligt litiumsalt kan derefter sættes til eluatet og litiumclavulanat udfældes som tidligere beskrevet.

Dannelse af litiumclavulanat og andre clavulanater ved ekstraktion af en fenolisk opløsning af clavulansyre_

En vandig opløsning indeholdende litiumclavulanat kan også vindes ved at man ekstraherer en fenolisk opløsning af clavulansyre med en vandig opløsning af litiumhydroxyd, hvorpå udfældning af litiumclavulanat så udføres som beskrevet foran, fortrinsvis efter fjernelse af tilbageværende fenolisk opløsningsmiddel ved ekstraktion af den vandige opløsning med et vandublandbart opløsningsmiddel såsom æter, kloroform eller kulstoftetraklorid.

Denne teknik kan også bruges til at fremstille andre salte af clavulansyre end litiumsaltet ved at man ekstraherer den fenoliske opløsning med en passende base, fx jordalka- 146764 11 limetalhydroxyd såsom kalcium- eller bariumhydroxyd. Ethvert andet dannet bundfald, fx bariumsulfat, bør fjernes før udfældningen af clavulanatsaltet og dette kan derefter isoleres, fx ved frysetørring. Rensning ved omdannelse til litiumsaltet kan derefter udføres som beskrevet foran.

I almindelighed udføres ekstraktionen af det fenoliske opløsningsmiddel ved titrering af den vandige fase med en base, så der opnås en pH-værdi på ca. 6,5.

Den fenoliske ekstrakt kan fremstilles ved at man med et fenolisk opløsningsmiddel ekstraherer et vandigt eluat fra et trækul- eller harpiksadsorbat af den foran beskrevne slags, sædvanligvis efter koncentrering af eluatet og eventuelt efter udfældning af uønskede organiske urenheder ved tilsætning af et eller flere vandblandbare organiske opløsningsmidler og/el-ler fjernelse af sådanne urenheder ved ekstraktion med et vand-ublandbart opløsningsmiddel.

Ved denne type procedure kan det således være ønskeligt at koncentrere eluatet fra enten trækullet eller en harpiks ved inddampning under nedsat tryk. I almindelighed udføres behandlingen under rensningen fortrinsvis ved en pH-værdi i området 6,0-7,0, fx 6,5, for at nedbringe sønderdeling til et minimum. Eluatet kan derefter renses ved udfældning af uønsket materiale med en vandblandbar keton såsom acetone, fortrinsvis så der kommer en koncentration af ketonen på 50 til 90 rumfangs%, med fordel ca. 85%. pH-værdien ved dette trin er fortrinsvis ca. 6,5 og hvis den vandige væske allerede indeholder vandblandbar keton, fjernes denne fortrinsvis for at lette pH-må-lingen. pH-værdien kan reguleres ved tilsætning af en base, fx et alkalimetalhydroxyd såsom natriumhydroxyd.

Yderligere rensning kan udføres med et opløsningsmiddel ved ekstraktionstrin for at fjerne uønskede komponenter, fx ved koncentrering og regulering af pH-værdien af filtratet fra ketonudfældningen til ca. 4 ved tilsætning af en mineralsk syre såsom svovlsyre eller saltsyre, og ekstraktion med n-butanol eller en flydende alkohol med højere molekylvægt. Der kan praktisk anvendes 1 til 8 rumfang opløsningsmiddel.

Efter denne ekstraktion koncentreres den vandige fase fortrinsvis ved ca. pH 6,5, og den kan renses yderligere ved 146764 12 ekstraktion af det ønskede antibiotikum over i et fenolisk opløsningsmiddel, fx selve forbindelsen fenol eller en kresol, fortrinsvis efter nedsættelse af pH-værdien til ca. 4 med en mineralsyre. Det fenoliske opløsningsmiddel indeholder med fordel en base såsom Ν,Ν-dimetylanilin og et vandublandbart opløsningsmiddel såsom kloroform eller kulstoftetraklorid. Ekstraktionen udføres med fordel flere gange med anvendelse af ca. 2/3 rumfang opløsningsmiddel for hver ekstraktion. Ekstrakterne kan derefter forenes og der kan tilsættes vand, fortrinsvis ca. 1/15 af opløsningsmiddelrumfanget, for at danne en særskilt fase. Antibiotiket kan derefter tilbageekstraheres ved tilsætning til det vandige lag af en base, fortrinsvis et alka-limetalhydroxyd som fx litiumhydroxyd, eller et jordalkalime-talhydroxyd som fx bariumhydroxyd eller kalciumhydroxyd, til en pH-værdi på ca. 6,5. Det vandige lag skilles fra det fenoliske lag og tilbageekstraktionsprocessen gentages fordelagtigt, hvorefter de vandige ekstrakter slås sammen. Efter fraskillel-se af alle andre bundfald end clavulanat, fx bariumsulfat, kan eventuelt tilbageværende fenolisk opløsningsmiddel fjernes fra den vandige opløsning ved ekstraktion med et vandublandbart opløsningsmiddel såsom æter, kloroform eller kulstoftetraklorid, og til udvinding af saltet af antibiotiket kan den vandige fase frysetørres eller forstøvningstørres ved pH 6,5.

