CH630118A5 - Process for the preparation of the antibiotic N-acetylthienamycin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums in Form eines neuen antibiotischen Stoffs, der hier als N-Acetylthienamycin bezeichnet wird. Das nach dem Verfahren erhältliche neue Antibioticum kann in verdünnter Form, als rohes Konzentrat oder in reiner Form vorliegen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines neuen und wertvollen Antibioticums, das in hochgradig wirksamer Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmt, durch Fermentation von Nährmedien mit einem Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen.

Das neue Antibioticum N-Acetylthienamycin, wird erfin-dungsgemäss hergestellt, wie im Patentanspruch 1 definiert. Die Züchtung von Streptomyces cattleya in einem Nährmedium führt auch zur Bildung von Thienamycin. Die Acetylierung von Thienamycin stellt ein anderes Verfahren zur Herstellung von N-Acetylthienamycin dar. Die Herstellung von Thienamycin durch Fermentation von Streptomyces cattleya ist in der USA-Patentanmeldung Serial No. 526 992 sowie in der USA-Patent-anmeldung Serial No. 613 822 beschrieben, die ihrerseits eine Teilfortsetzungsanmeldung der USA-Patentanmeldung Serial No. 534 382 ist.

Auf Grund umfangreicher klassifizierender Untersuchungen wurde der aus einer Bodenprobe isolierte Mikroorganismus Streptomyces cattleya als Actinomycete identifiziert und in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, als MA-4297 bezeichnet. Eine Kultur dieses Mikroorganismus ist am 18. November 1974 permanent in der Kultursanmlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utili-zation Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt worden und hat die Kennzeichnungsnummer NRRL 8057 erhalten.

Die charakteristischen morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften von Streptomyces cettleya sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Morphologie-Die Sporophoren sind kompakte Spiralen, die als Seiten- und Endverzweigungen an dem Luftmycel auftreten. Die Sporen sind ellipsoïdal bis zylindrisch in der Form, haben eine Grösse von 0,9 pi X 1,2 [x und kommen in Ketten von mehr als 10 vor.

Kulturmerkmale Tomatenbrei-Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - bräunlich, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Weiss ; Lösliches Pigment - keines.

Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar)

Vegetatives Wachstum - farblos, flach, sich ausbreitend ; Luftmycel - spärlich, weiss mit rosa Stich ;

Lösliches Pigment - keines.

Eieralbumin-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich mit grau-ochideenfarbe-

nem Anflug, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit helleren

Tönen von Orchideenfarbe und etwas Weiss ;

Lösliches Pigment - keines.

Glycerin-Asparagin-Agar

Vegetatives Wachstum — Rückseite — bräunlich mit grau-

rosa Anflug, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel - orchideenfaben (10 gc), gemischt mit etwas

Weiss;

Lösliches Pigment - keines.

Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar

Vegetatives Wachstum—bräunlich mit grau-rosa Anflug; Luftmycel—orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Rosa-

Weiss;

Lösliches Pigment—keines.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum—bräunlich ;

Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Rosa-

Weiss;

Lösliches Pigment - keines.

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum — bräunlich ;

Luftmycel - keines ;

Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums ; Melanin - negativ ;

H2S-Entwicklung - negativ.

Nähragar

Vegetatives Wachstum—hellbräunlich ;

Luftmycel - keines ;

Lösliches Pigment - keines.

Nährstärke-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben bis bräunlich ; Luftmycel — keines ;

Lösliches Pigment - keines ;

Hydrolyse von Stärke — mässig.

Nährgelatine-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben ;

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Luftmycel - keines ;

Lösliches Pigment - keines ;

Verflüssigung von Gelatine - massig.

Senkrechtes Gelatineröhrchen

Vegetatives Wachstum - bräunlich ;

Luftmycel — keines ;

Lösliches Pigment - keines ;

Verflüssigung von Gelatine - mässig.

Kartoffelpfropfen

Vegetatives Wachstum - mässig, bräunlich;

Luftmycel — spärlich, gräulich-rosa-weiss ;

Lösliches Pigment - keines.

Loefflersches Blutserum

Vegetatives Wachstum - rahmfarben ;

Luftmycel - keines ;

Lösliches Pigment - keines ;

Verflüssigung - keine.

Magermilch-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich ;

Luftmycel - spärlich, weisslich ;

Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Hydrolyse von Casein — positiv.

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum - bräunlich bis braun ;

Luftmycel - keines ;

Farbe - kein lösliches Pigment, Lackmusindikator wird bläulich;

Koagulation und/oder Peptonisierung - teilweise Peptoni-sierung, wird alkalisch.

Magermilch

Vegetatives Wachstum - bräunlich ;

Luftmycel - keines ;

Lösliches Pigment - keines ;

Koagulation und/oder Peptonisierung - teilweise Peptonisierung, wird alkalisch.

Tyrosin-Agar

Vegetatives Wachstum — bräunlich ;

Luftmycel - Mischung aus Orchideenfarben (10 gc) und

Weiss;

Lösliches Pigment - keines ;

Zersetzung von Tyrosin - positiv.

Alle oben angegebenen Merkmale wurden, falls nichts anderes gesagt ist, nach dreiwöchiger Inkubation bei 18 °C festgestellt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in «Color Harmony Manual», 4. Auflage (1958), herausgegeben von der Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces cattleya wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus drei Wochen lang bei 28 °C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat in einer Konzentration von 1 % enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Tabelle II zeigt die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces cattleya, wobei + ein gutes Wachstum, ± ein schlechtes Wachstum und-kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.

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Tabellen

Glucose

+

Maltose

±

Arabinose

—

Mannit

+

Cellulose

—

Mannose

±

Fructose

±

Raffinose

Inosit

—

Rhamnose

Lactose

-

Saccharose

■

Xylose

±

Für das Ausmass des Wachstums mit Temperaturänderungen, den Sauerstoffbedarf und die Wirkung auf Nitrat des Mikroorganismus gilt folgendes:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Glucose + Salzagar) ;

28 °C - gut

37 °C—mässig

50 °C - kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultur in Hefeextrakt-Glucose-Salzagar);

aerob.

Nitratreduktion - positiv

Das neue Antibioticum N-Acetylthienamycin, hergestellt gemäss der Erfindung, wird bei der aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch Beimpfung mit dem Organismus Streptomyces cattleya erzeugt. Für die Herstellung von N-Acetylthienamycin eignen sich die gleichen wässrigen Medien, die auch für die Herstellung anderer Antibiotica geeignet sind. Solche Medien enthalten von dem Mikroorganismus assimilierbare C- und N-Quellen sowie anorganische Salze.

Im allgemeinen können Kohlehydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannitund dergleichen, und Stärken, wie Getreide, z.B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, allein oder zusammen mit anderen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in dem Medium richtet sich teilweise nach den übrigen Bestandteilen des Mediums ; im allgemeinen variiert jedoch die Menge der Kohlehydrate zwischen 1 und 6 Gew.-% des Mediums. Diese C-Quellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere derartige C-Quellen können in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen können viele Proteinstoffe als N-Quellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete N-Quellen sind z.B. Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenbrei und dergleichen. Die N-Quellen können allein oder in Kombination miteinander in Mengen von 0,2 bis 6 Gew.-% des wässrigen Mediums angewandt werden.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien zugesetzt werden können, gehören die üblichen Salze, die Na-trium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Carbonationen und andere Iionen liefern. Hierher gehören auch Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.

Die in den Beispielen beschriebenen Kulturmedien dienen nur zur Erläuterung; man kann die verschiedensten Medien verwenden.

