HU189548B - Process for preparing a-4696 antibiotic complex and single components thereof - Google Patents

Process for preparing a-4696 antibiotic complex and single components thereof Download PDF

Info

Publication number
HU189548B
HU189548B HU813813A HU381381A HU189548B HU 189548 B HU189548 B HU 189548B HU 813813 A HU813813 A HU 813813A HU 381381 A HU381381 A HU 381381A HU 189548 B HU189548 B HU 189548B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibiotic
component
atcc
water
components
Prior art date
Application number
HU813813A
Other languages
English (en)
Inventor
Manuel Debono
Kurt E Merkel
Robert E Weeks
Herald J Cole
Original Assignee
Eli Lilly And Co,Us
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Co,Us filed Critical Eli Lilly And Co,Us
Publication of HU189548B publication Critical patent/HU189548B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/045—Actinoplanes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/19—Antibiotic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/27—Cyclic peptide or cyclic protein

Description

A találmány tárgya eljárás az A-4696 aktaplanin antibiotikum komplex B„ B2, B3, Cla, C3 és E, új komponense előállítására. Ezek antibakteriális és anlimikrobiális szerként, valamint a növekedés elősegítésére alkalmazhatók a baromfi-, sertés-, birkaés borjútenyésztésben.
A találmány általános szempontból kapcsolatban áll azokkal a találmányokkal, amelyeket az 1976. április 20-án megadott, 3 952 095 sz., egy új antibiotikumra és ennek előállítási eljárására vonatkozó, az 1977. december 20-án megadott, 4 064 233 sz., az A-4696 antibiotikumra vonatkozó és az 1978. szeptember 19-én megadott 4 115 552 sz., az A-4696 antibiotikum A és B komponensére vonatkozó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek.
Az A-4696 antibiotikumnak a 4 064 233 sz. és 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szereplő B komponense nem azonos a jelen bejelentés szerinti komponensekkel. Továbbá: a találmány elsőbbségi napja előtt az A4696 antibiotikumnak a bevezetőben említett korrtponensei közül egyik sem volt ismert, méltatott és ezek egyikének létezését sem tételezték fel. Az előbbi szabadalmi leírások ténylegesen azt a kitanítást tartalmazzák, hogy bármilyen további tényező vagy kromatográfiás folt csupán „a kromatográfiás eljárásokkal összefüggő műtermék”, ezért kitanításuk eltávolít a találmány tárgyától.
Azt találtuk, hogy az aktaplanin A-4696 antibiotikum új komponensei - az alábbiakban leírt B,, B2, B3, Cla, C3 és E, - hatékony antibakteriális és antimikrobiális szer. Ezek a komponensek növelik a növekedési sebességet és javítják a tápanyaghasznosítás hatásfokát a baromfiban, sertésben, birkában és borjúban.
Az A-4696 antibiotikum Bn B2, B3, Cla, C3 és E, komponenseit olyan A-4696 komplexből különítjük el, amelyet az Actinoplanes missouriensis ATCC 31 680, ATCC 31 682 vagy ATCC 31 683 mikroorganizmus tenyésztésével állítunk elő. A fermentációt asszimilálható szénhidrát, nitrogén forrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon állítjuk elő a süllyesztett aerób tenyésztés körülményei között és a fermentációt addig folytatjuk, amíg jelentős antibiotikus aktivitás nem képződik.
A tápanyaghasznosítás kérődzőkben való hatásfok-növelésére irányuló eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a kérődző állatoknak az A-4696 antibiotikum komplexből Vagy az A-4696 komplex Bt, B2, B3, Cla, C3 és/vagy E, komponenséből vagy ezeknek egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sójából a növekedés elősegítéséhez szükséges mennyiséget adagolunk tápanyag, táp-premix vagy tápanyagadalék formájában.
A csirkék növekedésének elősegítésére irányuló eljárás abból áll, hogy a csirkének a táplálékába vagy ivóvízébe az A-4696 antibiotikum komplex vagy az új komponensek - B,, B2, B3, Cla, C3 és/ vagy E, - vagy ezek egy gyógyászatilag elfogadható sója növekedést elősegítő mennyiségét adagoljuk be.
A találmány az A-4696 aktaplanin antibiotikum új B„ B2, B3, Cla, C3 és E, komponensei előállítására vonatkozik. A találmány értelmében az A-4696 2 antibiotikum új komponenseit az A-4696 antibiotikumból különítjük el, az utóbbit pedig úgy állítjuk elő, hogy egy, az Actinoplanes genushoz tartozó mikroorganizmust táptalajban tenyésztünk mindaddig, amíg a fermentlében jelentős antibakteriális aktivitás nem mutatható ki.
Nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) kimutatható, hogy a fentemlitett hasonló tárgyú bejelentésekben leírt A-4696 antibiotikum komplex több, eddig ismeretlen komponensből áll, amelyeket Bt, B2, B3, Cla és C3 jelzéssel jelölünk. Egy további komponens, amelyet E,-nek nevezünk, ugyancsak elkülöníthető az A-4696 antibiotikum komplexből; ez esetleg bomlástermék. A komponensek kémiai, fizikai és biológiai tulajdonságai arra mutatnak, hogy ezek új antibiotikumok és hogy - esetleg az E, komponens kivételével
- ugyanabból a peptid magból, egy aglükonból, egy aminocukorból, és változó mennyiségű glukózból, mannózból és ramnózból állnak. Bár az E, komponens a legtöbb vonatkozásban hasonló a többi komponenshez, lehetséges, hogy peptid magja ezekhez képest módosult. Az aglükon keletkezésének az A-4696 komplex ill. az egyes komponensek hidrolízise alatt végzett bioautográfiás követése arra mutat, hogy rövid idő alatt egy egyszerű keverék képződik, amely antimikrobiálisan aktív pszeudoaglükonból és aglükonból áll. Lehetséges, hogy az A-4696 komplex és az egyes komponensek antimikrobiális aktivitásának helye a peptid-pszeudo-aglükon, mimellett a komponensek lényegében a semleges cukor összetétel tekintetében térnek el egymástól. A kapcsolódó cukrok szerepe főként az lehet, hogy módosítják az oldhatóságot és más fontos farmakodinamikai paramétereket. A találmány szerinti antibiotikus komponensek funkcionálásának vagy keletkezésének mechanizmusa azonban nem képezi a találmány tárgyát és nem áll szándékunkban bármiféle korlátozás bevezetése a hatásmódra vonatkozó közlések révén.
A találmány szerinti antibiotikus komponenseket az A-4696 antibiotikumból különítjük el, amelyet úgy állítunk elő, hogy az Actinoplanes missouriensis mikroorganizmust vizes táptalajban tenyésztjük, süllyesztett fermentációs körülmények között. Az A-4696 antibiotikum komplexet először elkülönítjük a fermentléből, majd folyadékkromatográfiával elkülönítjük az egyes komponenseket. A találmány szerinti antibiotikum komponenseket előnyösen hidrokloriddá vagy szulfáttá alakítjuk.
A bejelentés céljából az „A-4696 antibiotikum” kifejezést az aktaplanin antibiotikum komplex jelölésére használjuk, míg a komplexből elkülönített különböző komponenseket A-4696 antibiotikum komponenseknek - A, B,, B2, B3, Cja, C3, Ej stb.
- nevezzük. Az A-4696 antibiotikum és a belőle elkülönített egyes komponensek igen hatékonyak emberre és állatra nézve egyaránt patogén mikroorganizmusok növekedésének meggátlásában. A találmány szerinti antibiotikum komponensek ezenkívül a mezőgazdaságban alkalmazhatók, mint növekedést elősegítő anyagok, a baromfi-, sertés-, birka- és borjútenyésztésben.
Az A-4696 antibiotikum új B,, B2, B3, CIa, C3 és E, komponensei bázikus vegyületek, amelyek meg-21 .189 548 felelő savakkal sókat képesek alkotni. Ezek az A-4696 antibiotikumból különíthetők el, amelyet úgy állítunk elő, hogy egy, az Actinoplanes missouriensis specieshez tartozó mikroorganizmust táptalajban addig tenyésztünk, amíg jelentős antibiotikus aktivitás nem mutatható ki. Az antibiotikum komponensekre vonatkozóan a következőkben bemutatott jellemző adatok a hidrokloridokra értendők, bár ismert módszerekkel más, farmakológiailag elfogadható sók is előállíthatok.
A szilikagél-vékonyrétegkromatográfia (TLC), bioautográfia és a nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) arra mutat, hogy az A-4696 antibiotikum az elkülönítési eljárás során több olyan komponens keverékét szolgáltatja, amelyek antibiotikus aktivitást mutatnak. Az A-4696 antibiotikum komponenseknek nevezett A, B,, B2, B3, Cla, C3 és E, vegyület az A-4696 antibiotikumból poliamid oszlopon végzett kromatográfiával különíthető el. A kromatográfiás frakciókat UV-aktivitás és vékonyrétegkromatográfiás (TLC) eredmények alapján követjük, a tiszta A-4696 antibiotikum frakciókat tartalmazó, azonos viselkedésű kromatográfiás oldatokat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A kapott fagyasztva szárított kromatográfiás elegyek azonossága és tisztasága HPLC-vel határozható meg.
Az A-4696 antibiotikum A komponensét korábban már elkülönítették, lényegében a 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint. Az erre a komponensre vonatkozó adatokat csupán azért mutatjuk be, hogy elősegítsük a többi új A-4696 antibiotikum komponens elkülönítésének és jellemzésének illusztrálását, amely komponensek előállítása a bejelentés tárgyát képezi.