Yderligere rensning kan udføres ved konventionel teknik såsom kromatografi, navnlig ved anvendelse af sådanne materialer som "Sephadex" ®(et tværbundet dekstran). Således kan antibiotiket, der på dette trin normalt vil have form af et salt, fx bariumsalt, påføres en kolonne af "Sephadex", fx "Sephadex" G 15, og elueres med vand, idet de fraktioner der indeholder væsentlig antibiotisk aktivitet forenes til påfølgende udvinding af et salt, fx ved frysetørring.

Omdannelse af litiumclavulanat til clavulansyre og andre salte

Renset litiumclavulanat fremstillet som beskrevet foran kan omdannes til andre salte ved ionbytningsprocesser, fx ved hjælp af en ionbytterharpiks. Således kan fx det vandige litiumsalt anbringes på en kationbytterharpiks, fx "Bio Rad AG50X8" i kationform, idet kationen er den som ønskes i clavulansyresal- 146764 13 tet, fx natrium eller kalium, efterfulgt af eluering, fx med vand.

Fri clavulansyre kan dannes ved syrning, fx til pH ca.

2,6, af en vandig opløsning af litiumsaltet, fortrinsvis med høj ionstyrke, fx mættet med natriumklorid eller ammoniumsulfat i nærværelse af et vandublandbart opløsningsmiddel for clavulansyre, fx et ester-opløsningsmiddel såsom ætylacetat. Om nødvendigt kan den vandige fase ekstraheres med yderligere opløsningsmidler og ekstrakterne forenes. I almindelighed vil en hvilken som helst syre, der giver tilstrækkelig lav pH-vær-di, egne sig til syrningen, fx en mineralsk syre såsom saltsyre. Opløsningsmidlet kan derefter fjernes til frembringelse af den fri syre, sædvanligvis i form af en olie.

Opløsningen af den fri syre i det vandublandbare opløsningsmiddel kan bruges til at fremstille mange forskellige salte ved ekstraktion med en vandig opløsning af vedkommende base og isolation af saltet derfra. Det kan være nødvendigt at filtrere fast materiale fra den vandige fase før man skrider til at isolere saltet.

Da den fri syre er forholdsvis ustabil, bør den fortrinsvis bruges så snart som muligt efter dannelse deraf, fx til fremstilling af salte eller andre derivater.

Opfindelsen skal i det følgende forklares udførligt, dels ved et eksempel på fremstilling af udgangsmaterialet for litiumclavulanat, dels nogle eksempler på fremstilling af dette og dels eksempler på litiumsaltets anvendelse som mellemprodukt.

Clavulansyreindhold i procesvæsker og faste stoffer er her målt ved:

Ultraviolet spektroskopi

Vandige opløsninger af clavulansyre og dens salte udviser meget lave uv-absorptioner ved over 230 nm, og fx den molære ekstinktionskoefficient ε ved 280 nm er ca. 60. Ved opløsning i alkali udvikler der sig imidlertid hurtigt en intens uv-absorption ved 259+1, og den kan bruges til bestemmel se af clavulansyre og/eller dens salte. Til sådanne bestemmelser afvejes faste stoffer nøjagtigt og opløses i tynd natrium-hydroxyd (0,1M) til frembringelse af et kendt rumfang opløs- 146764 14 ning svarende til ca. 0,01 mg/ml clavulansyre. Den optiske tæthed af opløsningen ved et absorptionsmaximum ved eller på ca.

259 nm måltes på et spektrofotometer; faste urenheder kan beregnes under antagelse af at ε for ren clavulansyre er 16.700.

Molære ekstinktionskoefficienter kan beregnes ud fra E^ værdier, dvs. ekstinktionskoefficienterne for en l%s opløsning i en 1 cm celle. På tilsvarende måde blev procesvæsker, om nødvendigt efter fjernelse af organiske opløsningsmidler, fortyndet præcist med fortyndet natriumhydroxyd for at give lignende koncentrationer af alkali og clavulansyre, herudfra bestemtes clavu-lansyrekoncentrationen i den oprindelige væske på den ovenfor beskrevne måde. Værdier for rå faststoffer og procesvæsker blev korrigeret for absorption af urenheder ved hjælp af opløsninger af samme koncentration i vand.

Udgangsmateriale 1 a) Podekulturudvikling 10 ml sterilt destilleret vand sattes til en 14 dage gammel skråkultur på malt/gærekstrakt-agar af Streptomyces cla-vuligerus NRRL 3585 og der fremstilledes en suspension.

En portion på 1,5 ml af denne suspension brugtes til podning af 150 ml af et medium indeholdende (udtrykt i % v/r, dvs. således at forholdet mellem enheder af faste stoffer og væsker er som mellem g og ml): % v/r sakkarose 2,0 distillers' solubles 1,5 gærekstrakt 0,5 K2HP04 0,02 trypton 0,5 glycerol 1,0 og vand til 100% i en 2 liters langhalset, rund, fladbundet kolbe.