Die Fermentation wird zweckmässig bei einer Temperatur von 20 bis 37 °C durchgeführt; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man die Fermentation jedoch vorzugsweise bei einer Temperatur von 22 bis 30 °C durch. Der pH-Wert des für die Züchtung der Kultur von Streptomyces cattleya und für die Erzeugung von N-Acetylthienamycin geeigneten Nährmediums kann im Bereich von 6,0 bis 8,0 variieren.

Das neue Antibioticum N-Acetylthienamycin entsteht zwar sowohl in Oberflächenkultur als auch in Submerskultur. Erfin-dungsgemäss wird die Fermentation jedoch in Submerskultur durchgeführt.

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Die Fermentation zur Erzeugung des Antibioticums erfolgt zweckmässig in kleinem Massstab durch Beimpfen eines Nährmediums mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur und Fortführen der Fermentation nach der Übertragung auf ein Produktionsmedium über mehrere Tage hinweg in einer Schüttel- 5 maschine bei konstanter Temperatur von etwa 24 °C.

Man beginnt die Fermentation zweckmässig in einem mit Nährmedium beschickten sterilisierten Kolben über eine oder mehrere Stufen der Impfgutentwicklung. Als Nährmedium für die Impfgutstufe kann man jede Kombination von C- und io N-Quellen verwenden. Der Impfkolben wird z.B. einen Tag oder zwei Tage lang in einer konstanten Temperaturkammer bei etwa 28 °C geschüttelt, bis die Kultur zufriedenstellend ist, und ein Teil der entstehenden Kultur wird verwendet, um entweder ein zweistufiges Impfgut oder das Produktionsmedium zu is beimpfen. Zwischenstufige Impfkolben können, wenn sie verwendet werden, im wesentlichen in der gleichen Weise entwik-kelt werden, d.h. ein Teil des Kolbeninhalts der letzten Impfstufe wird verwendet, um das Produktionsmedium zu beimpfen. Die beimpften Kolben werden zweckmässig mehrere Tage lang 20 bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationsperiode kann der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert werden.

Für in grossem Massstab durchgeführte Arbeiten erfolgt die Fermentation vorzugsweise in geeigneten Fermentern, die mit 25 einem Rührer und einer Anlage zum Belüften des Fermentationsmediums versehen sind. Nach dieser Methode kann das Nährmedium in dem Fermenter angemacht und durch Erhitzen auf eine Temperatur bis etwa 120 °C sterilisiert werden. Nach dem Abkühlen kann das sterilisierte Medium mit einem zuvor 30 gezüchteten Impfgut der Kultur beimpft und die Fermentation eine Zeitlang z.B. 3 bis 5 Tage lang, unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 24 °C fortgeführt werden. Diese Methode zur Herstellung von N-Acetylthienamycin eignet sich besonders für die 3s Herstellung grosser Mengen des Antibioticums.

Physikalische und chemische Eigenschaften von N-Acetyl-thienamycin

Ein NMR-Spektrum von N-Acetylthienamycin bei 100 MHz zeigt die folgenden Maxima: 40

CH3-CH(OH)

01,27, d, 3 H, J « 6,5 ; 01,98, S, 3 H; 02,94, m, 2 H; 03,17, m, 2H; 03,38, t, 2 H, Jss 6,5; 03,38, m, 1H;

04,20, m, 2 H.

Das NMR-Spektrum einer vereinigten Lösimg von durch Fermentation erhaltenem N-Acetylthienamycin und durch Ace-tylierung erhaltenem Thienamycin ist von den Spektren der einzelnen Lösungen nicht zu unterscheiden. Aus der Abhängigkeit des Wertes für Xmax von dem pH-Wert wurde ein pKa von 3,3 ± 0,1 für die COOH-Gruppe in N-Acetylthienamycin bestimmt.

Bei der Papierelektrophorese in 0,1-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH-Wert 7) unter Verwendung von Papier Nr. 2043-B der Firma Schleicher und Schuell bei einem Spannungsgefälle von 50 V/cm wandert sowohl das durch Fermentation gewonnene N-Acetylthienamycin als auch das durch Acety-lierung von Thienamycin gewonnene N-Acetylthienamycin im Verlaufe von 20 Minuten bei 10 °C über eine Strecke von 2,7 cm zur Anode. Das Antibioticum wird durch Bioautogra-phie an Vibrio percolans ATCC 8461 (ohne zwischenzeitiges Trocknen des Papiers) lokalisiert, und die Wanderung wird von dem Punkt des Auftragens bis zur Mitte der Hemmzone gemessen.

Die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von mit Cellulose beschichteten Blättern und einem Lösungsmittelgemisch aus 70% Äthanol und 30% Wasser zeigt ein Rf sowohl für das durch Fermentation als auch für das durch Acetylierung von Thienamycin gewonnene N-Acetylthienamycin von 0,7, nachgewiesen durch Bioautographie an Vibrio percolans ATCC 8461. Der RrWert bezieht sich auf den Abstand vom Ursprungspunkt bis zum Mittelpunkt der Bioaktivität, dividiert durch den Abstand vom Ursprungspunkt bis zur Lösungsmittelfront.

Das IR-Spektrum von N-Acetylthienamycin ist in der Zeichnung dargestellt.

Es wird angenommen, dass N-Acetylthienamycin die folgende Molekularstruktur aufweist:

O

S-CH2-CH2-NH-C-CH3

(I)

COOH

N-Acetylthienamycin kennzeichnet sich ferner durch das so Escherichia coli folgende antibiotische Spektrumprofil. Dieser Test wird nach der Scheibendiffusionsmethode von Bauer-Kirby durchgeführt,

der nur in bezug auf die Tiefe der Agarschicht abgeändert ist,

die in diesem Falle 2 mm beträgt. Die als Durchmesser der Hemmzone in Millimeter angegebenen Ergebnisse finden sich in Tabelle III. In Tabelle III ist das antibiotische Spektrumprofil für N-Acetylthienamycin und auch für die Verbindung angege- Enterobacter ben, die durch Acetylieren von Thienamycin erhalten wird. cloacae

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Klebsiella pneumoniae

Tabelle III Prüforganismus

Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis

Merck Nr. ATCC Nr.

MB2985 -MB2314 -

MB 964 6633

Antibiotische Resistenz*

60 Proteus mirabilis Proteus morganii Serratia

65

Pseudomonas aeruginosa

MB2884 MB2964 MB2482

MB2921 MB2922

MB2646 MB2647

MB2830

MB2833

MB2840

MB2824 MB2835 MB3286

P,C P

P P

P,C

p,c p,c

P,C

P,C P,c P,C

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Prüforganismus

Merck Nr.

N-Acetyl-thienamy-cin (a) 9,85 y pro Scheibe**

N-Acetyl-thienamy-cin (b) 10,35 y pro Scheibe**

Staphylococcus aureus

MB2985 MB2314

37 37

37 37

Bacillus subtilis

MB 964

43

44,5

Escherichia coli

MB2884 MB2964 MB2482

31,5 28,5 28

31,5 29,5 28

Klebsiella pneumoniae

MB2921 MB2922

28 27

28,5 30

Enterobacter cloacae

MB2646 MB2647

26,5 29

27 29

Proteus mirabilis

MB2830

25

26

Proteus morganii

MB2833

25,5

25

Serratia

MB2840

27

27

Pseudomonas aeruginosa

MB2824 MB2835

MB3286

23 11

(unscharf) 0

24 11

(unscharf) 0

* P = Penicilline, vertreten durch Ampicillin. C = Cephalosporine, vertreten durch Cephalothin.