Az A-4696 antibiotikum bio-felülrétegzésével végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata, oldószerként 50 : 25 : 25 : 25 : 10 arányú metanol : kloroform : cc. ammóniumhidroxid : szekbutanol : víz elegyet és detektáló mikroorganizmusként Bac. subtilist alkalmazva a következő eredményeket adja:
A-4696 komponens Rf érték
A 0,25
B, 0,35
b2 0,45
b3 0,40
c,a 0,51
Az A-4696 antibiotikum i szobahőmérsékleten,
oldószerként 90 : 10 arányú 2%-os vizes ecet-
sav : CH3CN és 70 : 30 arányú 2%-os vizes ecet-
sav : CH3CN elegy felhasználásával végzett nagy-
nyomású folyadékkromatográfiája a következő
eredményeket adja:
A-4696 komponens R' érték
A t · 1,60
B, 1,99
b2 3,84
A-4696 komponens R' érték
b3 2,50
Cla 2,92
C3 4,23
E, 4,38
A TLC és a HPLC alkalmazásával több más, kisebb mennyiségben jelenlevő komponens is elkülöníthető az A-4696 antibiotikumból. Ezeket a komponenseket Clb, C^, C2h és D jelöléssel láttuk el; több vonatkozásban hasonlítanak az A-4696 antibiotikum A, B,, B2, B3, Cla, C3 és E, komponenséhez. Az A-4696 antibiotikum komplex ezenkívül tartalmazhat további, még nem azonosított komponenseket is. A kisebb mennyiségben jelenlevő komponenseket nem izoláltuk és tisztítottuk olyan mennyiségben, amely lehetővé tenné jellemzésüket.
Ha az A-4696 antibiotikumot vagy az A-4696 antibiotikum egyes komponenseit enyhén savas körülmények között hidrolizáljuk (5%-os metanolos sósav, visszafolyatás, 70 perc), pszeudo-aglúkon keletkezik. A pszeudo-aglükon kicsapódik a hidrolízis-elegyből és az A-4696 antibiotikum A, B„ B2, B3, Cla és C3 komponense esetében szerkezete az A) képlettel írható le.
Az A-4696 antibiotikum E, komponense esetében lehetséges, de nem bizonyos, hogy ez a pszeudo-aglükon kissé módosult.
Az A-4696 antibiotikum komplex és az egyes A-4696 antibiotikum komponensek hidrolíziselegye szűrletének papírkromatográfiás és TLC vizsgálata arra mutat, hogy a pszeudo-aglükon magon kívül a komplex és a komponensek egyaránt változó mennyiségű semleges cukrot tartalmaznak. Azt találtuk, hogy a semleges cukrok és ezek mólaránya az A, B„ B2, B3 és Cla A-4696 antibiotikum komponensek esetében a következő:
/. táblázat
A semleges cukrok mólaránya
Mannóz Glukóz Ramnóz
A 2,80 1,0 —
B, 2,05 1,0 1,01
b2 1,80 l.o -
b3 2,37 1,0 -
C,a 1.12 1,0 1,08
A cukrokat trimetil-szilil származékaik gázkromatográfiás elemzésével határozzuk meg. Az egyes cukrok az alfa- és a beta-izomer összegét jelentik.
Az A-4696 komponenseket lényegében semleges cukor-komponensük alapján különböztethetjük meg, amely ismeretlen helyen kapcsolódik a pszeudo-aglükonhoz.
Az A-4696 antibiotikum B, komponense hidroklórid formájában fehér kristályos vegyület, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben, és oldhatatlan egyes oldószerekben, amilyen
189 548 az éter, kloroform, benzol, aceton, alifás szénhidrogének, klórozott szénhidrogének stb. Vizes oldatban a kb. 4-kb. 9 pH-tartományban stabil kb. 27 °C-ig terjedő hőmérsékleteken.
Az A-4696 antibiotikum B, komponense hidrokloridjának mikroelemzése a következő közelítő elem-összetételt eredményezi (a fennmaradó menynyiséget az oxigén teszi ki): C 51,51; H 5,25; N 4,88; Cl 4,62. A közelítő molekulasúly, amelyet elméletileg határozunk meg, a pszeudo-aglükon és az ismert kapcsolódó cukrok alapján, 1954.
Az A-4696 antibiotikum Bj komponense hidrokloridjának UV abszorpciós maximuma vízben 280 nm-nél figyelhető meg; 42,8.
Az A-4696 antibiotikum Bj komponense hidrokloridjának IV abszorpciós spektrumát KBr-ban az 1. ábrán mutatjuk be. A 4000-700 cm ’1 tartományban megfigyelt megkülönböztethető abszorpciós maximumok a következők: 3380 széles, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831, 810 cm'.
Az A-4696 antibiotikum B2 komponense hidroklorid alakjában, fehér kristályos vegyület, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerben, és nem oldható egyes oldószerekben, amilyen az éter, kloroform, benzol, aceton, alifás szénhidrogének, klórozott szénhidrogének stb. Vizes oldatban a kb. 4-kb. 9 pH-tartományban stabil, kb. 27 °C-ig terjedő hőmérsékleteken.
Az A-4696 antibiotikum B2 komponense hidrokloridjának mikroelemzése a következő közelítő elemi összetételt mutatja (a fennmaradó mennyiséget oxigén teszi ki): C 51,96; H 4,67; N 5,72; Cl 5,88. A közelítő molekulasúly, amelyet elméletileg határoztunk meg a pszeudo-aglükon és az ismert kapcsolódó cukor molekulasúlyának összeadásával, 1808.
Az A-4696 antibiotikum B2 komponense hidrokloridjának UV abszorpciós maximuma vízben 280 nm-en lép fel; E[*.m = 44,7.
Az A-4696 antibiotikum B2 komponense hídrokloridjának IV abszorpciós spektrumát a 2. ábrán mutatjuk be. A megfigyelt megkülönböztethető abszorpciós maximumok a 4000-700 cm'1 tartományban a következők: 3409 széles, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210,1179,1121,1061, 1031, 1017,987, 903, 884, 1818 cm'.
Az A-4696 antibiotikum B3 komponense hidroklorid alakban fehér kristályos vegyület, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és oldhatatlan egyes oldószerekben, amilyen az éter, kloroform, benzol, aceton, alifás szénhidrogének, klórozott szénhidrogének stb. Vizes oldatban a kb.
4-kb. 9 pH-tartományban stabil, kb. 27 °C-ig terjedő hőmérsékleteken.
Az A-4696 antibiotikum B3 komponense hidrokloridjának mikroelemzése a következő közelítő elemi összetételt mutatja (a fennmaradó hányadot oxigén teszi ki): C 51,84; H 4,74; N 5,83; Cl 5,57. A közelítő molekulasúly, amelyet elméleti úton határozunk meg, apszeudo-aglükon és az ismert kap4 csolódó cukor molekulasúlyának összegeként,
1801.
Az A-4696 antibiotikum B3 komponense hidrokloridjának UV abszorpciós maximuma vízben, 280 nm-nél figyelhető meg; Ej*m = 46,3.
Az A-4696 antibiotikum B3 komponense hidrokloridjának IV abszorpciós spektrumát KBr-ban a
3. ábra mutatja be. A megfigyelt megkülönböztethető abszorpciós maximumok a 4000-700 cm' tartományban a következők: 3394 széles, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846, 816 cm'.
Az A-4696 antibiotikum Cla komponensé hidroklorid alakban fehér kristályos vegyület, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és nem oldható egyes oldószerekben, amilyen az éter, kloroform, benzol, aceton, alifás szénhidrogének, klórozott szénhidrogének stb. Vizes oldatban a kb. 4-kb. 9 pH-tartományban stabil, kb, 27 ’C-ig terjedő hőmérsékleteken.
Az A-4696 antibiotikum C,a komponense hidrokloridjának mikroelemzése a következő elemi összetételt mutatja (a fennmaradó mennyiséget oxigén teszi ki): C 53,05; H 4,74; N 5,83; Cl 5,39. A közelítő molekulasúly, amelyet elméleti úton határoztunk meg, a pszeudo-aglükon és az ismert kapcsolódó cukrok molekulasúlyának összegeként, 1792.
Az A-4696 antibiotikum Cla komponense hidrokloridjának UV abszorpciós maximuma, vízben, 279 nm-nél található; Ej*m = 47,9.
Az A-4696 antibiotikum Cla komponense hidrokloridjának IV abszorpciós spektrumát, KBrban, a 4. ábrán mutatjuk be. A megfigyelt megkülönböztethető abszorpciós maximumok a 4000-700 cm1 tartományban a következők: 3380 széles, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814, 715 cm'.
Az A-4696 antibiotikum C3 komponense, hidroklorid alakjában, fehér krstályos vegyület, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és nem oldható egyes oldószerekben, amilyen az éter, kloroform, benzol, aceton, alifás szénhidrogének, klórozott szénhidrogének stb. Vizes oldatban a kb. 4-kb. 9 pH-tartmányban stabil, kb. 27 °C-ig terjedő hőmérsékleteken.
Az A-4696 antibiotikum C3 komponense hidrokloridjának mikroelemzése a következő elemösszetételre mutat (a fennmaradó mennyiséget oxigén teszi ki): C 51,73; H 4,69; N 5,94; Cl 6,02.
Az A-4696 antibiotikum C3 komponense hidrokloridjának ÜV abszorpciós maximuma vízben 280 nm-nél figyelhető meg; £^ = 47,9.
Az A-4696 antibiotikum C3 komponense hidrokloridjának IV abszorpciós spektrumát KBr-ban az 5. ábra mutatja be. A megfigyelt megkülönböztethető abszorpciós maximumok a 4000-700 cm' tartományban a következők: 3378 széles, 2925,
1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573,
1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457,
1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121,
189 548
1075,1062, 1028, 1012,987,965,949,878,840,816, 769, 708 cm'.
Az A-4696 antibiotikum E, komponense hidroklorid alakjában fehér kristályos vegyület, amely oldódik vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és nem oldható egyes oldószerekben, amilyen az éter, kloroform, benzol, aceton, alifás szénhidrogének, klórozott szénhidrogének stb. Vizes oldatban a kb. 4-kb. 9 pH-tartományban stabil, kb. 27 °C-ig terjedő hőmérsékleteken.
Az A-4696 abntibiotikum E, komponense hidrokloridjának mikroelemzése a következő közelítő elem-összetételt mutatja (a fennmaradó mennyiséget oxigén teszi ki): C 50,71; H 4,70; N 9,01; Cl 1,84.