Denne kolbe inkuberedes ved 26°C i 48 timer med 220 opm på en roterende ryster med et 5 cm slag. 150 ml af denne podekultur brugtes til podning af 4 liter af et medium indeholdende: U6764 15 % v/r soj abønnemel 2,1 distillers' solubles 0,52 kaseinhydrolysat 0,52

FeS04, 7H20 0,01 opløselig stivelse 4,7 glukose 0,78 og vand til 100% i en 5 liter stor gæringsbeholder med luftning (0,75 vol/vol/min), og holdtes på 28°C under omrøring (750 opm) i 20 timer.

b) Gæring 7,5 liter af det 20 timer gamle inokulum fra afsnit (a) ovenfor podedes i 150 liter af et medium indeholdende: % v/r opløselig stivelse 4,7 sojabønnemel 2,1 distillers' solubles 0,52 kaseinhydrolysat 0,52 glukose 0,78

FeS04, 7H20 0,01 polyglykol (P.2000 fra Dow Chemical Co.) 0,05 og vand til 100% i en 220 liter stor beholder og der gæredes her i 90 timer ved 28°C under luftning (2 vol/vol/min) og omrøring (350 opm).

Fremstilling af bariumsaltet

Et gæret medium vundet som beskrevet foran renses på følgende måde: 135 liter gæringsmedium med pH 6,25 klaredes på en centrifuge til frembringelse af en ovenstående væske i en mængde på 112 liter og med pH 6,3. Denne førtes gennem en kolonne med 25 liter trækul og kolonnen gennemvaskedes med 50 liter vand. Der udhældtes forsigtigt 10 liter acetone i toppen af lejet og eluering påbegyndtes. Dette efterfulgtes af 60 liter 90%s vandig acetone. Eluatet opsamledes i fraktioner (1x10 liter, 2x25 liter).

Hver fraktion destilleredes under nedsat tryk for at fjerne acetone. Den tilbageværende vandige opløsning regulere- 146764 16 des til pH 6,0 med 1M natriumhydroxyd. Fraktionerne forenedes derefter og inddampedes yderligere til 2,9 liter, overførtes til en beholder og reguleredes op til 3,3 liter med vaskevæsker fra kogeren. Der sattes 17 liter acetone og 500 g filterhjælp "Celite" ®535 til koncentratet under kraftig omrøring.

Den resulterende suspension filtreredes og kagen vaskedes med 4 liter 85%s vandig acetone.

Filtratet og vaskevæskerne forenedes og kombinationen inddampedes under nedsat tryk til 4,0 liter. pH reguleredes fra 5,65 til 6,0 med 1M natriumhydroxyd, og inddampningen fortsatte indtil rumfanget var 1,0 liter. Det resulterende koncentrat syrnedes til pH 4,0 med 20%s svovlsyre og vaskedes med 4 x 750 ml, og 1 x 500 ml butan-l-ol. Opløst butan-l-ol udde-stilleredes af den vandige fase under vakuum.

Efter at være blevet reguleret til pH 4,2 med 20%s svovlsyre ekstraheredes koncentratet tre gange med en blanding af 265 ml flydendegjort fenol B.P. (dvs. britisk farmakopé-kvalitet), 75 ml kulstoftetraklorid og 25 ml Ν,Ν-dimetylanilin. pH reguleredes til 4,2 for hver ekstrakt. De forenede opløsningsmiddelekstrakter omrørtes med 250 ml vand og pH reguleredes til 6,5 med 70 ml mættet vandigt bariumhydroxyd. Efter adskillelse af faserne genekstraheredes opløsningsmidlet med 200 ml vand og 7 ml mættet vandigt bariumhydroxyd.

De forenede vandige faser vaskedes med 3 x 200 ml di-ætylæter, reduceredes i vakuum til 200 ml og frysetørredes til 29,4 g lysebrunt fast stof. E^ = 152. Renhed under 25%.

Eksempel 1 i) Fremstilling af kaliumsaltet a) 8,83 g råt bariumsalt (renhed < 25%) fra udgangsmateria le 1 sattes til 50 ml mættet vandig opløsning af (NH^^SO^.

Der tilsattes 50 ml ætylacetat og blandingen omrørtes. Der indsattes et pH-prøveinstrument i blandingen og pH reguleredes fra 6,8 til 2,6 med ca. 15 ml 1M H2S04· Den vandige opløsning 146764 17 skiltes fra ætylacetatet og omrørtes igen med en frisk portion ætylacetat, 50 ml. De to ætylacetatekstrakter forenedes, der tilsattes 100 ml destilleret vand og blandingen omrørtes i nærværelse af pH-prøveinstrumentet. Der tilsattes ca. 40 ml mættet opløsning af et kalciumhydroxyd for at bringe blandingens pH-værdi til 6,6. Den vandige opløsning skiltes fra ætylacetatet, filtreredes gennem filterhjælp og frysetørredes, hvorved der fremkom 1,44 g fast kalciumsalt.

b) Det faste stof fra (a) opløstes i 15 ml destilleret vand, filtreredes gennem et milliporefilter og påførtes en kolonne indeholdende "Sephadex" ®G15, pakket i vand til et leje med en højde på ca. 150 cm og en diameter på 2,5 cm. Der foretoges eluering med destilleret vand og opsamledes fraktioner på 20 ml. Fraktionerne bestemtes efter tyndlagskromatografering (tic; cellulose, "Eastman"®- "Kodak"® 6065 plader; opløsningsmiddel acetonitril/vand 7:3) ved overlejring med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus. Fraktionerne 33-37 forenedes og frysetørredes, hvorved der fremkom 490 mg. Det faste stof holdtes over ^ va^uum i 60 timer. Kalciumsaltet fra dette eksempels afsnit (b) havde følgende karakteristika: pKa. pKa-værdien for den tilsvarende syre fandtes at være ca.