** Die Gewichtsberechnungen beruhen auf einem angenommenen E7™ , 30i nm — 290 und einer Auslöschbarkeit durch Hydro-xylamin von 96 % für das reine Material.

(a) Hergestellt durch Fermentierung von Streptomyces cattleya.

(b) Hergestellt durch Acetylieren von Thienamycin.

N-Acetylthienamycin zeigt in vivo-Aktivität gegen gramnegative und gram-positive Organismen und eignet sich daher zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren. Zur Bestimmung der in vivo-Aktivität wird N-Acetylthienamycin in 0,01-molarer Natriumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst und mit dieser Lösung zu fünf vierfachen Konzentrationen des Antibioticums für die Untersuchung verdünnt. Weibliche weisse Schweizer Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von etwa 21g werden intraperitoneal mit dem in Fleischbrühe suspendierten Prüforganismus infiziert. Die Anzahl der injizierten Organismen wird nach genormten Platten-Zählmethoden bestimmt. Zum Zeitpunkt der Infektion und 6 Stunden später werden einige der Mäuse intraperitoneal mit dem Antibioticum behandelt. Für jede Konzentration des untersuchten Antibioticums werden fünf Mäuse verwendet. Zu jedem Test gehören Kontrollen von je fünf Mäusen für jede der verschiedenen Verdünnungen der infizierenden Kultur, um die Anzahl der Organismen zu berechnen, die auf 50% der infizierten, unbehandelten Mäuse lethal wirken (LD50). Diese Berechnung wird auf Grund von Überlebensdaten am siebenten Tag nach der Infektion durchgeführt, und zu diesem Zeitpunkt wird auch die Menge des Antibioticums berechnet, die 50% der infizierten Mäuse schützen sollte (ED50).

Alle so infizierten und nicht mit dem Antibioticum behandelten Mäuse sterben innerhalb 48 Stunden nach der Infektion. Die Wirksamkeit von N-Acetylthienamycin ist in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Wirksamkeitsuntersuchungen an Mäusen(a)

Organismus Staphylococcus aureus 2949

Nr. LD50 13

Darreichungsart, Dosen i.p. X 20)

ED50, mg/kg/Dosis(c) 0,050

(a)CD-l, weibliche Mäuse, Körpergewicht 21 g.

(b)Gibt die Behandlung zum Zeitpunkt der Darreichung der infizierenden Dosis und 6 Stunden danach an.

^Gewicht von N-Acetylthienamycin auf der Basis des geschätzten Wertes E1ft>cmj 301 = 290 und einer Auslöschbarkeit durch Hydroxylamin von 96 % für das reine Material.

N-Acetylthienamycin ist ein wertvolles Antibioticum, das gegen die verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aktiv ist und daher sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin Verwendung findet. Die Verbindung, hergestellt gemäss der Erfindung, kann als antibakterielles Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien verursacht werden, z.B. gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae. Das beschriebene antibakterielle Mittel kann ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Zum Beispiel kann es in wässrigen Mitteln in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung oder vorzugsweise in Konzentrationen von 1 bis 10 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung gewichtsmässig verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Ausrüstungsgegenständen zu zerstören und zu hemmen, sowie als Bactericid für technische Anwendungszwecke, z.B. in Anstrichfarben auf wässriger Basis, in dem Siebwasser von Papierfabriken und zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien.

Das beschriebene Antibioticum kann in den verschiedensten pharmazeutischen Präparaten als alleiniger Wirkstoff oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antibiotica oder mit einem oder mehreren pharmakologisch aktiven Stoffen verwendet werden. Als Beispiel für den erstgenannten Fall kann ein Aminocyclitol-Antibioticum, wie Gentamicin, gleichzeitig dargereicht werden, um das antibakterielle Spektrum zu erweitern und die Möglichkeit des Auftretens von resistenten Organismen auf ein Minimum zu beschränken. Als Beispiel für den letzteren Fall kann man Diphenoxylat und Atropin in Dosisformen für die Behandlung von Magen-Darmerkrankungen kombinieren. Das Antibioticum kann in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern, flüssigen Lösungen oder als Suspension oder Elixiere verwendet werden. Es kann oral, lokal, intravenös oder intramuskulär dargereicht werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisform vorliegen und herkömmliche Streckmittel, wie Bindemittel, z.B. Sirup, Akazienharz, Gelatine, Sorbit, Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon, Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calriumphosphat, Sorbit oder Glycin, Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid, den Zerfall fördernde Mittel, z.B. Kartoffelstärke oder unbedenkliche Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Tabletten können nach an sich bekannten Methoden beschichtet sein. Oral darzureichende flüssige Präparate können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw., oder als trockenes Produkt zum Anmachen mit Wasser oder anderen Trägern vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Präparate können herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel, z.B. Sorbitsirup, Me-thylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcel-

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lulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte geniessbare Fette, Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Sorbi-tanmonooleat oder Akazienharz, nicht-wässrige Träger, wie geniessbare öle, z.B. Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol, Konservierungsmittel, z.B. p-Hydroxybenzoesäuremethyl- oder -propylester oder Sorbinsäure, enthalten. Zäpfchen können herkömmliche Zäpfchenbasen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.

Mittel für die Injektion können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in Merhfachdosisform in Behältern unter Zusatz von Konservierungsmitteln zur Verfügung gestellt werden. Die Mittel können die Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern aufweisen und Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel, enthalten. Der Wirkstoff kann auch in Pulverform vorliegen und vor der Verwendung mit einem Träger, z.B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, angemacht werden.

Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und des Rachens oder der Bronchialgewebe geeigneter Form vorliegen, z.B. als Pulver oder flüssige Sprüh- oder Inhaliermittel, Pastillen, Rachenanstrichmittel usw. Zur Behandlung der Augen oder Ohren können die Präparate als einzelne Kapseln, in flüssiger oder halbflüssiger Form zur Verfügung gestellt oder als Tropfen usw. verwendet werden. Für die lokale Applikation können sie in hydrophoben oder hydrophilen Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Anstrichmittel, Pulver usw. vorliegen.

Ausser einem Träger können die Mittel andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Oxidationsverzögerer, Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, die Viscosität beeinflussende Mittel oder Geschmacksstoffe und dergleichen, enthalten.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, können die Mittel z.B. als Präparate zum Injizieren in die Brust formuliert werden, die auf Langzeitwirkung abgestellt sind oder den Wirkstoff schnell in Freiheit setzen.

Dosierunsplan und Darreichungsart richten sich weitgehend nach dem Zustand des zu behandelnden Tieres, dem Gewicht desselben, der Empfindlichkeit des infizierenden Mikroorganismus und dem Stadium der Infektion, wobei die parenterale Darreichung bei allgemeinen Infektionen und die orale Darreichung bei Darminfektionen bevorzugt wird.

Zur Behandlung von bakteriellen Infektionen beim Menschen kann die beschriebene Verbindung oral oder parenteral nach herkömmlichen Methoden für die Behandlung mit Antibiotica in Mengen von 2 bis 600, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg/ Tag dargereicht und vorzugsweise in Einzeldosen unterteilt werden, die z.B. drei- bis viermal pro Tag dargereicht werden. Es können Einheitsdosisformen verwendet werden, die z.B. 25, 250,400,800 oder 1000 mg Wirkstoff zusammen mit physiologisch unbedenklichen Trägern oder Streckmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten können in Form von flüssigen Präparaten, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als feste Stoffe in Tabletten oder Kapseln vorliegen. Die optimale Dosis richtet sich für jeden einzelnen Fall nach Art und Schwere der Infektion, wobei für die Behandlung von Kindern kleinere Dosen angewandt werden; alle derartigen Bemessungsregeln sind dem Fachmann bekannt.