Az A-4696 antibiotikum E, komponense hidrokloridjának UV abszorpciós maximuma vízben 279 nm-nél jelentkezik; Ej*m = 39,9.
Az A-4696 antibiotikum E, komponense E, hidrokloridjának IV abszorpciós spektrumát, KBrban, a 6. ábrán mutatjuk be. A megfigyelt megkülönböztethető abszorpciós maximumok a 4000 700 cm 1 tartományban a következők: 3394 széles, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018,986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738, 714 cm1.
Azt állapítottuk meg, hogy az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, Clu, C3 vagy E, komponense hidrokloridjának antibiotikus aktivitása lényegében ugyanakkora Bac. subtilis-szel szemben, mint az A-4696 antibiotikumé (ennek leírását a 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tartalmazza).
A szakember számára ismert módszereket alkalmazva előállíthatjuk az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, Ckl, C3 és E, komponense gyógyászatilag elfogadható sóit ásványi savak, például sósav, hidrogénbromid, szulfonsav, foszforsav és hasonlók felhasználásával. Ezeknek a savaknak az antibiotikumokkal alkotott sói például oly módon állíthatók elő, hogy az antibiotikum mint szabad bázis oldatát a kívánt savval megsavanyítjuk és a sót acetonnak az oldathoz való hozzáadásával kicsapjuk. A sók egyes esetekben előállíthatók ioncserélő oszlopon végzett ioncserével is. Az antibiotikumsók előállítására más ismert módszerek is alkalmazhatók.
Az A-4696 antibiotikum új komponensei gátló hatást fejtenek ki sok, emberre, állatokra és növényekre patogén mikroorganizmus növekedésére, ezért felhasználhatók ilyen szervezetek növekedésének megszüntetésében. Azokat a koncentrációkat, amelyekben az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, Cla, C3 és E, komponense, hidroklorid alakban, gátolja egyes jellegzetes mikroorganizmusok növekedését, számszerűen az 1. és 2. táblázatban mutatjuk be. A gátló koncentrációkat agar-hígításos módszerrel határoztuk meg és minimális gátló koncentrációként (MIC, mikrogramm/ml) fejezzük ki.
Az agar-hígításos próbában a kísérleti organizmust agar lemezekre szélesztjük vagy azzal agar lemezeket oltunk be, amelyek az A-4696 antibiotikum komponensek hidrokloridját tartalmazzák, különböző koncentrációkban. A próbalemezeket órán át 37 °C-on inkubáljuk és az MIC-l úgy határozzuk meg, mint a legalacsonyabb antibiotikum-koncentrációt, amely a kísérleti mikroorganizmus növekedését gátolja.
Az eredmények a következők:
I. táblázat
MIC-agarhígításos módszer
Kísérleti organizmus Aktaplanin komponens, (baktérium) pg/ml
B, b2 B3 c,„
Staph. epi Hitchens1 32 8 2 2
Staph. epi. Dutt. 0,25 0,25 0,06 0,13
Staph. epi Bennet 16 4 2 1
Staph. aureus 4283 16 4 Ϊ 1
Staph. aureus 3055 4 2 1 1
Staph. aureus 3132 16 4 2 2
Staph. aureus H 25 4 2 2 1
Staph. aureus 3134 8 4 2 2
Staph. aureus 3123 8 4 1 2
Staph. aureus H 535 8 4 2 2
Staph. aureus 3131 8 4 2 1
Streptoc. D 282 csoport 2 2 0,5 0,5
Streptoc. D 238 csoport 2 2 0,5 0,5
Streptoc. D SS992 csoport 2 1 0,5 0,5
Streptoc. D 9901 csoport 2 2 0,5 0,5
Streptoc. D 9913 csoport 2 2 0,5 0,5
Streptoc. D 9933 csoport 2 2 0,5 0,5
Streptoc. D Guze csoport 2 1 0,5 0,5
Streptoc. D 12753F csoport 2 2 · 0,5 0,5
Streptoc. viridans 99432 0,5 1 0,25 0,5
Streptoc. viridans 9961 1 1 0,5 0,5
Streptoc. pyogenes C203 0,5 0,5 0,25 0,5
Streptoc. pyogenes DS663-72 0,5 0,5 0,5 0,5
Streptoc. pyogenes DS664-72 0,5 0,5 0,5 0,5
Streptoc. pneumoniae Paik I. 0,5 0,5 0,5 0,5
Streptoc. pneumoniae Typel4 0,5 0,5 0.5 0,5
Staph. aureus 3074 32 8 4 8
Streptoc. faecalis X66 1 1 0,5-nél
kisebb
A következő mikroorganizmusokra vonatkozó MIC érték valamennyi komponens esetében 128nál nagyobb:
Proteus morganii PR 15
Saltnonella typhosa SAI2
Kltbsiella pneumoniae KL14
Enierobaeler aerogenes EB 17
Serralia marcescens SE3
Estherichia coli EC14
Kísérleti organizmus Aktaplanin komponens, (baktérium) gg/ml
B, B2 B3 C|a
Citrobacter freundii CF17
Pseudomonas aeruginosa X239
Bordetella bronchiseptica 16
Salmonella typhimurium
Pseudomonas solanacearum XI85
Candida tropicalis A17
Trichophyton mentagrophytes 27
Aspergillus flavus E
Ceratocystis ulmi
Erwiiiia amylovora 64 128 128 128 1 MH agar, 1 : 500 inoknlum 2 MH agar, 1 : 10 inokulum 5% nyúl vér
2. táblázat
Minimális gátló koncentráció - agaroldásos módszer
Kísérleti organizmus (baktérium) Aktaplanin komponens (mg/ml)
c3 Ej
Staph. aureus XI. 1 2 16
Staph. aureus V41 1 16
Staph. aureus X400 2 16
Staph. aureus S13E 2 16
Staph. epidermidis 1 2 32
Staph. epidermidis 2 1 16
Streptoc. A C2O3 csoport 0,5 1
Streptoc. D X66 csoport 1 4
Streptoc. D 9960 csoport 2 8
Streptoc. pneumoniae Park 0,5 2
Haemophylus influenzáé 32 128-nál
érz. C.L. nagyobb
Haemophylus influenzáé 64 128-nál
réz. 76 nagyobb
E. coli TEM 128 128-nál
Clostridium difficile 2994 1 nagyobb 1
Clostridium perfringens 81 I 1
Clostridium septicum 1128 1 1
Eubacterium aerofaciens 1 1
1235 Peptococcus asaccharolyti- 0,5 1
cus 1302 Peptococcus prevoti 1281 128 128
Peptostreptococcus inter- 2 4
medius 1264 Propionibacterium acnes 79 1 1
Bacteroides fragilis 111 128 128-nál
Bacteroides fragilis 1877 128 nagyobb 128-nál
Bacteroides fragilis 1936B 64 nagyobb 128
Bacteroides thetaiotaomic- 64 128-nál
ron 1438 nagyobb
Bacteroides melaninogeni- 128 128-nál
cus 2736 nagyobb
Bacteroides vulgáris 1211 128 128-nál
6 nagyobb
189 548
Kísérleti organizmus (baktérium) Aktaplanin komponens (mg/ml)
c3 E,
Bacteroides corrodens 1874 128 128-nál nagyobb
Fusobacterium symbiosum 1470 32 128
Fusobacterium necrophorum 6054A 128 128-nál nagyobb
A következő mikroorganizmusok esetében az MIC érték mindkét komponens alkalmazásakor 128-nál nagyobb:
Shigella sonnei N9
E. coli N10
E. coli EC14
Klebsiella X26
Klebsiella KAE
Enterobacter aerogenes X68
Enterobacter aerogenes C32
Enterobacter aerogenes EB 17
Enterobacter cloaceae EB5
Enterobacter cloaceae 265A
Salmonella typhosa X514
Salmonella typhosa 1335
Pseudomonas aeruginosa X528
Pseudomonas aeruginosa X239
Pseudomonas aeruginosa Psl 8
Serratia marcescens X99
Settatia marcescens SE3
Proteus morganii PR 15
Proteus inconstans PR33
Proteus rettgeri PR7
Proteus rettgeri C24
Citrobacter freundii CF17
Bordetella bronchiseptica 16
Peptostreptococcus anaerobicus 1428 Bacteroides melaninogenicus 1856/28
Mint a fenti adatokból látható, az A-4696 antibiotikum B,, B2, Β3, Cla, C3 és Ej komponensének hidrokloridja hatékony antibakteriális és antimikrobiális szer, amely általában a patogén mikroorganizmusok elpusztítására alkalmazható. Ezenkívül az A-4696 antibiotikum B1; B2, B3, Cla, C3 vagy Ej komponensének vagy ezek savaddicíós sójának egy megfelelő fogkrémbe, gélbe, porba stb., vagy egy megfelelő szájvízbe vagy más száj-higiénés készítménybe való bevitele hatékony eljárást jelenthet a fog-caries és a fogazattal összefüggő betegségek kialakulásának meggátlására, amennyiben ezek baktériumok hatásával függnek össze. Egy másik megoldás szerint egy vagy több A-4696 antibiotikum komponens vagy ezek savaddicíós sója oldata, megfelelő koncentrációban, alkalmas pálcikával felvihető a fogínyre és a fogakra.