2,4 ved potentiometrisk titrering af saltet.

Optisk drejning. [a]D ved 22°C: + 44,9° (koncentration 0,287 g/100 ml vand).

UV-spektrum. En prøve på 0,00148 g, der var blevet opløst i 100 ml 0,1M NaOH, udviste absorptionsmaximum, λ , ved 258 nm med en E^-værdi på ca. 550.

IR-spektrum. Det infrarøde spektrum for en prøve i nujol udviste absorptionsmaxima ved bølgetal (cm j som følger: 3300 s,br 2330 w 1788 s 1692 m 1604 s 1404 s 1305 s 1190 m 1118 m 1082 m 1060 m 1042 m 1012 m 992 m 968 m 892 m 848 w 790 w 740 m 654 w 146764 18 (s, m, br og w betegner henholdsvis stærk, middel, bred og svag intensitet).

Det fulde spektrum er vist i tegningens figur 3.

NMR-spektrum. Det proton-kærnemagnetiske resonansspektrum i form af opløsning af prøven i tungt vand udviste grupper af toppe (τ-værdier) centreret ved.ca. 4,31, 5,10, 5,85, 6,46 og 6,91.

Tyndlagskromatografi. Portioner af prøven, opløst i vand, på-førtes på begyndelsen af enten "Eastman"-"Kodak" cellulose TL plader (med plastbagside EK 6065) eller "Eastman"-"Kodak" sili-ka TL plader (med plastbagside, EK 6060). Pladerne fremkaldtes med opløsningsmiddel ved stuetemperatur og lufttørredes derefter og blev overlejret med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus. Rf-værdier, beregnet som afstanden fra begyndelsen til midten af hver zone af inhiberet bakterievækst, divideret med afstanden fra begyndelsen til opløsningsmiddelfronten, angives nedenfor for fem systemer.

Opløsningsmiddel Bæremateriale Rf propan-l-ol/vand 7:3 cellulose 0,60 butan-1-ol/eddikesyre/vand 3:1:1 " 0,64 acetonitril/vand 7:3 " 0,68

Acetonitril/vand/propan-2-ol 1:1:1 " 0,87 butanol-l-ol/eddikesyre/vand 3:1:1 silika 0,63

Papirionoforese. Portioner af prøven underkastedes ionoforese på "Whatman" ® 541 papir i 1 time med 400 volt påført over 20 cm. Aktiviteten, konstateret ved overlejring af det lufttørrede papir med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus, havde en mobilitet i forhold til cyanokobalamin på 4,5 cm hen-imod anoden ved pH 4,8 (0,01M acetat), pH 6,9 (0,01M fosfat) og pH 9,5 (0,01M pyrofosfat).

ii) Fremstilling af litiumsaltet

1 g af kalciumsaltet (E^ 590) fremstillet som beskrevet ovenfor i (i)(b) opløstes i 10 ml vand og der tilsattes 10 ml af en mættet opløsning af litiumklorid i vand. Krystallisation indtrådte uden skrabning eller podning. Efter afkøling til 0°C

146764 19 filtreredes krystallerne og vaskedes med 5 ml ætanol, 5 ml acetone og 2 x 5 ml diætylæter. Krystallerne tørredes under nedsat tryk til 0,1 mm Hg over silikagel i 2 timer hvorved der fremkom 495,5 mg fast litiumsalt. Dette salt havde renhed over 95% og følgende karakteristika:

Elementæranalyse. Fundne værdier (middelværdier anført i parentes) : C 45,5, 45,8 (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1); Li 3,2%. Svovl blev ikke konstateret ved en metode angivet af B.D. Cheronis og J.B. Entrikin (1947) i Semimicko Qualitative Analysis side 93, Crowell, New York. Sammensætningen CgHgNOgLi, 1/4 H2O fordrer C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31%.

Den værdi for Li-analysen der er anført ovenfor, 3,2%, bestemtes ved atomabsorptionsspektrofotometri. Sulfateret aske var 26,8%, der beregnet som LI2SO4 er ækvivalent til 3,38% litium.

pKa. pKa-værdien for den tilsvarende syre viste sig at være ca. 2,3 ved potentiometrisk titrering af saltet.

Optisk drejning. [a]^-værdien for en 0,145% v/r vandig opløsning ved 24°C var + 66,0°.