Die Erfindung umfasst auch die nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salze von N-Acetylthienamycin, z.B. die pharmakologisch unbedenklichen Salze, die mit anorganischen oder organischen Basen entstehen. Hierzu gehören z.B. Metallsalze, die von Alkali- oder Erdalkalhydroxiden, -carbonaten oder-bicarbonaten abgeleitet sind, wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Calciumsalze, sowie Salze von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie von Mo-noalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niederen Alk-

anolaminen, niederen Dialkanolaminen, niederen Alkylendi-aminen, N,N-Diaralkyl-nied.alkylendiaminen, Aralkylaminen, aminosubstituierten niederen Alkanolen, durch niedere N,N-Dialkylaminogruppen substituierten niederen Alkanolen, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierten niederen Alkansäuren und stickstoffhaltigen heterocyclischen Aminen. Typische Beispiele sind Salze, die von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kalium-carbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminäthanol, 2-Amino-2-methylpropanol-(l), Theophyllin, N-Methylglucamin und dergleichen abgeleitet sind.

Die Salze der beschriebenen Verbindung können nach bekannten Methoden hergestellt werden. So erhält man z.B. die Monosalze, wie das Mononatriumsalz, durch Umsetzung von 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit 1 Äquivalent des Produkts des erfindungsgemässen Verfahrens in einem geeigneten Lösungsmittel. Auch Mischsalze mit zweiwertigen Kationen können hergestellt werden, indem man 1 Mol einer zweiwertigen Base mit 1 Mol des Produkts des erfindungsgemässen Verfahrens und 1 Äquivalent einer anderen Säure kombiniert. Salze können auch hergestellt werden, indem man 1 Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydroxid, mit 1 Äquivalent des Produkts des erfindungsgemässen Verfahrens umsetzt. Diese Salze sind pharmakologisch unbedenkliche, nicht-toxische Derivate, die als Wirkstoffe in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosisformen verwendet werden können. Sie können auch mit anderen Arzneimitteln kombiniert werden, um Mittel mit einem weiten Aktivitätsspektrum zu erhalten.

Die nach den hier beschriebenen Verfahren erhaltenen, das Antibioticum enthaltenden Fermentationsflüssigkeiten haben Aktivitäten im Bereich von etwa 0,1 bis 4 y/ml. Die Reinigung der antibiotischen Präparate und die Gewinnung des Antibioticums kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Ein solches Verfahren besteht darin, dass man filtrierte Fermentationsflüssigkeit, die N-Acetylthienamycin enthält, durch eine Kolonne eines starken Kationenaustauschharzes filtriert. Beispiele für solche Harze sind diejenigen vom Sulfonattyp mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst, z.B. das kernständige Sul-fonsäuregruppen aufweisende Polystyrolharz «Dowex»-50 X 2 (hergestellt von der Dow Chemical Co., Midland, Michigan) in der Natriumform. Andere repräsentative Vertreter der Klasse von starken Kationenaustauschharzen sind die folgenden: «Dowex-50 X 4, «Dowex»-50 X 8 (hergestellt von der Dow Chemical Co., Midland, Michigan), «Amberlite» IR120 (hergestellt von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania), Duo-lite C25D (hergestellt von der Chemical Process Co., Redwood City, California), «Permutit» Q (hergestellt von der Permutit Co., Birmingham, New Jersey), «lonac» C-249 (hergestellt von der lonac Chemical Co., Birmingham, New Jersey) und «Am-berlite»200.

Der das Antibioticum N-Àcetylthienamycin enthaltende Ablauf von dem Kationenaustauschharz kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsmethoden weiter gereinigt werden. Thienamycin bleibt an dem starken Kationenaustauschharz adsorbiert. Demgemäss ist das Verfahren zum Trennen dieser beiden Verbindungen klar unterscheidbar.

Ein solches Verfahren besteht darin, dass man N-Acetyl-thienamycin an einem stark basischen Anionenaustauschharz adsorbiert. Beispiele für solche stark basischen Anionenaus-tauschharze sind diejenigen mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst, z.B. das im Polystyrolkern quaternisierte Ammoniumharz «Dowex»-l X 2 (hergestellt von der Dow Chemical Co., Midland, Michigan) in der Chloridform. Andere repräsentative Glieder dieser Klasse von stark basischen Ionenaustauschharzen

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sind: «Duolite»A-40, A-42, A-101, A-102 und A-l 14 (herge- lauf kann weiter nach einer Reihe von Verfahrensstufen gerei-

stellt von der Chemical Process Co., Redwood City, California) ; nigt werden, in denen die folgenden chromatographischen Me-

« Amberlite» IRA-400, IRA-401 und IRA-410 (hergestellt von dien verwendet werden: Anionenaustauschharze vom Polysty-

der Firma Rohm und Haas, Washington Square, Philadelphia 5, rol-Trimethylammoniumtyp (z.B. «Dowex»-l X 2 in der Chlo-

Pennsylvania). Das in dem Eluat enthaltene Antibioticum 5 ridform), polymere Adsorptionsmittel (z.B. XAD-2, ein Poly-

N-Acetylthienamycin kann weiter gereinigt werden, indem man styrolharz), «Dowex»-l X 4 in der Chloridform und Gelfiltra-

es durch eine Kolonne leitet, die mit einem Acrylsäureesterpo- tionsharze (z.B. «Bio-Gel» P-2, ein Polyacrylsäureamidharz).

lymerisat von mittlerer Polarität beschickt ist, wie XAD-7 oder Die Bioaktivität der Eluate wird gemessen, indem man das

8, oder durch eine Kolonne, die mit einem unpolaren, hydro- Eluat unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC

phoben, vernetzten Polystyrol-Divinylbenzolpolymerisat be- 10 6538P als Testorganismus oder, falls die Reinheit dies gestattet,

schickt ist, wie XAD-1,2 und 4, vorzugsweise XAD-2. (XAD- auf Grund der von Hydroxylamin ausgelöschten Extinktion

1,2,4,7 und 8 werden von der Firma Rohm und Haas, Wash- analysiert. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung von ington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt.) N-Acetylthienamycin aus Fermentationsflüssigkeiten ist in Ta-

Weiter gereinigtes N-Acetylthienamycin erhält man z.B. belle V angegeben.

durch Gelfiltration durch Polyacrylsäureamidgel mit einer Po- 15 In den nachstehenden Beispielen werden Ausführungsfor-

rengrösse, die Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als men des erfindungsgemässen Verfahrens erläutert. Die Beispie-

1800 ausschliesst, wie «Bio-Gel» P-2 (hergestellt von Bio Rad, le dienen jedoch nur zur Erläuterung; die Erfindung umfasst

Richmond, California). auch funktionell äquivalente Ausführungsformen des Verfah-

Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung von gereinigtem rens. Daher ist jede Abänderung der hier beschriebenen Aus-

N-Acetylthienamycin besteht darin, eine Lösung des Antibioti- 20 führungsformen, die zur Bildung eines identischen Produkts cums, wie die filtrierte Fermentationsflüssigkeit, deren pH-Wert führt, als eine analoge Methode anzusehen. Die hier beschriebe-

auf 4 bis 5 eingestellt worden ist, durch eine Kolonne zu leiten, nen Ausführungsformen können erheblich abgeändert werden,

die ein starkes Kationenaustauschharz vom Sulfonattyp in der und geringe Abweichungen fallen in den Rahmen der Erfin-

Natriumform enthält («Dowex»-50 X 4). Der aufgefangene Ab- dung.