Az A-4696 antibiotikum B1( B2, B3, Cla, C3 és Ej komponense növekedést elősegítő hatást is mutat; gyorsítja a növekedést és fokozza a tápanyag-hasznosítást baromfi, sertés, birka és borjú esetében. Ha pl. egy vagy több, találmány szerinti antibiotikumot kb. 0,5-kb. 25 mg/testsúlykg napi mennyiségben baromfinak vagy sertésnek adagolunk be, a
189 548 növekedés gyorsabb és a tápanyag-hasznosítás nagyobb, mint azoknak az állatoknak az esetében, amelyek ugyanazt a tápot kapták, de az aktív komponens nélkül. Az „alap-táp” kifejezés az állat által elfogyasztott össz-táplálékot jelöli; ennek összetevői a különböző tápanyagok, koncentrátumok, adalékok, ásványi anyagok, vitaminok vagy gyógyászati készítményeket tartalmazó premixek, durva őrlésű táplálék stb., amelyek kielégítik az állat táplálkozási igényeit. A baromfi és sertés vonatkozásában tipikus alap-tápok találhatók a 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
A találmány szerinti eljárás egyik fontos foganatosítási módja esetében az A-4696 antibiotikum B,, B2, Β3, C,a, C3 vagy E, komponensét vagy ezek egy megfelelő származékát vagy keverékét orálisan visszük be, megfelelő tápanyagban, kb. 2-kb. 200 g/tonna össztáplálék mennyiségben, fokozott tápanyaghasznosítás és növekedést elősegítő aktivitás biztosítására. A találmány szerinti aktív A-4696 antibiotikum komponenseknek az állati táplálékhoz való hozzáadását előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy megfelelő táppremixet készítünk (amilyet pl. a 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet), amely kb. 1-200 gramm A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, C,.„ C3 vagy E, komponenst vagy ezek megfelelő származékát vagy keverékét tartalmazza a premix 1 kg-jára számítva. A kiegészített premixet ezután bevisszük a végső táplálékba. Egy másik megoldás szerint egy közti koncentrátumot vagy tápanyag-adalékot, amely az aktív komponenst tartalmazza, adhatunk hozzá a táphoz.
Bár az A-4696 antibiotikum új B,, B2, B3, Ch), C3 és E, komponense több különböző módon használható fel, különösen hatékonyak antibiotikumként. Ilyen típusú aktivitást mutató anyagokra mindig szükség van a mikrobiális alapú egészségügyi problémák megoldásához, ezeket általánosságban véve.
A találmány szerinti új antibiotikum komponenseket az A-4696 antibiotikumból különítjük el, ez utóbbit pedig úgy állítjuk elő, hogy egy vagy több Actinoplanes törzset aerób körülmények között, megfelelő táptalajon addig tenyésztünk, amíg a közegben jelentős antibiotikus aktivitás halmozódik fel. Az antibiotikum komponenseket különböző megfelelő elkülönítési és tisztítási eljárások alkalmazásával nyerhetjük ki.
Az A-4696 antibiotikum termeléséhez felhasznált mikroorganizmust az Actinoplanaceae családhoz tartozó Actinoplanes missouriensis törzsként azonosítottuk. Az Actinoplanes mikroorganizmus család az Actinomycetales rendhez tartozik, amelyet elsőként Dr. John N. Couch írt le (Jour. Elisha Mitchell Sci Soc., 65, 315-318, 1949 és 66, 87-92, 1950; Trans. New York Acad. Sci., 16, 315-318, 1954; Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148-155 és 269, 1955; Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 7. kiadás, 825-829, 1957; és Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, 53-70, 1963.
Az Actinoplanes missouriensis törzsek biológiailag tiszta tenyészeteit - amelyek felhasználhatók az A-4696 antibiotikum előállítására abból a célból, hogy a termelést követően elkülönítsük az A-4696 antibiotikum B,, B2, B3, Cla, C3 és E, komponenseit - az American Type Culture Collection-ben (Rockville, Maryland) helyeztük letétbe. Ezek a törzsgyűjtemény részét képezik és itt a köz számára korlátozás nélkül hozzáférhetők, ATCC 31680, ATCC 31682 és ATCC 31683 számon. Az ATCC 31682 törzs az A-4696 antibiotikum abból a célból végzett tenyésztésére használható, hogy abból a B, és a C,a A-4696 antibiotikum komponenst különítsük el; az ATCC 31680 törzs a B2 és C3 A-4696 antibiotikum komponens elkülönítése szempontjából hasznos, és az ATCC 31683 törzs a B3 és E, A-4696 antibiotikum komponens elkülönítéséhez alkalmazható.
Az ATCC 31680, ATCC 31682 és ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzsek a következőkben részletezett fizikai és tenyésztési tulajdonságokkal jellemezhető.
A három törzset mutáció-sorozattal állítottuk elő az ATCC 23342 törzsből, amelyet a 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertetett korábban. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott törzsek hasonló szubsztrátot vagy micéliumot képeznek és morfológiai tulajdonságaik alapján lényegében nem különböztethetők meg a kiindulási törzstől. Nem figyelhetők meg szekunder (lég-) micéliumok, sem sporangiumok, ezenkívül az olyan technikák, mint a pollen-szemcséken való tenyésztés, ugyancsak nem eredményeznek sporangiumokat.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott törzseket főként tenyésztési jellemzőik, különösen a primer micélium pigmentációja különbözteti meg. Az ATCC 31680 törzs micéliuma narancsszínű, amely a mérsékelt-barnás narancstól az erős narancsszínig terjed, a táptalajtól függően. Az ATCC 31682 és az ATCC 31683 törzs nem rendelkezik ilyen megkülönböztető színnel és sárgás-szürke micéliumot termel.
Az ATCC 31680, ATCC 31682 és ATCC 31683 törzs taxonómiai vizsgálatára alkalmazott módszerek a szakember számára ismertek. Ezek többnyire olyan módszerek, amelyeket a Shirling és Gottlieb által (Intern. J. of Systematic Bacteriol. 16(3), 313-340, 1966) leírt International Streptomyces Project (ISP) javasol. Az enzim-meghatározásokat Blazevic és Ederer módszerei szerint végeztük (Principles of Biochemical tests in Diagnostic Microbiology, J. Wiley and Sons, Inc., New York, 1975). A színek neveit, a rövidítéseket és számokat Kelly és Judd ISCC-NBS módszere szerint választottuk meg (The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample N° 2106, U.S. Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C., 1976). A lizozim-rezisztenciát és a kazein, eszkulin, hipoxantin, tirozin és xantin bontást Berg eljárása szerint (Appl. Microbiol. 25, 665-681, 1973) végeztük. Végeztünk szénforrás-hasznosítási kísérleteket is és az eredményeket a következőképpen minősítettük:
+ + = a glukóz-kontrollal azonos vagy annál nagyobb; pozitív hasznosítás + = a glukóz kontrolinál kisebb, a nem-szénkoiitrollnál kisebb; pozitív hasznosítás
-7I
189 548 ( +)= kérdéses a növekedés; kétséges hasznosítás — = nincs növekedés; negatív hasznosítás Ennek megfelelően a találmány szerinti Actinoplanes törzsek tenyésztési és fiziológiai jellemzőit magában foglaló taxonómiai leírást táblázatos alakban a következőkben mutatjuk be.
Az ATCC 31680 Actinoplanes törzs általános tenyésztési és fiziológiai jellemzői
Megfigyelt Jellemzők tulajdonság
Tenyésztési jellemzők a következő táptalajokon. ISP 2. sz. táptalaj
ISP 3. sz. táptalaj
ISP 4. sz. táptalaj
ISP 5. sz. táptalaj
ISP 7. sz. táptalaj
Bennett-f. agar
Kalciummalát
Czapek-f. agar
Glukóz-aszparagin
Paradicsompépzabliszt
Anio-Hensen-f. agar
53H táptalaj
Czapek-f. pepton
Kazein-bontás Kataláz-reakció Eszkulin-bontás Zselatin-folyósítás H2S képzés ISP 6. sz. táptalajon Hipoxantin-bontás Lizozim-rezisztencia 8 '
Bőséges növekedés, fonák 76.1.yBr; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 93.yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák
53. m.O; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fényes, fonák 5O.sO; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Jó növekedés, fonák
54. br.O; nincs légmicélium; világosbarna oldható pigment
Bőséges növekedés, fonák 53.m.O; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fényes, fonák 50.S.O; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Jó növekedés, fonák 50.S.O; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 53.m.O; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Bőséges növekedés, fonák
53. m.O; nincs légmicélium ; nincs oldható pigment Kismértékű növekedés, fonák 93.y-Gray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Kismértékű növekedés, fonák 91.d.-gyY; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Bőséges növekedés, fonák
54. br.C; nincs légmicélium ; nincs oldható pigment pozitív pozitív pozitív negatív nyomokban negatív negatív
Megfigyelt tulajdonság Jellemzők
Melanoid pigment a következő táptalajokon:
ISP 1. sz. negatív
ISP 6. sz. negatív
ISP 7. sz. negatív
ISP 7. sz., tirozin negatív
nélkül
NaCl tolerancia ISP 2, 2%
sz. táptalajon
Nitrát-redukció negatív
Foszfatáz-termelés pozitív
Lefölözött tej reakció negatív
Keményítő-hidrolízis negatív
ISP 4. sz. táptalajon
Szacharóz-tűrés ISP 2.
sz. táptalajon 20%
A növekedési hőmér-
séklet tartománya ISP 5-37 °C
2. sz. táptalajon
Tirozin-bontás negatív
Ureáz-termelés pozitív
Antibiotikum-érzé-
kenység:
cefalotin (Na), 30 pg érzékeny
eritromicin (esztolát), érzékeny
15 pg
kloromicetin, 30 pg érzékeny
novobiocin, 30 pg érzékeny
G-penicillin, 10 egység érzékeny
rifampin, 5 pg érzékeny
streptomicin, 10 pg érzékeny
tetraciklin, 30 pg érzékeny
vankomicin-HCl, 30 érzékeny
Xantin termelés negatív
Szénforrás-hasznosítás a következő komponense-
két tartalmazó ISP 9+ sz. táptalajon:
szénforrás nélkül -
glukóz + +
L-arabinóz + +
cellobióz + +
D-fruktóz + +
D-galaktóz + +
i-inozit —
D-mannit +
melibióz +
raffinóz +
D-ramnóz + +
D-ribóz (+)
szalicin +
szacharóz +
D-xilóz + +
+ A sterilizált szénforrásokat olyan mennyiségben
adagoltuk, hogy a végső koncentráció 1,0% legyen.