Ultraviolet spektrum. UV-absorptionsspektret for en 0,00091%s opløsning i 0,1M natriumhydroxyd havde absorptionsmaximum (λ„ ) ved 258 nm med en E^-værdi på 788.

max 1 c

Infrarødt spektrum.IR-spektret i nujol udviste absorptionstoppe (cm 1) ved ca.: 3420 (m) 1402 (s) 1200 (w) 1026 (m) 880 (w) 3012 (w) 1338 (m) 1129 (m) 992 (m) 850 (w) 1765 (s) 1325 (s) 1101 (m) 976 (m)' 734 (m) 1683 (s) 1300 (m) 1062 (m) 950 (s) 708 (w) 1618 (s) 1224 (w) 1048 (s) 900 (m)

Det fulde spektrum er vist i tegningens figur 1.

NMR-spektrum. Et proton-kærnemagnetisk resonansspektrum ved 100 MHz for litiumsaltet i opløsning i tungt vand udviste toppe (τ-værdier med multipler og koblingskonstanter, Hz, i parentes), centreret ved ca. 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd, 3 og 17) og 6,89 (d,17).

U6764 20

Her betegner s, d, dd, t og m henholdsvis singlet, dublet, dobbelt dublet, triplet og multiplet.

iii) Omkrystallisation af litiumsaltet 0,1 g af litiumsaltet fremstillet som beskrevet ovenfor under (ii) opløstes i 1,0 ml vand og fortyndedes omhyggeligt med 19 ml isopropanol. Produktet krystalliserede langsomt ved 0°C og indhøstedes i to udbytter ved indkogning under nedsat tryk til 5 ml for andet udbyttes vedkommende. Krystallerne af litiumsaltet tørredes over silikagel i vakuum i 3 døgn.

Udbytte 1. 20,0 mg Xmax 259 nm, E^ = 814 i natriumhydroxydop-løsning (0,1M) ved 10 pg/ml.

Elementæranalyse

Beregnet for CgHgNO^Li,1/4 I^O: C 45,84 H 4,06 N 6,68

Fundet: C 46,2 H 4,10 46,0 3,85 N 6,8 6,7%.

Udbytte 2. 67,0 mg. ^max 259 nm, E^ = 800 i natriumhydroxyd (0,IN) ved 10 μg/ml.

Elementæranalyse

Beregnet for CgHgNOgLi,1/4H20: C 45,84 H 4,06 N 6,68 Li 3,31

Fundet: C 46,15 H 3,9 N 6,65 Li 3,4% (sulfateret aske) C 46,5 H 4,0 N 6,5

Eksempel 2 30 g af bariumsaltet (E^ = 274; renhed <45%, fremstillet som udgangsmateriale 1) opløstes i 40 ml vand og der tilsattes 300 ml mættet ammoniumsulfatopløsning. Opløsningens pH-værdi reguleredes til 2,3 med 23,0 ml 20%s svovlsyre og eks-traheredes derefter med 2 x 300 ml ætylacetat. Der sattes 200 ml vand til de forenede ekstrakter. Blandingen omrørtes kraftigt og der tilsattes 89,3 ml 1M natriumhydroxydopløsning indtil pH-værdien nåede 6,8. Den vandige fase fraskiltes og inddampedes under nedsat tryk til 33 ml. Der sattes 770 ml bu-tan-l-ol til det vandige koncentrat og derefter gennemblande-des der, opvarmedes til 40°C og rystedes kraftigt. Uopløseligt U6764 21 materiale frafiltreredes og genekstraheredes med vand/butan-l-ol 1:23 (rumfangsforhold) indtil alt opløste sig. De forenede opløsninger afkøledes til 4°C natten over. Det dannede krystallinske faste stof opsamledes ved filtrering, vaskedes med butan-l-ol og acetone og lufttørredes til 3,34 g af natriumsaltet (E^ = 648).

2,92 g af dette natriumsalt opløstes i 20 ml vand og filtreredes. Filtratet omrørtes ved 0°C mens der indførtes 20 ml litiumkloridopløsning (mættet ved 20°C) i løbet af 5 minutter. Omrøring og afkøling fortsattes i en time, hvorefter krystallerne indhøstedes ved filtrering, vaskedes med 20 ml ætanol, 2 x 20 ml acetone og 2 x 25 ml diætylaster og lufttørredes til frembringelse af 2,275 g af litiumsaltet som hvide, langag-tige flade prismer (E^ = 770). Renhed over 90%.

Eksempel 3 7,99 g råt bariumsalt (E^ 288), renhed < 45%, fremstillet som udgangsmateriale 1, opløstes i 60 ml vand og filtreredes. Filtratet behandledes portionsvis med 4,0 g litiumsulfat under omrøring ved stuetemperatur indtil der ikke fremkom reaktion for barium på en ydre testplade med natriumrhodionat. Suspensionen klaredes ved centrifugering og den ovenstående væske dekanteredes og indkogtes til ca. 35 ml under nedsat tryk. Der tilsattes portionsvis 9,0 g litiumklorid under omrøring og afkøling; efter 1 time ved 0°C indhøstedes litiumsaltet ved filtrering, vaskedes med 10 ml ætanol, 2 x 25 ml acetone og 2 x 20 ml diætylæter og lufttørredes i filtertragten til frembringelse af 1,590 g hvide prismer (E^ = 790). Litiumclavulanatets renhed var over 95%.