25

Tabelle V

Fliessdiagramm des Reinigungsverfahrens für das Antibioticum N-Acetylthienamycin

30

630118

8

Die nachstehenden prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig, wenn nichts anderes angegeben ist.

Analysenverfahren auf Antibioticum N-Acetylthienamycin

I. Bioanalyse

Analysen auf die antibakterielle Aktivität werden nach der folgenden Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 oder Staphylococcus aureus ATCC 6538P als Prüforganismus durchgeführt.

Platten mit Vibrio percolans ATCC 8461 werden folgender-massen hergestellt:

Eine gefriergetrocknete Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml eines sterilen Mediums suspendiert, welches 8 g/1 Difco-Nährbrühe und 2 g/1 Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält (nachstehend als NBYE abgekürzt). Die Kultur wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 °C inkubiert. Diese Kultur wird verwendet, um die Oberfläche von Schrägröhrchen zu beimpfen, die 1,5 % Agar in NBYE enthalten, und die beimpften Schrägröhrchen werden übernacht bei 28 °C inkubiert und dann im Kühlschrank aufbewahrt.

Die aus einer einzigen gefriergetrockneten Kultur hergestellten gekühlten Schrägröhrchen werden für einen Zeitraum bis zu 4 Wochen nach ihrer Herstellung folgendermassen verwendet: Eine Öse mit Impfgut aus dem Schrägröhrchen wird in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben in 50 ml NBYE dispergiert. Die Kultur wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 °C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50prozentige Lichtdurchlässigkeit bei 660 nm ergibt. 33,2 ml dieser verdünnten Kultur werden zu einem Volumen von 11 NBYE zugesetzt, das 15 g Agar enthält und auf 46 °C gehalten wird. Das beimpfte, agarhaltige Medium wird in Petrischalen aus Kunststoff von 100 X15 mm in Mengen von 5 ml je Schale gegossen, gekühlt und bis zu einem Zeitpunkt von 5 Tagen vor der Verwendung auf 2 bis 4 °C gehalten.

Platten mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P werden folgendermassen hergestellt:

Eine übernacht entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Nährbrühe, die 0,2% Hefeextrakt enthält, wird mit 0,2% Hefeextrakt enthaltender Nährbrühe zu einer Suspension mit einer optischen Durchlässigkeit von 55 % bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt. Diese Suspension wird zu «Difco»-Nähragar zugesetzt, das durch 2,0 g/1 Difco-Hefeextrakt ergänzt worden ist und sich auf einer Temperatur von 47 bis 48 °C befindet, wobei man eine Mischung erhält, die 33,2 ml der Suspension je Liter Agar enthält. 5 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 °C gehalten.

Proben des zu analysierenden Antibioticums werden mit Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7 auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 6,35 oder 12,7 mm werden in die Testlösung getaucht und auf die Oberfläche der Analysenplatten gelegt. Die Platten werden übernacht bei 37 °C inkubiert, worauf man den Durchmesser der Hemmzone in Millimeter bestimmt. Der Durchmesser der Hemmzone in Millimeter bestimmt die relative Stärke.

II. Durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion

Der Anteil der bei 301 nm gemessenen Extinktion, der auf den Gehalt unreiner Proben an dem Antibioticum zurückgeführt werden kann, wird durch die selektive Auslöschung dieser Extinktion (unter gleichzeitiger Inaktivierung der antibiotischen Aktivität) durch Reaktion mit verdünntem Hydroxylamin bestimmt.

Proben, die das zu untersuchende Antibioticum enthalten, werden in 0,01-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH-Wert 7) so hergestellt, dass sie eine anfängliche A30i zwischen 0,1 und 1,0 aufweisen. Frisch hergestelltes, neutralisiertes Hydroxylamin (NH2OH • HCl + NaOH bis zu einem End-pH-Wert von 7) wird bis zu einer Endkonzentration von 10-mmolar zugesetzt, worauf man die Reaktion bei Zimmertemperatur mindestens 30 Minuten lang ablaufen lässt. Wenn man den so 5 erhaltenen A301-Wert von der ursprünglichen Ablesung (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagens) subtrahiert, erhält man die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion. Lösungen von reinem N-Acetylthienamycin zeigen eine durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion von 96,0%.

10

Beispiel 1

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,7 ml sterile Davis-15 Salze der folgenden Zusammensetzung enthält:

20

Davis-Salze Natriumeitrat k2hpo4 kh2po4

(NHd)2S04 MgS04 • 7H20 destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml.

25 0,2 ml dieser Suspension werden verwendet, um ein Kultur-schrägröhrchen mit Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medium A

30 Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04 • 7H20 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml

35 pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation ** Phosphatpufferlösung KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

40 destilliertes Wasser 1000 ml

Für Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu.

Das beimpfte Schrägröhrchen wird 8 Tage lang bei 28 °C inkubiert und dann bei 4 °C gelagert.

45 Ein Teil der Sporen und des Luftmycels dieses Schrägröhr-chens wird verwendet, um einen mit Umlenkorgan versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen, der 50 ml Medium A (ohne Agar) enthält. Dieser Impfkolben wird 2 Tage lang bei 28 °C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf so sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Fünfzehn 250 ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Medium B enthalten, werden mit je 1 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

20,0 g

55 Medium B Maismehl lösliche

Schlempebestandteile Sojabohnenmehl 60 Natriumeitrat CaCl2 • 2H20 MgS04 • 7H20 CoC12 ■ 6H20 FeS04-7H20 65 Polyglycol 2000**

destilliertes Wasser pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt. **Polyglycol 2000: Dow Chemical Co.

10,0 15,0 4,0 0,5 0,1 0,01g 0,01g 0,25 Vol.-% 1000 ml g

g g

9

630118

Diese 15 Produktionskolben werden 53 Stunden lang bei 28 °C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Zum Zeitpunkt des Aberntens (nach 53 Stunden) werden die Fermentationsflüssigkeiten der 15 Kolben vereinigt, und eine Probe wird zur Analyse zentrifugiert. Vor der Analyse wird der pH-Wert der zentrifugierten Fermentationsflüssigkeit mit Natronlauge von 6,5 auf 5,9 eingestellt.

Auf Analysenplatten werden Analysen mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P und Vibrio percolans ATCC 8461 unter Verwendung von 12,7 mm-Scheiben durchgeführt, die in die überstehende Flüssigkeit der zentrifugierten Fermentationsflüssigkeit getaucht werden.

Die Analysenergebnisse sind die folgenden:

Aktivität gegen ATCC 6538P, Aktivität gegen ATCC 8461, Hemmzone, mm Hemmzone, mm

39/44 SH 35/44 SH

SH = etwas unscharf.

200 ml der filtrierten Fermentationsflüssigkeit werden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und an 10 ml «Dowex»-1X 2-Harz in der Chloridform mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min adsorbiert, wobei man den Ablauf in Form von 10 Fraktionen zu je 20 ml auffängt.

Das Adsorbat wird mit einem Gemisch aus 90 Vol.-% Methanol und 10 Vol.-% Wasser eluiert, das 3 Gew.-% Ammoniumchlorid enthält, und das Eluat wird in 10 Fraktionen zu je 5 ml aufgefangen. Die Eluatfraktionen Nr. 1 bis 6 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt, um das Methanol abzutreiben. Das Konzentrat wird nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Scheiben von 12,7 mm Durchmesser, die 100 (xml antiobiotische Lösung enthalten, gegen Staphylococcus aureus MB-2985 analysiert, wobei man eine Hemmzone von 28 mm erhält.