1-4696 antibiotikum- B2 és C3
faktor képzés
Az ATCC 31682 Actinoplanes törzs általános
tenyésztési és fiziológiai jellemzői
Megfigyelt Tellemznk
tulajdonság
Tenyésztési jellemzők : i következő táptalajokon:
ISP 2. sz. táptalaj Jó növekedés, fonák
9O.gy.Y; nincs légmicéli-
um; nincs oldható pigment
189 548
Megfigyelt tulajdonság
ISP 3. sz. táptalaj
Paradicsompépzabliszt
Anio-Hensen-f. agar
Jellemzők
Jó növekedés, fonák 93.yGray; nincs légmicéliura; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 79.1.gy.y.Br; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Jó növekedés, fényes, fonák 9O.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Jó növekedés, fonák 80.gy.yBr; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Bőséges növekedés, fonák 93.y-Gray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fényes, fonák 93.yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Bőséges növekedés, fonák 93.y-Gray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 93.yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Bőséges növekedés, fonák 91.d.-gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 91.d.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 91.d.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Bőséges növekedés, fonák 9O.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment pozitív pozitív pozitív pozitív (100%) nyomokban negatív negatív következő táptalajokon:
negatív negatív negatív negatív
2% negatív
6-8 pozitív negatív negatív
ISP 4. sz. táptalaj
ISP 5. sz. táptalaj
ISP 7. sz. táptalaj
Bennett-f. agar
Kalciummalát
Czapek-f. agar
Glukóz-aszparagin
Megfigyelt tulajdonság Szacharóz-tolerancia
2. sz. ISP-táptalajon A növekedési hőmér- 10-37 °C séklet-tartomány 2. sz. ISP-táptalajon
Tirozin-bontás pozitív
Ureáz-bontás pozitív
Antibiotikumérzékenység:
cefalotin (Na), 30 pg érzékeny eritromicin (esztolát), érzékeny 15 pg kloromicetin, 30 pg érzékeny novobiocin, 30 pg érzékeny G-penicillin, 10 egység érzékeny rifampin, 5 pg érzékeny streptomicin, 10 pg érzékeny tetraciklin, 30 pg érzékeny vankomicin-HCl,
Pg érzékeny
Xantin-termelés negatív
Szénforrás-hasznosi- — tás ISP 9+sz. táptalajon, a következő komponensek jelenlétében: szénmentes —
53H táptalaj
Czapek-f. pepton
Kazein-bontás Kataláz-reakció Eszkulin-bontás Zselatin-folyósítás H2S termelés 6. sz. IPS táptalajon Hipoxantin-bontás Lizozim-rezisztencia Melanoid pigmentek a ISP 1. sz.
ISP 6. sz.
ISP 7. sz,
ISP 7. sz., tirozin nélkül
NaCl tolerancia 2. sz. ISP táptalajon Nitrát-redukció A növekedés pHtartománya 2. sz. ISPtáptalajon Foszfatáz-termelés Lefölözött tej reakció Keményítő-hidrolízis 4. sz. ISP-táptalajon
Jellemzők
20%
glukóz + +
L-arabinóz + +
cellobióz + +
D-fruktóz + +
D-galaktóz + +
i-inozit -
D-mannit + +
melibióz +
raffinóz +
D-ramnóz +
D-ribóz +
szalicin +
szacharóz +
D-xiíóz + +
+ A sterilizált szénforrásokat olyan mennyiségben adagoltuk, hogy 1,0% végső koncentrációt biztosít-
sunk. A-4696 antibiotikum- A, Bn B2 és Cla
komponens termelés
Az ATCC 31683 Actinoplanes törzs általános tenyésztési és fiziológiai jellemzői
Jellemzők
Megfigyelt tulajdonság
Tenyésztési jellemzők a következő táptalajokon: ISP 2. sz. táptalaj Jó növekedés, fonák
90.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
ISP 3. sz. táptalaj Jó növekedés, fonák 93.yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
ISP 4. sz. táptalaj Jó növekedés, fonák 79.1.gy.yBr; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
ISP 5. sz. táptalaj Jó növekedés, fonák 90.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
189 548
Megfigyelt tulajdonság ISP 7. sz. táptalaj
Bennett-f. agar
Kalciummalát
Czapek-f. agar
Paradicsompépzabliszt
Anio-Hensen-f. agar
Czapek-f. pepton
53H táptalaj
Kazein-bontás
Kataláz-reakció
Eszkulin-bontás
Zselatin-folyósítás
H2S-termeIés ISP 6. sz.
táptalajon
Hipoxantin-bontás
Lizozim-rezisztencia
Jellemzők
Jó növekedés, fonák 80.gy.yBr; nincs légmicélium; világosbarna oldható pigment
Bőséges növekedés, fonák 93,yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fényes, fonák 93.yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment
Jó növekedés, fonák 93.yGray; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 91.d.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 91.d.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Jó növekedés, fonák 91.d.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment Bőséges növekedés, fonák 9O.gy.Y; nincs légmicélium; nincs oldható pigment pozitív pozitív pozitív pozitív (100%) nyomokban negatív negatív
Melanoid-pigment termelés a következő táptalajokon:
1SP 1. sz. negatív
1SP 6. sz. negatív
ISP 7. sz. negatív
ISP 7. sz., tirozin nél- negatív kül
NaCl-tolerancia
ISP 2. sz. táptalajon 2% alatt
Nitrát-redukció negatív
A növekedés pH-tartománya
ÍSP 2. sz. táptalajon 6-8,4
Foszfatáz-termelés pozitív
Lefölözött tej reakció negatív
Keményítő-hidrolízis
4. sz. ISP-táptalajon negatív
Szacharóz-tolerancia
2. sz. ISP-táptalajon 20%
A növekedés hőmérséklet-tartománya
ISP 2. sz. táptalajon 5-40 °C
Tirozin-bontás pozitív
Ureáz-termelés negatív
Antibiotikum-érzékenység:
cefalotin (Na), 30 pg érzékeny eritromicin (esztolát), érzékeny pg kloromicetin, 30 pg érzékeny novobiocin, 30 pg érzékeny
Megfigyelt tulajdonság
G-penicillin, 10 egység érzékeny
Jellemzők rifampin, 5 pg streptomicin, 10 pg tetraciklin, 30 pg vankomicin-HCl, 30 pg Xantin-termelés Szénforrás-hasznosítás ISP 9 vetkező komponensekkel:
érzékeny érzékeny érzékeny érzékeny negatív sz. táptalajon, a kőszén nélkül glukóz + +
L-arabinóz + + cellobióz + +
D-fruktóz + +
D-galaktóz + + i-inozit —
D-mannit + + melibióz + raffínóz +
D-ramnóz +
D-ribóz + szalicin + szacharóz +
D-xilóz + + + A sterilizált szénforrásokat olyan mennyiségben adagoltuk, hogy a vég-koncentráció 1,0% legyen. A-4696 antibiotikum- A, B1; B2 és B3 komponens termelés
Mint az előzőkben megjegyeztük, az ATCC 31680, ATCC 31682 és ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs táptalajban tenyészthető az A-4696 antibiotikum előállítására, amelyet az A4696 antibiotikum komponensek elkülönítésére használhatunk fel a továbbiakban. A táptalajt számos különböző táptalaj közül választhatjuk meg. A termelés gazdaságossága, a maximális kitermelés és az antibiotikum elkülönítésének egyszerűsége alapján azonban előnyben kell részesíteni bizonyos táptalajokat. így például a keményítő egyike a kitüntetett szénhidrát-forrásoknak, az élesztő pedig az egyik kitüntetett nitrogén-forrás. Más felhasználható szénhidrát-források: a melasz, glukóz, dextrin, glicerin és hasonlók. Nitrogén-forrásként alkalmazhatunk aminosav-keverékeket, peptonokat és hasonló anyagokat.
A táptalajba tápanyagként beviendő szervetlen sók a szokásos sókkal azonosak, amelyek nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, klorid, szulfát stb. ion leadására képesek. Ezenkívül adagolhatunk növekedési faktor forrásokat - például desztillációs maradékot és élesztőkivonatot amelyek kedvező hatást fejtenek ki az A-4696 antibiotikum komponensek előállítására.
Mint más mikroorganizmusok növekedése és fejlődése esetében, a találmány szerinti eljárásban alkalmazott Actinoplanes törzsek növesztésére használt táptalajba be kell vinnünk a növekedéshez és fejlődéshez szükséges elengedhetetlen nyomelemeket. Ezek a nyomelemek rendszerint a táptalaj egyéb komponensei adagolásával együttjáró szenynyeződésként biztosíthatók.
Az A-4696 antibiotikum abból a célból végzett tenyésztéséhez, hogy abból a továbbiakban a B,, B2, B3, Cla, C3 és E, antibiotikum komponenseket
-101
189 548 különítsük el, az alkalmazott mikroorganizmusok aránylag széles pH-tartományban tenyészthetők. Kívánatos azonban a mikroorganizmus kb. 6,5-7,0 pH-jú táptalajban való tenyésztése. Mint más Actinomyceták esetében is, a növekedési közeg pH-ja a növekedési periódus alatt folyamatosan változik. A fermentációs periódus végén a pH értéke rendszerint a kb. 6,5-7,5 tartományba esik.
Az A-4696 antibiotikum komponensek előállítására előnyösen süllyesztett fermentációs körülményeket alkalmazunk. A rázott lombikban való tenyésztéssel aránylag kis mennyiségű antibiotikum termelhető. Nagy mennyiségek előállítására ezért előnyben részesítjük a steril fermentorokban végzett süllyesztett aerób tenyésztést. A steril fermentorban jelenlevő táptalaj micélium-töredéket tartalmazó szuszpenzióval oltható be.
Ennek megfelelően célszerű előállítani a mikroorganizmus vegetatív inokulumát oly módon, hogy aránylag kis mennyiségű táptalajt beoltunk a mikroorganizmus micélium-fragmentumával és amikor fiatal, aktív vegetatív tenyészetet kapunk, ezt sterilen átvisszük a nagy fermentorba. A táptalaj, amelyben a vegetatív inokulumot tenyésztjük, azonos lehet azzal, amelyet az A-4696 antibiotikum komponensek nagyüzemi előállítására használunk, azonban más táptalajokat is alkalmazhatunk.