Anvendelseseksempel A

Fremstilling af natriumsaltet 3,5 g af litiumsaltet fremstillet som i eksempel 1 (ii) opløstes i 20 ml destilleret vand og påførtes en kolonne indeholdende 50 ml "Bio-Rad" AG50x8 kationbytterharpiks (Na+; 200-400 mesh størrelse). Elueringen skete med vand og der opsamledes fraktioner på 8 ml. Fraktionerne bestemtes efter på- 146764 22 føring af portioner til papir ved overlejring med næringsagar indeholdende Staphylococcus aureus. Aktive fraktioner (4 til 13) forenedes og frysetørredes.

Det frysetørrede faststof opløstes i destilleret vand til 19 ml opløsning, den rystedes med 450 ml butan-l-ol og opvarmedes på et vandbad indtil opløsningen var næsten klar. Den varme opløsning filtreredes gennem et sinter for at fjerne gult fast Stof, og filtratet holdtes på 4°C i 60 timer. De derved dannede krystaller filtreredes, vaskedes med 2 x 10 ml butan-l-ol og derefter med 2 x 10 ml acetone og tørredes under nedsat tryk ved 40°C i en time til 2,18 g fast stof. Det faste stof omkrystalliseredes fra vand/butan-l-ol 1:23,3 som beskrevet i eksempel 2. Krystallerne tørredes under nedsat tryk over silikagel ved 44°C i 1 1/2 time, og herved vandtes der 1,8 g fast natriumsalt.

Det faste stof var hygroskopisk. Det maledes med en støder i en morter og man lod det optage atmosfærisk vand ved 18°C. Efter at der var optaget ca. 22 vægt% vand nåedes der ligevægt.

Dette salt havde følgende karakteristika:

Elementæranalyse af det ækvilibrerede fugtige faststof: Fundet (idet middelværdier anføres i parentes) C 33,3, 33,2 (33,25); H 4,6, 4,6 (4,6); N 4,6, 4,7 (4,65); Na 7,3 (ved absorptions-spektrofotometri), 7,9 (beregnet ud fra sulfateret aske); vand 21,95%. Sammensætningen CgHgO^N Na, 41^0 fordrer C 32,76; H 5,46; N 4,78; Na 7,8; vand 24,57%.

Metalanalyse 1) Fundet ved atomabsorptionsspektrofotometri: Na 7,3+0,2% (det er den værdi der er anført under elementæranalysen).

2) Under den antagelse af den sulfaterede aske er Na2S0^, beregnedes Na-indholdet til 7,9%.

Optisk drejning. [a]D~værdien for en 0,134% v/r vandig opløsning ved 24°C var +47°.

Ultraviolet spektrum. UV-absorptionsspektret for en 0,00098%s opløsning i 0,1M NaOH udviste absorptionsmaximum (λ_=) ved 258 nm med en værdi for på 555.

Infrarødt spektrum. IR-spektret i nujol udviste absorptionstoppe (cm *) ved ca.

U6764 23 3400 s 1592 s 1288 m 1080 w 986 s 850 w 3300 s 1396 s 1206 w 1060 m 967 m 802 w 1792 s 1348 m 1190 m 1048 m 945 w 753 m 1690 s 1310 s 1138 m 1015 s 902 m 1665 m 1302 sh 1120 m 998 m 880 w

Det fulde spektrum er vist i tegningens figur 2.

NMR-spektrum. Det protonmagnetiske resonansspektrum fra en opløsning i tungt vand udviste grupper af toppe (τ-værdier) centreret ved ca. 4,28, 5,07, 5,82, 6,44 og 6,88.

Anvendelseseksempel B

Fremstilling af kaliumsaltet 3,0 g af litiumsaltet, fremstillet som beskrevet i eksempel 1 (ii) opløstes i 100 ml vand og førtes gennem en 450 ml stor kolonne af "Dowex" 50W x 2 ionbytterharpiks i kaliumform ("Dowex" er et i Danmark indregistreret varemærke). Et forløb på 150 ml blev kasseret. De næste 400 ml eluat opsamledes og inddampedes til 15 ml under nedsat tryk. Der tilsattes 340 ml butan-l-ol og blandingen opvarmedes og rystedes godt.

Noget uopløseligt fast stof frafiltreredes. Filtratet inddampedes under nedsat tryk til 200 ml og opbevaredes derefter ved 4°C natten over. Det krystallinske bundfald filtreredes, vaskedes med 2 x 10 ml butan-l-ol, 2 x 50 ml acetone og 2 x 50 ml diætylæter og tørredes til slut i en vakuum-desikkator ved stuetemperatur. Udbytte 2,34 g kaliumsalt (E?- = 704). Værdien 1 1 for E1 bestemtes ved at man opløste 7,1 mg af kaliumsaltet i 100 ml vand. Denne opløsning fortyndedes 1:10 med 0,1M na-triumhydroxyd til en sluttelig opløsning på 7,1 μg/ml.