Die Analysenplatten von MB-2985 werden folgendermassen hergestellt:

Eine übernacht unter Schütteln bei 37 °C entwickelte Kultur von MB-2985 in Hirn-Herz-Aufgussmedium wird auf das 20 OOOfache verdünnt und auf die Oberfläche von 10 ml Hirn-Herz-Aufguss-Agar in einer Petrischale mit 85 mm Durchmesser aufgebracht. Auf die Platten werden Scheiben von 1,27 mm Durchmesser, die 100 |xl antibiotische Lösung enthalten, aufgelegt, worauf die Platten 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert werden. Die Hemmzonen werden in Millimeter abgelesen.

Beispiel 2

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt verwendet, um einen mit Umlenkorgan versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen, der 50 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:

20,0 10,0 15,0 4,0 0,5 0,1 0,01g 0,01g 0,25 Vol.-% 1000 ml g g g g g g

Medium B Maismehl lösliche Schlempebestandteile Sojabohnenmehl s Natriumeitrat CaCl2 • 2H20 MgS04 • 7H20 CoC12 • 6H20 FeS04-7H20 io Polyglycol 2000**

destilliertes Wasser pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

**Polyglycol 2000: Dow Chemical Co.

Diese Kolben werden 3 Tage lang bei 28 °C mit 220 U/min 15 (Hub 5,1 cm) geschüttelt, und während der Fermentation werden Analysen durchgeführt. Die Analysen werden auf Standard-Analysenplatten mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P und Vibrio percolans ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27 cm-Scheiben durchgeführt, die in die überstehende Flüs-20 sigkeit des Zentrifugats der Fermentationsflüssigkeit getaucht werden. Vor der Analyse wird der pH-Wert dieser Fermentationsflüssigkeit, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, eingestellt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

25 Alter, h

Aktivität gegen ATCC 6538P Aktivität gegen 30 ATCC 8461

pH-Wert anfänglich pH-Wert eingestellt auf sh = etwas unscharf 35 h = unscharf

Medium A

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04-7H20 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation ** Phosphatpufferlösung KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Dieser Impfkolben wird zwei Tage lang bei 28 °C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Fünfzehn 250 ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Medium B enthalten, werden mit je 1 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

48

53

72

33/39h 31/38h 21/27h

35sh/46h 36sh/44h 33sh/38h 5,2 5,1 4,8 6,1 6,2 6,9

Nach 53 Stunden werden die Fermentationsflüssigkeiten vereinigt und filtriert. Man erhält 590 ml Filtrat (pH-Wert 5,9). Der pH-Wert des Filtrats wird auf 7,0 eingestellt, worauf man 40 5,9 mg Äthylendinitriltetraessigsäure (EDTA) zusetzt.

580 ml dieses Filtrats (pH-Wert 7,0) werden an 130 ml «Dowex»-l X 2-Harz in der Chloridform adsorbiert, wobei man den Ablauf in Form von 2 Fraktionen zu je 290 ml auffängt. Dann wird das Adsorbat mit 130 ml entmineralisiertem 45 Wasser gewaschen. Das gewaschene Adsorbat wird übernacht im Kühlraum aufbewahrt und dann mit 5 %iger Kochsalzlösung eluiert, wobei man 6 Fraktionen zu je 50 ml auffängt.

Die prozentuale Gewinnung der anfänglichen Bioaktivität, bestimmt nach der Scheibenplattenmethode, ist nachstehend 50 angegeben:

Fraktion Eluatfraktionen 55 Nr. 1 bis 5

Vibrio percolans ATCC 8461

26%

Staph. aureus ATCC 6538P

1%

Das Antibioticum N-Acetylthienamycin findet sich in den Fraktionen Nr. 1 bis 5 des NaCI-Eluats. Die Fraktion Nr. 4 wird nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Scheiben von 1,27 cm Durchmesser, die 100 (xl antibiotische Lösung enthalten, gegen Staphylococcus aureus MB-2985 analysiert, wobei man einen Hemmzonendurchmesser von 29 mm erhält. Die Platten mit MB-2985 werden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.

65

Beispiel 3

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet und der

630 118

10

Inhalt in 0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

K2HP04 7,0 g

KH2P04 3,0 g

(NH4)2so4 1,0 g

MgS04-7H20 0,1 g destilliertes Wasser 1000 ml.

Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medium A

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer** 2,0 mg

MgS04-7H20 0,05 g destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation ** Phosphatpufferlösung KHoP04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Für Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu.

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 28 °C inkubiert und dann bei 4 °C gelagert.

10 ml Medium A (ohne Agar) werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension geschabt, und 1,2 ml dieser Suspension werden verwendet, um drei mit Umlenkorganen versehene 2 i-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, die je 500 ml Medium A (ohne Agar) enthalten. Diese Impfkolben werden 24 Stunden lang bei 28 °C mit 160 U/min geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Die Kulturen aus diesen Impfkolben werden vereinigt und verwendet, um 4671 Medium A (ohne Agar) in einem 7561 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Dieser Fermenter arbeitet 24 Stunden lang bei 28 °C, wobei man mit 130 U/min rührt und 283 1 Luft je Minute hindurchleitet. Nach Bedarf wird Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow Chemical Corp.), jedoch nicht in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt. Die pH-Wert-Bestimmungen haben die folgenden Ergebnisse:

Alter, h 0 24

pH-Wert 6,3 6,4

4541 derKultur in diesem Impffermenter werden verwendet, um 40821 Medium E in einem 56701 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Cerelose 25,0 g

Maisquellwasser (auf Nassbasis) 15,0 g lösliche Schlempebestandteile 10,0 g

Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) 5,0 g

CoCl2 • 6H2 0,01g

CaC03 (nach pH-Wert-Einstellung) 3,0 g

Polyglycol 2000 0,25 %

Leitungswasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Dieser Fermenter wird 138 Stunden lang bei 24 °C unter Rühren mit 70 U/min und Hindurchleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit von 1,54 m3/min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:

Alter, h pH-Wert ATCC Nr. 6633

(9,5 mm-Scheiben), Hemmzone, mm

0

6,9

0

24

6,3

0

36

6,0

0

48

5,9

0

60

6,0

23

72

5,9

—

84

6,0

21

96

6,2

—

108

6,5

35

120

6,6

36

132

6,7

41

138

6,7

39

Die 40821 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76 cm-Filterpresse unter Beimischung eines Filterhilfsmittels in einer Menge von 4 Gewichtsteilen je 100 Raumteile filtriert. Zu dem Filtrat werden 46 g Natriumsalz von Äthylendinitriltetraes-sigsäure (EDTA) zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6 °C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 ± 0,2 eingestellt und auf 6 °C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 481/ min in eine 4801 fassende Kolonne mit «Dowex»-50 X 4 Na+ (300-840 n) eingegeben. Nach einem Vorlauf von 14001 wird ein Ablauf von 18,91 aufgegangen, dessen pH-Wert mit Natronlauge auf 7,08 eingestellt wird, und der bei 5 °C gelagert wird.