Az ATCC 31680, ATCC 31682 és ATCC 31683 Actinoplanes missoriensis törzs, amely A-4696 antibiotikum komponenst termel, 20-40 °C közötti hőmérsékleteken növekszik. A legnagyobb menynyiségű A-4696 antibiotikum komponens a megfigyelések szerint kb. 30 °C hőmérsékleten termelődik.
A süllyesztett aerób tenyésztési eljárás során a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A táptalajba bevitt levegő térfogata kb. 0,1-kb. 1,0 térfogat levegő/perc/táptalaj-térfogat között változtatható. A leghatékonyabb növekedés és antibiotikumtermelés akkor érhető el, ha a levegő térfogata legalább 0,5 térfogat/perc/táptalaj-térfogat.
Az A-4696 antibiotikum komponensek képződési sebességét és a táptalaj antbiotikum-koncentrációját a növekedési szakaszban oly módon követhetjük, hogy megvizsgáljuk a fermentléből vett minták antibiotikus aktivitását egyes mikroorganizmusokkal szemben, amelyekről ismeretes, hogy érzékenyek az antibiotikumra. Egyik ilyen vizsgálati mikroorganizmus, amely felhasználható a találmány szemléltetésére, a Bac. subtilis. A biológiai vizsgálatot a szokásos gyűrű-lemez eljárással, vagy agar-lemezeken végzett papírkorong próbával végezhetjük.
Az antibiotikum maximális termelése általában kb. 4-6 napon belül következik be rázott lombikokban vagy süllyesztett aerób fermentációban.
Az A-4696 antibiotikum - a B„ B2, B3, C,a, C3 és E, antibiotikum komponensek további elkülönítése céljából - izolálható a fermentléből és elválasztható más anyagoktól, amelyek esetleg jelen vannak. Erre a célra adszorpciósés extrakciós technikákat alkalmazhatunk. Előnyben részesítjük az adszorpciós megoldásokat, mivel ezekkel az eljárásokkal nem jár együtt nagy térfogatú oldószerek felhasználása, az extrakciós eljárásoktól eltérően.
Mivel a találmány szerinti eljárás szemléltetése lényegében ugyanazokra a szempontokra kell, hogy vonatkozzék, akár ATCC 31680 törzset (az A-4696 antibiotikum B2 és C3 komponense elkülö5 nítésére), akár ATCC 31682 törzset (az A-4696 antibiotikum B, és C,a komponense elkülönítésére), akár ATCC 31683 törzset (az A-4696 antibiotikum B3 és E, komponense elkülönítésére) alkalmazunk, egyszerűség kedvéért itt csupán az ATCC 31683 10 törzs alkalmazását mutatjuk be. Az 1. példa megfelelő helyein utalunk bizonyos eljárási különbségekre - a termelő táptalajjal kapcsolatban valamint az ATCC 31683 alkalmazási körülményeire. A találmány szerinti eljárást tehát a következő példák15 kai szemléltetjük.
1. példa 20 A) Rázott lombikos kísérletek
Az Actinoplanes missouriensis micélium-fragmentumait - ezt a mikroorganizmust egyszerűség kedvéért a következőkben az ATCC 31682 törzs jelképezi - ferde tápagarra visszük át, amelynek 2θ összetétele a következő:
Komponens Mennyiség, %
cerelóz 0,5
burgonya-dextrin 2,0
Nutrisoy liszt+ 1,5
élesztőkivonat 0,25
CaCO3 0,1
agar 2,0
+ A nutrisoy lisztet az Archer Daniels Midland Company-tól (Decatur, Illinois) szerezhetjük be. Az ATCC 31682-vel beoltott ferde agart 6 napon át 30 °C-on inkubáljuk. A tenyészet nem képez spórákat, így a micélium-növekményt steril pipettával kell fellazítanunk. A lekapart érett tenyészetet steril desztillált vízzel fedjük le és a pipettával vagy egy steril pálcával alaposan eldörzsöljük micélium-
szuszpenzió előállítására.
Az így kapott szuszpenziót arra használjuk, hogy beoltsunk 100 ml steril vegetatív táptalajt, amely a
következő összetételű:
Komponens Mennyiség, %
cerelóz 0,5
burgonya-dextrin 2,0
Nutrisoy liszt 1,5
élesztőkivonat 0,25
CaCO3 0,1
Az inokulált vegetatív táptalajt 48 órán át tenyésztjük 30 °C-on, körrázógépen (250 ford./perc).
A beoltott vegetatív tenyészet 10 ml-ével 100 ml,
következő összetételű „ugrató” táptalajt oltunk be:
Komponens Mennyiség, % cerelóz 65 élesztő
0,5
0,25
-111
189 548
Komponens Mennyiség, %
Nutrisoy liszt 1,5
kukoricakeményítő 2,0
CaCO3 0,1
Ság 471 0,05
A beoltott „ugrató” táptalajt 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk, körrázógépen (250 ford./perc), állandó
rázatás mellett.
Az „ugrató” közeg 0,4-0,4 ml-nyi mennyiségével 100 ml alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk be, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban (sterilezés;
121 ’C, 30 perc).
Komponens Mennyiség, %
cerelóz 1,0
kukoricakeményítő 3,5
szacharóz 3,0
melasz 1,5
élesztő 1,0
Proflo (gyapotmagliszt) 1,0
CaCO3 0,2
K2HPO4 0,05
(NH4)2SO4 0,025
MgSO4 · 7H2O 0,5
Ság 471 0,03
A termelő közeget kb. 96 órán át rázatjuk 30 ’C hőmérsékleten, 250 ford./perc sebességgel üzemelő rázógépen. A fermentációs ciklus végén a pH kb.
8,0.
Az A-4696 antibiotikum B3 és E, komponense
előállítására az ATCC 31683 törzset alkalmazzuk;
az „ugrató” táptalaj előállítása az előbbiek szerint
történik. Az ATCC 31683 törzs „ugrató” tenyésze-
tének 0,4-0,4 ml-ével 100 ml alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk be, 500 ml-es Erlenmeyerlombikokban (sterilezés: 121 ’C, 30 perc).
Komponens Mennyiség, %
cerelóz 1,0
élesztő 2,0 .
CaCO3 0,2
K2HP04 0,05
(NH4)2SO4 0,025
Ság 471 0,03
A termelő fermentációs tenyészetet kb. 96 órán át rázatjuk 30 ’C hőmérsékleten, 250 ford./perc sebességgel üzemelő rázógépen. A fermentációs ciklus végén a pH kb. 8.0.
B) 40 literes fermentorban végzett fermentáció
Az inokulum előállítását az A) pontban leírtak szerint végezzük, az „ugrató” táptalaj beoltásával bezárólag. 25 liter fenti összetételű termelő táptalajt autoklávban 121 °C-on 30 percen át sterilezünk és átviszünk egy 40 liter térfogatú fermentorba. A steril termelő táptalajt 100 ml „ugrató” tenyészettel oltjuk be. A beoltott termelő táptalajban 4 napon át 30 ’C-on folytatjuk a fermentációt. A le12 vegőztetést steril levegővel végezzük, kb. 0,5 térf. levegő/térf. táptalaj/perc mennyiségben. A fermentációs táptalajt a levegő és a közeg megfelelő elegyedése biztosítására - lapátos keverővei kevertetjük. A tenyésztő közeg pH-ja a kiindulási szintről - kb. 6,5 - folyamatosan növekszik a fermentáció előrehaladásával, kb. 8,0-ra.
C) Az A-4696 antibiotikum elkülönítése
Az előbbi eljárással előállított 3800 liter térfogatú fermentlevet 5 súly/térf. % szűrési segédanyag (Celite 545) hozzáadása után szűrünk. A szűrőlepényt 3600 liter ionmentes vízben felszuszpendáljuk és a vizes szuszpenzió pH-ját vizes nátriumhidroxid alkalmazásával 10,5-re állítjuk be. A szuszpendált szilárd fázist szűréssel elkülönítjük és vízzel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékokat egyesítjük és a kapott oldatot 20 súly/térf. %-os vizes kénsavval megsavanyítjuk, pH 4,5-re. A savas oldatot 1 % szűrési segédanyag (Celite 545) alkalmazásával szűréssel derítjük. A tiszta oldatot 1,8 x 5 láb méretű oszlopon vezetjük át, amely 350 liter Amberlite IR-116 gyantát (Na+ alakban) tartalmaz és az oszlopot ionmentes vízzel (1200 liter) mossuk. Az IP—116 gyantát eltávolítjuk az oszlopból és szakaszosan - összesen 1000 liter - vizes nátriumhidroxid-oldattal (pH 10,5) eluáljuk. A gyanta eluátumát semlegesítjük (pH 7), 20 súly/térf. %-os vizes kénsav-oldat felhasználásával, majd három részletben mossuk összesen 150 liter ionmentes vízzel. A vizes mosófolyadékokat semlegesítjük és egyesítjük a semlegesített eluátummal. A kapott oldatot betöményítjük, majd fagyasztva szárítjuk. A nyers komplex színe cserszínű és sötétbarna között változik.
D) A sók eltávolítása a nyers A-4696 antibiotikumból
A nyers komplexet (1,0 kg) lassan, erőteljes kevertetés mellett ionmentesített vízhez (1,5 liter) adjuk hozzá. A kapott szuszpenziót 20 percen át kevertetjük, majd 10%-os vizes ammóniumhidroxid oldat alkalmazásával semlegesítjük (pH 7). Az oldhatatlan A-4696 antibiotikum komplexet vákuumszűréssel elkülönítjük, ionmentes vízzel mossuk és fagyasztva szárítjuk. Közel 80%-os kitermeléssel (a biológiai aktivitás alapján) kapjuk a szárított, sómentes komplexet.