Elementæranalyse. Fundet (med middelværdier angivet i parentes): C 40,0, 40,14 (40,07); H 3,5, 3,55 (3,53); N 6,0, 5,82 (5,91); K (ved absorptions-spektrofotometri) 16,0 (ved bestemmelse på sulfateret aske) 15,9; vand 1,75, 1,95 (1,85)%. Sammensætningen CgHgNO^K,1/41^0 fordrer C 39,7; H 3,5; N 5,8; K 16,2; vand 1,96%.

23°

Optisk drejning. Værdien af [α]β for en 0,276%s v/r vandig opløsning var 58,4°.

146764 24

Kalcium-, barium- og magniumsaltene af clavulansyre fremstilledes ud fra litiumclavulanat på lignende måde og viste sig at have E^-værdier på henholdsvis 530, 576 og 713.

Anvendelseseksempel C

Fremstilling af fri clavulansyre 500 mg af litiumsaltet af clavulansyre, fremstillet som i eksempel l(ii), fordeltes mellem 10 ml ætylacetat og 10 ml mættet vandigt natriumklorid. Der tilsattes 1 ml 2N saltsyre og blandingen rystedes kortvarigt. Den vandige fase fraskiltes og vaskedes med 10 ml ætylacetat og de forenede organiske ekstrakter vaskedes med 15 ml mættet vandigt natriumklorid. Den resulterende organiske opløsning tørredes over natriumsulfat og inddampedes næsten til tørhed, hvorved der vandtes 352 mg af den fri syre som en olie indeholdende ca. 0,5 mol ætylacetat.

Forbindelsen havde følgende karakteristika: 24 o [a]^ = 54,5 (c = 1,0 i DMSO); λ af en 0,00098%s L JD max opløsning i vandigt 0,1N NaOH er 258 nm (E^ = 590); infrarødt spektrum i nujol udviser toppe ved bl.a. 3350, 1790 og 1722 cm *"; NMR-toppe (DMSO-dg) indbefatterχ 4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s), 5,23 (t, 7 Hz), 5,97 (d, 7 Hz), 6,37 og 6,93 (dd, 3 og 17 Hz; d, 17 Hz); toppe centreret ved χ 8,82, 8,00 og 5,95 viste at prøven indeholdt ca. 0,5 mol ætylacetat pr. mol clavulansyre. Disse værdier viser at prøven indeholdt mindst 85 vægt% clavulansyre.

Anvendelseseksempel D

Fremstilling af ammoniumsaltet

En kolonne på 240 ml af "Dowex" ®50W omdannedes til ammoniumformen ved behandling med ammoniumsulfat og vaskedes fri for sulfat med vand. 1,0 g af litiumsaltet af clavulansyre, fremstillet som i eksempel l(ii), opløstes i 15 ml vand og påførtes på kolonnen, og denne fremkaldtes med vand. Der blev udtaget fraktioner på 25 ml og de afprøvedes med hensyn til UV-absorption i 0,1N natriumhydroxyd. De aktive fraktioner (nr. 4-7) forenedes og inddampedes til næsten tørhed (2 ml) under nedsat tryk og der tilsattes 85 ml n-butanol. Blandingen 146764 25 destilleredes omhyggeligt ved 25°C under 0,1 mm Hg-tryk indtil der udfældedes et krystallinsk materiale. Ammoniumsaltet indhøstedes ved filtrering, vaskedes med ganske lidt ætanol og acetone og vaskedes til slut med diætylæter og tørredes ved 0,1 mm Hg i 6 timer hvorved der fremkom 0,54 g smudsighvide krystaller. = +60,1° (c = 0,39% i vand); λ (0,1N na- triumhydroxyd, 8,8 μg/ml) 258 nm (E^ : 745); IR-spektre i nujol omfatter toppe ved 3360, 1780, 1700 og 1580 cm 1; τ-værdi-er (5% D2O) indbefatter 4,27 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,09 (t, 7Hz), 5,84 (d, 7Hz), 6,43 (dd, 17Hz, 3Hz) og 6,89 (d, 17Hz).

Beregnet for CgHgNO^NH^: C 44,4 H 5,6 N 13,0 Fundet: C 44,4 H 5,6 N 13,3%.

Ved Karl Fischer analyse blev der konstateret spor af vand (0,6%).

Anvendelseseksempel E

Fremstilling af metylaminsaltet

En kolonne på 200 ml af "Amberlite"®IR-120 H+ omdannedes til metylammoniumformen ved behandling med 0,5M metyl-aminopløsning i vand. Den vaskedes til neutralitet med vand og der indførtes 3,0 g metylammoniumklorid i 10 ml vand. Kolonnen vaskedes fri for klorid med vand og var så parat til brug.

1,50 g af litiumsaltet af clavulansyre, fremstillet som i eksempel l(ii), opløstes i 15 ml vand og indførtes på toppen af kolonnen. Kolonnen fremkaldtes i vand og der opsamledes fraktioner på 25 ml.