Eine Kolonne von 3,8 cm Durchmesser, die mit 300 ml «Dowex»-l X 2 (150-300 (x) in der Chloridform gefüllt ist,

wird mit 600 ml entmineralisiertem Wasser von 5 °C gewaschen. 41 des kalten Ablaufs von der «Dowex»-50 X 4-Kolonne werden mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min durch diese Kolonne geleitet. Dann wird die Kolonne mit 300 ml 25-jimo-larer EDTA-Lösung gewaschen. Das Antibioticum N-Acetylthienamycin wird mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min bei 5 °C mit 900 ml 5 %iger Kochsalzlösung eluiert, die 0,01-molar an Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) und 25-fimolar an EDTA sind. 14 Fraktionen zu je 75 ml werden aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode auf ihre biologische Aktivität analysiert. Die Eluatfraktion Nr. 3 bis 9, deren Menge 525 ml beträgt, werden vereinigt und im Vakuum zu 115 ml eingeengt. Das Konzentrat enthält 65 % des gesamten, in die «Bow-ex»-l X 2 Cl~ -Kolonne eingebrachten bioaktiven Materials.

Das Konzentrat des «Dowex»-l X 2 Cl~ -Eluats wird bei 5 °C in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 3,8 cm eingegeben, die mit 450 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist. Das XAD-2 wird kolonnenweise nacheinander mit je 4 Kolonnenvolumina 1) 0,001-molarer EDTA-Lösung, 2) In NaOH, 3) entmineralisiertem Wasser, 4) In HCl, 5) entmineralisiertem Wasser, 6) Methanol, 7) Aceton, 8) entmineralisiertem Wasser und vor der Verwendung mit 2250 ml 5 %iger NaCl-Lösung vorgewaschen, die 25-jmolar an EDTA ist.

Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne gibt man zwei Anteile zu je 25 ml Wasser auf. Die Kolonne wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/min bei 5 °C mit entmineralisiertem Wasser entwickelt. Es werden eine erste Fraktion von 400 ml und dann 11 weitere Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen. Der pH-Wert einer jeden Fraktion wird mit In Natronlauge bzw. In Salzsäure zwischen 6,9 und 7,13 eingestellt. Die Fraktionen Nr. 3 bis 9, die 46% des gesamten, in die XAD-2-Kolonne eingegebenen bioaktiven Materials enthalten,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

630118

werden zu einem Gesamtvolumen von 490 ml vereinigt. Eine (NH4)2S04 1,0 g

Probe von 45 ml wird für Bioanalysen nach der Standard-Schei- MgSÖ4 • 7H20 0,1 g bendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC destilliertes Wasser 1000 ml.

6538P entnommen. Die verbleibenden 445 ml werden unter

Vakuum auf 50 ml eingeengt. 5 Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen

Die 50 ml Konzentrat des XAD-2-Eluats werden bei 5 °C mit Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min in eine Kolonne von beimpfen:

I,5 cm Durchmesser eingegeben, die mit 40 ml vorgewaschenem «Dowex»-l X 4 Cl~ (Teilchengrössen <37 n) beschickt Medium A

ist. Das «Dowex»-l X4 Cl~ -Harz (<37 |x, bestimmt durch De- 10 Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g kantierenvon Wasser) wird vor der Verwendung mit einer Ge- Glucose 10,0 g schwindigkeit von 1 ml/min kolonnenweise mit 240 ml 0,2-mo- Phosphatpuffer* 2,0 ml larer Kochsalzlösung, die 0,005-molar an NH4C1 und 0,1-mmo- MgS04-7H20 0,05 g lar an NH4OH ist, und dann mit der gleichen Geschwindigkeit destilliertes Wasser 1000 ml mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. 15 pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

Im Anschluss an diese Probe werden zwei Anteile zu je 5 ml *«Ardamine»: Yeast Products Corporation entmineralisierten Wassers in die Kolonne eingegeben. Die Ko- **Phosphatpufferlösung lonne wird bei 5 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,92 ml/min KH2P04 91,0 g mit 0,07-molarer Kochsalzlösung entwickelt, die 0,005-molar Na2HP04 95,0 g an NH4C1 und 0,1-mmolar an NH4OH ist. Dabei werden Frak- 20 destilliertes Wasser 1000 ml tionen zu 8,6 bis 9,3 ml aufgefangen. Die Fraktionen, die mit einem Ablaufvolumen von 600 ml beginnen und mit einem Vo- Für Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu.

lumen von 710 ml enden, werden vereinigt ; sie enthalten 98 % Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei des gesamten, in die «Dowex»-l X 4-Kolonne eingebrachten 28 °C inkubiert und dann bei 4 °C gelagert.

bioaktiven Materials. Diese Flüssigkeit wird im Vakuum auf 25 10 ml Medium A werden aseptisch auf eines dieser Schräg-2 ml eingeengt. röhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in

Das «Dowex»-l X 4-Konzentrat wird in eine Kolonne mit Suspension geschabt, und 1,2 ml dieser Suspension werden vereinen! Durchmesser von 2,2 cm eingegeben, die mit 225 ml wendet, um drei mit Umlenkorganen versehene 21-Erlenmey-«Bio-Gel» P-2 (37-74 |x) mit einer Ausschlussgrenze von 1800 erkolben zu beimpfen, die je 500 ml Medium A (ohne Agar) Dalton (zuvor bestimmt durch Dekantieren von destilliertem 30 enthalten. Diese Impfkolben werden 24 Stunden lang bei 28 °C Wasser) beschickt ist. mit 160 U/min geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende

Vor der Verwendung wird die «Bio-Gel» P-2-Kolonne mit Kultur entwickelt hat.

225 ml 1-molarer Kochsalzlösung und dann mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Die Kolonne wird mit einer Die Kulturen aus diesen Impf kolben werden vereinigt und Geschwindigkeit von 1 ml/min bei 5 °C mit entmineralisiertem 35 verwendet, um 4671 Medium A (ohne Agar) in einem 7561 Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Dieser werden. Die von 104 bis 128 ml aufgefangenen Eluatfraktionen Fermenter arbeitet 24 Stunden lang bei 28 °C, wobei man mit enthalten 83 % der in die «Bio-Gel» P-2-Kolonne eingebrach- 130 U/min rührt und 283 1 Luft je Minute hindurchleitet. Nach ten Bioaktivität und werden vereinigt und zu 1,58 ml eingeengt. Bedarf wird Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow

Eine Kolonne mit 50 ml XAD-2 (1,6 cm X 27 cm) wird 40 Chemical Corp.), jedoch nicht in Mengen von mehr als 0,1%, hergestellt und kolonnenweise mit je 200 ml 1 -mmolarer zugesetzt. Die pH-Wert-Bestimmungen haben die folgenden

EDTA-Lösung, In Natronlauge, entmineralisiertem Wasser, In Ergebnisse:

HCl, entmineralisiertem Wasser, Methanol, Aceton und entmineralisiertem Wasser vorgewaschen. Das Konzentrat des «Bio- Alter, h _0_ 24 Gel» P-2-Eluats, das 44,4 durch Hydroxylamin auslöschbare 45 pH-Wert 6,3 6,4 optische Dichteeinheiten enthält, wird bei 5 °C in die XAD-2-

Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml ent- 4541 der Kultur in diesem Impffermenter werden verwen-

mineralisierten Wassers nachgiesst. Die Kolonne wird mit einer det, um 40821 Medium E in einem 56701 fassenden Fermenter Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Medium E hat die folgende gewaschen, bis die UV-Extinktion der Waschflüssigkeiten bei 50 Zusammensetzung:

300 nm auf 0,060 abgenommen hat. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit 50%igem Methanol in ent- Medium E mineralisiertem Wasser gewaschen, wobei Fraktionen zu je 1 ml Cerelose aufgefangen werden. Die Fraktionen mit einer Extinktion bei Maisquellwasser (auf Nassbasis)