E) A sómentesített A-4696 antibiotikum komplex tisztítása
A szárított, sómentesített komplexet (300 g) ionmentes vízben (2 liter) oldjuk és a szuszpenzió pHját 3N vizes sósav hozzáadásával 2,7-re állítjuk be. A megsavanyított oldatot 40 percen át 2500 ford./ perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és rávisszük egy oszlopra (8 x 85 cm), amely 6 liter színtelenítő gyantát (Duolite S761) tartalmaz. Az aktív anyagot ionmentes vízzel eluáljuk, 30 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluciót vékonyrétegkromatográfiával követjük. Az A-4696 antibiotikumot tartalmazó effluenst betöményítjük (3 mm, 35 °C) 3 liter térfogatra és fagyasztva szárítjuk. A színtelenített komplexet fehér-cserszinü anyag alakjában nyerjük ki, kb. 70%-os kitermeléssel (a biológiai aktivitás alapján).
-121
189,548
F) Az A-4696 antibiotikum B1; B2, B3, Cla, C3 és E, komponense hidrokloridjának kinyerése.
g szárított, színmentesített A-4696 antibiotikum komplexet 100 ml ionmentes vízben oldunk. A kapott vizes oldatot szűrjük és felvisszük egy kromatográfiás oszlopra (5 * 100 cm), amely 2 liter poliamidot (Machery and Nagel SC6) tartalmaz. Az oszlopot ionmentes vízzel eluáljuk és 200- 300 ml térfogatú eluátumot (25-25 ml-es frakciókból) gyűjtünk össze. Az eluciót az UV-aktivitás alapján és vékonyrétegkromatográfiával követjük. A vékonyrétegkromatográfiás azonosság alapján egyesítjük a frakciókat és fagyasztva szárítjuk ezeket. Egyes elkülönítési műveletek esetében az oszlop hosszúságát meg kell kétszereznünk (200 cm), a két poliamid oszlop sorbakapcsolásával. A további tisztítás a kromatografálás ismétlésével érhető el.
Az előbbi A)-F) pontban részletezett műveleteket hajtjuk végre az ATCC 31682 törzs alkalmazása esetén, amikor az A-4696 antibiotikum B, és Cla komponens elkülönítését kívánjuk elérni; az ATCC 31680 törzs alkalmazása esetén, amikor az A-4696 antibiotikum B2 és C3 komponensét kívánjuk elkülöníteni és az ATCC 31683 törzs alkalmazása esetén,'az A-4696 antibiotikum B3 és Ej komponensének elkülönítésére. Bár az említett komponensek elkülönítésére más Actinoplanes törzseket is alkalmazhatunk, a tárgyalt törzseket előnyben részesítjük az A-4696 antibiotikum komponensek elkülönítése szempontjából, amelyek előállítása a találmány tárgyát képezi.
A következőkben írunk le egy másik eljárást az A-4696 antibiotikum B2, B3, Cla, C3 és E, komponense - hidroklorid alakban történő - elkülönítésére, egyetlen Actinoplanes missouriensis törzs felhasználásával:
200 mg szárított, színtelenített A-4696 antibiotikumot - amelyet, komplexként, a 31683 törzs alkalmazásával állítunk elő, az 1. példa A)-F) pontja szerint - kb. 2 ml desztillált vízben oldunk. A kapott vizes oldatot szűrjük és oszlopkromatográfiával különítjük el a komponenseket, fordított fázisú adszorbensek - pl. a Li ChroprepR RP-18 (E. Merck, Darmstadt, NSZK)-stacionárius fázisként való alkalmazásával, mobilis fázisként trietilaminfoszfátot tartalmazó vizes acetonitril oldatokkal. A szakember számára ugyan nyilvánvaló, hogy az acetonitril oldatok koncentrációját (illetve a koncentráció-gradienst) az adott fermentációs termék összetétele függvényében változtatni kell, mégis jelezzük, hogy egy kitüntetett koncentráció-gradiens a 10-40%. Az oszlopról távozó folyadékot az UVaktivitás alapján követjük és felfogjuk az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat. Az acetonitrilt magas vákuumban ledesztilláljuk és fagyasztva szárítjuk a kapott vizes oldatokat. A fagyasztva szárított kromatográfiás frakciókat ezután desztillált vízben újra oldjuk, fordított fázisú adszorbensen - ilyen pl. a Sep PakR C18 patron (Waters Associates Inc., Milford, Massachusetts) adszorbeáltatjuk és 50%-os vizes metanollal eluáljuk. Az egyes A-4696 antibiotikum komponenseket tartalmazó vizes oldatokat szárazra pároljuk és a tisztított A-4696 antibiotikum komponenseket száraz amorf termék alakjában nyerjük ki.
2. példa
Az A-4696 antibiotikum Bj, B2, B3, Cla, C3 és E, komponense szulfát alakban való előállítása
300 mg A-4696 antibiotikumot - amelyet az 1. példa A) D) pontja szerint állítunk elő 2 liter ionmentesített vízben oldunk és a szuszpenzió pHját 3N vizes kénsav hozzáadásával 2,7-re állítjuk be. A megsavanyított oldatot 40 percen át 2500 ford./perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és felvisszük egy oszlopra (8 x 85 cm), amely 6 liter színtelenítő gyantát (Duolite S761) tartalmaz. Az aktív anyagot ionmentesített vízzel eluáljuk 30 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az eluciót vékonyréteg-kromatográfiával követjük. Az A-4696 antibiotikumot tartalmazó effluenst 3 liter térfogatra töményítjük be (3 mm, 35 ’C) és fagyasztva szárítjuk. A színtelenített komplexet fehér-cser színű szilárd anyag alakjában nyerjük ki, kb. 70%-os kitermeléssel (a biológiai aktivitás alapján). Az egyes A-4696 antibiotikum komponenseket - B,, B2, B3, C,a, C3 és E, szulfát - az I. példa F) pontja szerinti eljárással különítjük el.

Claims (7)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás A-4696 antibiotikum komplex és B,, B2, B3, Cla, C3 és E, komponenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC 31680, ATCC 31682 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzset asszimilálható szénhidrát- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajban süllyesztett aerób fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd a komplexet elválasztjuk a tenyészléből, és kívánt esetben a komplexet önmagában ismert módon komponenseire választjuk szét.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum B, komponense vagy ennek egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és oldhatatlan éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szénhidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele 51,51% szén, 5,25% hidrogén, 4,88% nitrogén, 4,62% klór és a fennmaradó hányad oxigén; közelítő elméleti mokekulasúlya 1954; UV abszorpciós maximumot mutat vízben 280 nm-en, amelynek értéke Ε[ζη, 42,8; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja a KBrben felvett IV abszorpc’ós spektrumban: 3380 széles, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 és 810 cm-1, azzal jellemezve, hogy ezt a komponenst az ATCC 31682 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs által termelt A4696 komplexből különítjük el.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum B2 komponense vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles
    -131
    189 548 és poláris oldószerekben és oldhatatlan éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szénhidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele 51,96% szén, 4,67% hidrogén, 5,72% nitrogén, 5,88% klór és a fennmaradó hányadot oxigén teszi ki; közelítő elméleti molekulasúlya 1808; UV abszorpciós maximumot mutat vízben 280 nm-nél, Ej*m 44,7; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja a KBr-ban felvett IV abszorpciós spektrumban: 3409 széles, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884 és 818 cm'1, azzal jellemezve, hogy a komponenst az ATCC 31680 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs által termelt A-4696 komplexből különítjük el.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum B3 komponense vagy ennek egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és oldhatatlan éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szénhidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele: 51,84% szén, 4,74% hidrogén, 5,83% nitrogén, 5,57% klór és a fennmaradó hányadot oxigén teszi ki; közelítő elméleti molekulasúlya 1808; UV abszorpciós maximumot mutat vízben 280 nm-nél, E[*m 46,3; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja a KBr-ban felvett IV abszorpciós spektrumban: 3394 széles, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 és 816 cm azzal jellemezve, hogy ezt a komponenst az ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs által termelt A-4696 komplexből különítjük el.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum Cla komponense vagy ennek egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és oldhatatlan éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szénhidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele: 53,05% szén, 4,74% hidrogén, 5,83% nitrogén, 5,39% klór és a fennmaradó hányadot oxigén teszi ki; közelítő elméleti molekulasúlya 1792; UV abszorpciós maximumot mutat vízben 279 nm-nél, Ej*m 47,9; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja, a KBr-ban felvett IV abszorpciós spektrumban: 3380 széles,
    2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427,
    1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061,
    1032, 1017, 987, 903, 832, 814 és 715 cm azzal jellemezve, hogy ezt a komponenst az ATCC 31682 5 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs által termelt A-4696 komplexből különítjük el.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum C3 komponense vagy ennek egy gyó10 gyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidrokloridként fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és oldhatatlan éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szén15 hidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele: 51,73% szén, 4,69% hidrogén, 5,94% nitrogén, 6,02% klór és a fennmaradó hányadot oxigén teszi ki; UV abszorpciós maximu20 mOt mutat v'z^en 280 nm-en, E',*m 47,9; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja a KBrban felvett abszorpciós spektrumban: 3378 széles, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579,
    1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, „ 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206,
    1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878,
    840, 816, 769, 708 cm’1, azzal jellemezve, hogy ezt a komponenst az ATCC 31680 vagy ATCC 31683 Actinoplanes missouriensis törzs által termelt 30 A-4696 komplexből különítjük el.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás az A-4696 antibiotikum E, komponense előállítására vagy ennek egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sója előállítására, amely komponens hidroklorid 35 alakban fehér, kristályos anyag, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben és nem oldható éterben, kloroformban, benzolban, acetonban, alifás szénhidrogénekben és klórozott szénhidrogénekben; közelítő összetétele: 50,71% 4Q szén, 4,70% hidrogén, 9,01% nitrogén, 1,84% klór és a fennmaradó hányadot oxigén teszi ki; UV abszorpciós maximumot mutat vízben 279 nm-nél, Ej*m 39,9; és a következő megkülönböztethető sávokat mutatja a KBr-ban felvett IR abszorpciós 4Ö spektrumban: 3394 széles, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738 és 714 cm’', azzal jellemezve, hogy a kom50 ponenst az ATCC 31683 által Actinoplanes missouriensis törzs által termelt A-4696 komplexből különítjük el.