Fraktioner nr. 3-7 forenedes (161 ml med vaskevæsker) og inddampedes ved 25°C/1,0 mm Hg til ca. 2 ml, hvorpå der tilsattes 200 ml n-butanol. Den klare opløsning inddampedes under lignende betingelser til 20 ml, hvorved krystallisation fandt sted. Krystallerne indhøstedes ved filtrering efter en time ved 2°C, de vaskedes med 2 x 15 ml diætylæter og tørredes i 3 timer ved 1 mm Hg til 1,2 g af metylaminsaltet som klynger 2 3 af hvide, langstrakte prismer. [a] = +56,1° (c = 0,23% i υ 1

vand); λ (0,1N natriumhydroxyd, 9,5 ug/ml) 260 nm (E, = max -L

584); IR-spektret i nujol omfatter toppe ved 2500, 1790, 1692, 1632 og 1576 cm "S τ-værdier (8% D20) indbefatter 6,40 og 6,86 146764 26 (dd, 17Hzf 3Hz; d, 17Hz), 4,24 (d, 3Hz), 5,06 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s).

Beregnet for CgH-^NjOg: c 47'° H 6,1 N 12,2 Fundet:. C 46,7 H 6,1 N 12,5%.

Anvendelseseksempel F

Fremstilling af piperidinsaltet

En kolonne af ionbytterharpiks (200 ml, fra "Bio-Rad" Laboratories, AG 50W x 2, 100-200 mesh H+ formen) omdannedes til piperidiniuraformen med en opløsning af 75 ml piperidin i 1500 ml vand. Harpiksen vaskedes til neutralitet med vand og behandledes med 3 g piperidiniumklorid i 10 ml vand. Kolonnen vaskedes fri for klorid med vand og var parat til brug.

1,50 g af litiumclavulanat, fremstillet som i eksempel 1(ii), indførtes på toppen af kolonnen i 15 ml vand og kolonnen fremkaldtes i vand idet der blev udtaget 25 ml store fraktioner. Fraktionerne nr. 3-6 forenedes med vaskevæsker og udgjorde herved 172 ml.

Opløsningen inddampedes til næsten tørhed ved 35°C/1,0 mm Hg og der tilsattes rent toluen. Den olieagtige suspension inddampedes til tørhed under nedsat tryk som ovenfor og det derved vundne krystallinske faste stof tritureredes med 90 ml ætylacetat. Det krystallinske piperidiniumsalt indhøstedes ved filtrering og vaskedes med 3 x 30 ml ætylacetat og resterende opløsningsmiddel fjernedes ved 0,1 mm Hg i løbet af 3 timer, 24 hvorved der fremkom 1,775 g svagt smudsighvide prismer. [a]D = +42,2° (c = 0,35% i vand); λ = 0,1N natriumhydroxyd, 10 μg/ml) 259,5 nm (E^ = 474); IR-spektrum i nujol indbefatter toppe ved 3380, 2540, 1782, 1682 og 1608 cm t-værdier (8% D20) indbefatter 6,90 (d, 17Hz), 6,44 (dd, 3Hz og 17Hz); 4,28 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (kompleks multiplet), 8,0-8,5 (kompleks multiplet).

Beregnet for C^2H20N2°5'®'^H20: C ^,9 H 7,4 N 9,5

Fundet: C 52,8 H7,2 N 9,3%.

27

14676A

Anvendelseseksempel G

Fremstilling af triætylaminsaltet

En kolonne af ionbytterharpiks ("Bio-Rad" 50W) som beskrevet i anvendelseseksempel F omdannedes til triætylammonium-formen med en opløsning af triætylamin i vand (0,5N, 1,5 liter) og vaskedes til neutralitet med vand. En opløsning af 3 g tri-ætylammoniumklorid i 15 ml vand indførtes på kolonnen, kolonnen vaskedes fri for klorid med vand og var klar til brug.

Derefter indførtes 1,5 g litiumclavulanat, fremstillet som i eksempel l(ii), på toppen af kolonnen i 15 ml vand og kolonnen fremkaldtes i vand, idet der blev udtaget 25 ml store fraktioner. Fraktionerne 4-9 blev forenet og udgjorde sammen med vaskevæskerne 175 ml.

Opløsningen indkogtes under nedsat tryk (35°C/1,0 mm Hg) og gav en olie som indkogtes tre gange med toluen under de samme betingelser. De resulterende krystaller blev brudt op under 50 ml ætylacetat, indhøstedes ved filtrering, vaskedes med to gange 20 ml diætylæter og befriedes for tilbageværende opløsningsmiddel i en desikkator i 3 timer ved 0,1 mm Hg, hvorved der vandtes 1,588 g af triætylammoniumsaltet som svagt 25 o smudsighvide prismer, [a] = +44,3 (c = 0,22% i vand); λ d ^ max (0,IN natriumhydroxyd, 9,7 pg/ml) 258 nm (E^ = 485); IR-spek-trum i nujol indbefatter toppe ved 3250, 2080, 1784, 1700 og 1640 cm '''; τ-værdier (10% D20) indbefatter 6,41 og 6,87 (dd, 17Hz, 3Hz; d, 17Hz), 4,26 (d, 3Hz), 5,07 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,07 (s), 8,74 (t, 7Hz) og 6,78 (q, 7Hz).

Beregnet for c14H24N205,1/4H20: C 55,2 H8,0 N9,2 Fundet: C 55,2 H 7,9 N 9,2%.