300 nm von mehr als 0,1 werden vereinigt und im Vakuum 55 lösliche Schlempebestandteile eingeengt. Als Produkt erhält man N-Acetylthienamycin mit Baumwollsaatmedium (Pharmamedia)

II,6 durch Hydroxylamin auslöschbaren optischen Dichteein- CoCl2 • 6H20 heiten. CaC03 (nach pH-Wert-Einstellung)

Beispiel 4 Polyglycol 2000

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Strepto- «o Leitungswasser myces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet und der pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Inhalt in 0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert: Dieser Fermenter wird 138 Stunden lang bei 24 °C unter

Rühren mit 70 U/min und Hindurchleiten von Luft mit einer Davis-Salze 65 Geschwindigkeit von 1,54 m3/min betrieben. Nach Bedarf wird

Natriumeitrat 0,5 g weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht

K2HP04 7,0 g in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt. Es werden antibakte-

KH2P04 3,0 g rielle Analysen mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:

25,0

g

15,0

g

10,0

g

5,0

g

0,01

g

3,0

g

0,25

%

1000

ml

630118

Alter, h pH-Wert ATCC Nr. 6633

(9,5 mm-Scheiben), Hemmzone, mm

0

6,9

0

24

6,3

0

36

6,0

0

48

5,9

0

60

6,0

23

72

5,9

—

84

6,0

21

96

6,2

—

108

6,5

35

120

6,6

36

132

6,7

41

138

6,7

39

Die 40821 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76 cm-Filterpresse unter Beimischung eines Filterhilfsmittels in einer Menge von 4 Gewichtsteilen je 100 Raumteile filtriert. Zu dem Filtrat werden 46 g Natriumsalz von Äthylendinitriltetraes-sigsäure (EDTA) zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6 °C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 ± 0,2 eingestellt und auf 6 °C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 481/ min in eine 4801 fassende Kolonne mit «Dowex»-50 X 4 Na+ (300-840 n) eingegeben. Nach einem Vorlauf von 14001 wird ein Ablauf von 18,91 aufgefangen, dessen pH-Wert mit Natronlauge auf 7,08 eingestellt wird, und der bei 5 °C gelagert wird.

Eine Kolonne von 3,8 cm Durchmesser, die mit 300 ml «Dowex»-l X 2 (150-300 |i) in der Chloridform gefüllt ist,

wird mit 300 ml entmineralisiertem Wasser von 5 CC gewaschen, 41 des kalten Ablaufs von der «Dowex»-50 X 4-Kolon-ne werden mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min durch diese Kolonne geleitet. Dann wird die Kolonne mit 350 ml 25-[xmolarer EDTA-Lösung gewaschen und bei 5 °C mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min mit 900 ml 5 %iger NaCl-Lö-sung eluiert, die 0,01-molar an Tris • HCl (pH-Wert 7) und 25-{imolar an EDTA ist. Es werden Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P analysiert. Die Fraktionen Nr. 4 bis 10, die 47 % der eingebrachten Bioaktivität enthalten, werden zu 42,5 ml der Probe zugesetzt, die in Beispiel 3 aus den vereinigten Fraktionen von der ersten XAD-2-Adsorption für die Analyse entnommen worden waren. Diese vereinigten Fraktionen werden im Vakuum zu 100 ml eingeengt und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,32 eingestellt.

Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 3,8 cm, die mit 450 ml XAD-2-Harz beschickt ist, wird kolonnenweise nacheinander mit je 4 Kolonnenvolumina 1) 0,001-molarer EDTA-Lösung, 2) In NaOH, 3) entmineralisiertem Wasser, 4) In HCl, 5) entmineralisiertem Wasser, 6) Methanol, 7) Aceton, 8) entmineralisiertem Wasser vorgewaschen und vor der Verwendung mit 2250 ml 5 %iger NaCl-Lösung gewaschen, die 25-(xmolar an EDTA ist. Das obige Konzentrat wird in die XAD-2-Kolon-ne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 5 ml entmineralisiertem Wasser nachgiesst. Die Kolonne wird bei 5 °C mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt. Es werden eine erste Fraktion zu 40 ml und weitere Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen und nach der Scheibendiff-fusionsmethode analysiert. Die Fraktionen Nr. 9 bis 15, die 22% der in die XAD-2-Kolonne eingegebenen Bioaktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu 56 ml eingeengt.

Eine 21 cm X 1,7 cm messende Kolonne, die mit 40 ml «Dowex»-l X 4C1- (<37 |i, bestimmt durch Dekantieren von Wasser) beschickt ist, wird vor der Verwendung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit 240 ml 0,2-molarer NaCl-Lösung, die 0,005-molar an NH4C1 und 0,1-mmolar an NH4OH ist, und dann mit der gleichen Geschwindigkeit mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen.

Das XAD-2-Konzentrat wird in die Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisiertem Wasser und dann zwei Anteile zu je 2 ml Eluierungspuffer nachgiesst. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min bei 5 °C mit einer 0,07-molaren NaCl-Lösung, die 0,005-molar an NH4C1 und 0,1-mmolar an NH4OH ist, eluiert. Es werden Fraktionen zu je 10 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert. Die von 544 bis 647 ml aufgefangenen Eluatfraktionen enthalten scheinbare 100% der eingegebenen Bioaktivität und werden miteinander vereinigt und im Vakuum auf 2,3 ml eingeengt. Das Konzentrat enthält 36,4 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten.

Eine 2,2 cm X 62 cm messende Kolonne, die mit 225 ml Bio-Gel P-2-Harz (37-74 |i) mit einer Ausschlussgrenze von 1800 Dalton beschickt ist, wird vor der Verwendung mit 225 ml 1-molarer Kochsalzlösung und dann mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das «Dowex»-l X 4-Konzentrat wird in die Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nachgiesst. Die Kolonne wird bei 5 °C mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden, die dann nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert werden. Die Fraktionen von 124 bis 129 ml, die 7,04 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu 2 ml einer wässrigen Lösung des Produktes N-Acetylthienamycin eingeengt. Die von 117 bis 123 ml und von 130 bis 139 ml Eluat aufgefangenen Fraktionen werden zu einer Lösung des Produkts N-Acetylthienamycin vereinigt, die 13,7 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält.

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

C

1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

630 118

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums N-Acetylthienamycin, dadurch gekennzeichnet, dass man unter submersen aeroben Bedingungen Streptomyces cattleya in einem wässrigen, assimilierbare C- und N-Quellen sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium züchtet und das gebildete N-Acetylthienamycin isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Streptomyces cattleya NRRL 8057 verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salzen von N-Acetylthienamycin durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Basen.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat grosses Interesse auf diesem Gebiet wachgerufen, das zur Auffindung vieler anderer wertvoller antibiotischer Stoffe geführt hat; solche Antibiotica sind z.B. andere Penicilline, Cephalosporine, Streptomycin, Bacitracin, Teracycline, Chloramphenicol, Erythromycine und dergleichen. Im allgemeinen erstreckt sich die antibakterielle Aktivität eines jeden dieser Antibiotika nicht auf gewisse klinisch wichtige pa-thogene Bakterien. So wirken einige hauptsächlich nur gegen gram-positive Arten von Bakterien. Ferner hat im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung bisher bekannter Antibiotica zur Behandlung von bakteriellen Infektionen die erworbene Resistenz zum Auftauchen schwieriger Resistenzprobleme geführt.

Daher haben die Mängel der bekannten Antibiotica eine weitere Forschung zur Auffindung anderer Antibiotica angeregt, die gegen einen weiteren Bereich von Krankheitserregern sowie auch gegen resistente Stämme besonderer Mikroorganismen aktiv sind.