HU813813A 1980-12-18 1981-12-17 Process for preparing a-4696 antibiotic complex and single components thereof HU189548B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/217,962 US4322406A (en) 1980-12-18 1980-12-18 Antibiotic A-4696 factors B1, B2, B3, C1a, C3 and E1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU189548B true HU189548B (en) 1986-07-28

Family

ID=22813191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU813813A HU189548B (en) 1980-12-18 1981-12-17 Process for preparing a-4696 antibiotic complex and single components thereof

Country Status (26)

Country Link
US (1) US4322406A (hu)
EP (1) EP0055070B1 (hu)
JP (1) JPS57132888A (hu)
KR (1) KR850001503B1 (hu)
AR (1) AR228377A1 (hu)
AT (1) ATE23192T1 (hu)
AU (1) AU547906B2 (hu)
CA (1) CA1171008A (hu)
CS (1) CS228909B2 (hu)
DD (2) DD202048A5 (hu)
DE (1) DE3175527D1 (hu)
DK (1) DK562281A (hu)
ES (1) ES508085A0 (hu)
FI (1) FI813958L (hu)
GB (1) GB2089814B (hu)
GR (1) GR77286B (hu)
HU (1) HU189548B (hu)
IE (1) IE51883B1 (hu)
IL (1) IL64485A (hu)
NZ (1) NZ199197A (hu)
PH (1) PH18801A (hu)
PL (1) PL134197B1 (hu)
PT (1) PT74137B (hu)
RO (1) RO82520A (hu)
YU (1) YU292881A (hu)
ZA (1) ZA818632B (hu)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4604239A (en) * 1982-03-24 1986-08-05 Eli Lilly And Company Antibiotics
FI75190C (fi) * 1982-03-24 1988-05-09 Lilly Co Eli Foerfarande foer framstaellning av ett antibiotikum a41030-komplex eller dess faktorer a, b, c, d, e, f och g.
US4713331A (en) * 1982-03-24 1987-12-15 Eli Lilly And Company Microbial production of A41030 antibiotics
US4537770A (en) * 1982-03-24 1985-08-27 Eli Lilly And Company A41030 antibiotics
US4559323A (en) * 1982-03-24 1985-12-17 Eli Lilly And Company A41030 Antibiotics
IL68700A0 (en) * 1982-05-21 1983-09-30 Lilly Co Eli Improvements relating to a-21978c cyclic peptide derivatives and their production
US4524135A (en) * 1982-05-21 1985-06-18 Eli Lilly And Company A-21978C cyclic peptides
US4462942A (en) * 1982-07-30 1984-07-31 Eli Lilly And Company A47934 Antibiotic and process for production thereof
RO87735A2 (ro) * 1982-12-20 1985-10-31 Eli Lilly And Co,Us Procedeu de obtinere a antibioticului a 51568 cu structura gliceproteica
US4558009A (en) * 1982-12-20 1985-12-10 Eli Lilly And Company Process for producing antibiotic A-51568 by fermentation and microorganism
US4479897A (en) * 1983-04-27 1984-10-30 Eli Lilly And Company Actaplanin antibiotics
US4548974A (en) * 1983-07-13 1985-10-22 Smithkline Beckman Corporation Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer
US4672036A (en) * 1983-07-13 1987-06-09 Smithkline Beckman Corporation Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof
US4497802A (en) * 1983-10-21 1985-02-05 Eli Lilly And Company N-Acyl glycopeptide derivatives
US4587218A (en) * 1983-10-21 1986-05-06 Eli Lilly And Company Novel bioconverting microorganisms
US4537715A (en) * 1983-10-21 1985-08-27 Eli Lilly And Company Glycopeptide antibiotic CUC/CSV and process for its production
US4563442A (en) * 1983-10-21 1986-01-07 Eli Lilly And Company Glycopeptide bioconversion products
US4663282A (en) * 1983-10-21 1987-05-05 Eli Lilly And Company Glycopeptide antibiotic CUC/CSV and process for its production
US4504467A (en) * 1983-10-21 1985-03-12 Eli Lilly And Company Glycopeptide derivatives
US4558008A (en) * 1983-12-13 1985-12-10 Eli Lilly And Company Process for production of A-51568B antibiotic
AU579120B2 (en) * 1983-12-16 1988-11-17 Gruppo Lepetit S.P.A. Chemical process for preparing antibiotic L 17392 (deglucoteicoplanin) and its salts
US4558036A (en) * 1984-02-17 1985-12-10 Eli Lilly And Company Actaplanin antibiotics
US4859599A (en) * 1984-10-11 1989-08-22 The Dow Chemical Company Antibiotic A26201-1 and antibiotic A26201-2 produced by a novel strain of actinoplanes
US4613503A (en) * 1984-10-11 1986-09-23 The Dow Chemical Company Antibiotic A26201-1 and antibiotic A26201-2 produced by a novel strain of actinoplanes
GB8608798D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Recovery of glycopeptide antibiotics from aqueous solutions
GB8624251D0 (en) * 1986-10-09 1986-11-12 Erba Farmitalia "1,2-beta-methylene-4-substituted androstene-3,17 dione derivatives
US4939244A (en) * 1987-01-30 1990-07-03 American Cyanamid Company Pseudoaglycones of LL-E33288 antibiotics
US4845194A (en) * 1987-02-27 1989-07-04 Eli Lilly And Company Glycopeptide recovery process
US5213797A (en) * 1987-07-13 1993-05-25 Eli Lilly And Company A80407 antibiotics
US4996148A (en) * 1987-07-13 1991-02-26 Eli Lilly And Company A80407 antibiotics

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3952095A (en) * 1972-06-02 1976-04-20 Eli Lilly And Company Novel antibiotic and a process for the production thereof
US4064233A (en) * 1974-12-17 1977-12-20 Eli Lilly And Company Antibiotic A-4696
US4115552A (en) * 1976-04-19 1978-09-19 Eli Lilly And Company Factor A and B of antibiotic A-4696
GB1578480A (en) * 1977-05-19 1980-11-05 Lilly Co Eli Antibiotic a-35512 and process for production thereof
GB2045231B (en) * 1979-04-07 1983-08-03 Lepetit Spa Antibiotic a/16686 and its preparation from actinoplanes
CA1170598A (en) * 1979-12-13 1984-07-10 Bernard J. Abbott Process for the preparation of cyclic peptide nuclei

Also Published As

Publication number Publication date
AU547906B2 (en) 1985-11-14
PL234311A1 (hu) 1982-08-16
DK562281A (da) 1982-06-19
AR228377A1 (es) 1983-02-28
CS228909B2 (en) 1984-05-14
GB2089814A (en) 1982-06-30
DD204389A5 (de) 1983-11-30
GR77286B (hu) 1984-09-11
CA1171008A (en) 1984-07-17
DD202048A5 (de) 1983-08-24
ATE23192T1 (de) 1986-11-15
IE51883B1 (en) 1987-04-15
KR830007832A (ko) 1983-11-07
PL134197B1 (en) 1985-07-31
IE812971L (en) 1982-06-18
EP0055070B1 (en) 1986-10-29
IL64485A0 (en) 1982-03-31
NZ199197A (en) 1984-11-09
PT74137B (en) 1984-05-09
IL64485A (en) 1985-01-31
PT74137A (en) 1982-01-01
US4322406A (en) 1982-03-30
PH18801A (en) 1985-09-27
FI813958L (fi) 1982-06-19
YU292881A (en) 1983-10-31
DE3175527D1 (en) 1986-12-04
RO82520A (ro) 1983-09-26
ES8304203A1 (es) 1983-02-16
EP0055070A1 (en) 1982-06-30
JPS57132888A (en) 1982-08-17
GB2089814B (en) 1984-05-16
KR850001503B1 (ko) 1985-10-11
AU7859881A (en) 1982-06-24
RO82520B (ro) 1983-08-30
ES508085A0 (es) 1983-02-16
ZA818632B (en) 1982-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU189548B (en) Process for preparing a-4696 antibiotic complex and single components thereof
US4322343A (en) Pseudo-aglycone of actaplanin
DK161092B (da) Antibiotisk stof, fremgangsmaade til fremstilling deraf, farmaceutisk praeparat indeholdende det og mikroorganismestamme til brug ved fremstilling af det
DE602004005203T2 (de) Antibiotikum 107891, dessen Faktoren A1 und A2, pharmazeutisch annehmbare Salzeund Zusammensetzungen und Verwendung davon
US4375513A (en) Biologically pure culture of Actinoplanes missouriensis
HU200488B (en) Process for producing demannosyl teichoplanin derivatives
CA1210721A (en) Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum shearer gen. nov., sp. nov. atcc 39323
US4918054A (en) Antibiotics called `chloropolysporins B and C`, a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use
US4694069A (en) Kibdelosporangium aridum SK&F-AAD-609
AU679202B2 (en) Antibiotics GE 37468 A, B and C
CA1088441A (en) Antibiotics, neoviridogriseins, and their method of production
EP0211490B1 (en) Antibiotics of the vancomycin-class
US4672036A (en) Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof
JPH07114704B2 (ja) 抗生物質ａ４２８６７およびその付加塩
US4996148A (en) A80407 antibiotics
US5213797A (en) A80407 antibiotics
EP1481986A1 (en) Antibiotic 97518, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof
US4797280A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323
HU190430B (en) Process for producing inlusion complexes of beta-cyclodextrine and 17 hydroxy-7-alpha-mercapto-3-oxo-17-alpha-pregn-4-ene-21-carboxylic acid-gamma-lacton
HU190340B (en) Process for producing pseudoaglycon derivative of actaplanin