PL134197B1 - Process for preparing complex of a-4696 antibiotic or new b-1-downwards,b-2-downwards,b-3-downwards,c-1a-downwards,c-3-downwards or e-1-downwards agents of this antibiotic - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompleksu afcteplaninowego antybiotyku A-4606 albo nowych czynników Bi, B*, B3, Cia, C3 lub Ei tego antybiotyku;, jak równiez farmakologicznie do¬ puszczalnych soli addycyjnych tych zwiazków z kwasami.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku dzialaja skutecznie przeciw bakteriom i drob¬ noustrojom oraz sa srodkami pobudzajacymi roz¬ wój drobiu, trzody chlewnej, owiec i bydla. iPrzedimiot wynalazku wiaze sie ogólnie z wy¬ nalazkami ujawnionymi w kilku opisach patento¬ wych Stanów Zjednoczonych Ameryki, a miano¬ wicie w opisie nr 3 96B G96, dotyczacym nowego an¬ tybiotyku i sposobu jego wytwarzania, w opisie nr 4 0l6fl28|3, ujawniajacym antybiotyk A-4606 i w opisie nr 4H16 56B, w którym omówiono czynniki A i B antybiotyku A-409&.Czynnik B antybiotyku A-46I96 omówiony w opi¬ sach patentowych Stanów Zjedn. Ameryki nr 4 064I2&I3 i nr 4 l;li5 66f2 rózni sie od czynników an¬ tybiotyku A-409|& wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, które nie tylko nie byly dotychczas znane, ale nawet nde .podejrzewano ich istnienia.Faktycznie bowiem, wedlug wspomnianych wyzej opisów (patentowych jakiekolwiek dodatkowe czyn¬ niki luib plamy chromatograficzne stanowia jedy¬ nie „artefakty procesów chromatograficznych", a wiec informacje zawarte w tych publikacjach nie tylko nie sugeruja mozliwosci rozwiazania wedlug 10 15 20 25 wynalazku, ale nawet je wykluczaja.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze opisane nizej czynniki Bi, B^, B3, Cia, Cs i Ei antybiotyku akta- plaminowego A-4K59I0 dzialaja przeciw bakteriom i mikroorganizmom oraz przyspieszaja wzrost i zwie¬ kszaja stopien wykorzystania pokarmu u drobiu, trzody chlewnej, owiec i bydla.Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania kom¬ pleksu antybiotyku A-46196 albo nowych czynników Bi, B2, B3, Cia, Ca lub Ei tego antybiotyku, jak równiez farmakologicznie dopuszczalnych soli ad¬ dycyjnych tych zwiazków z kwasami, polega na tym, ze prowadzi sie hodowle mutantów szczepu Actinoplanes massounensdis ATOC 29342 (ATCC 3)1*080 lub ATOC 3)li6Bl2 luib ATOC 3(16813) na drodlze wglebnej fermentacji aerobowej na pozywce za¬ wierajacej zródla przyswajalnego wegla,, azotu i nieorganicznych soli, az do uzyskania produktu o duzej aktywnosci amtyfoiotycznej, po czym ewentu¬ alnie otrzymany produkt rozdziela sie na czynniki aktywne i ewentualnie prowadzi sie przemiane produktu w jego farmakologicznie dopuszczalne ad¬ dycyjne sole z kwasaimi.I tak, w przypadku wytwarzania czynnika Bi prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missou- riensis ATOC 3(16812 lub ATOC 311083 i z uzyska¬ nego kompleksu wyodrebnia sie zadany czynnik, w przypadku wytwarzJtnia czynnika Bg prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes masjsouriensis ATOC 311680 lub 31|6I8(3 i z uzyskanego kompleksu 1341971341*7 wyodrebnia sie zadany czynnik, w przypadku wy¬ twarzania czynnika B3 prowadzi sie hodowle szcze¬ pu Actinoplanes mdssouriensis ATCC 3188$ i z uzyskanego kompleksu wyodrebnia sie zadany czynnik, w przypadku wytwarzania czynnika da prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missou- riensis ATCC 91092 lufb ATOC 3108$ i z uzyska¬ nego kompleksu wyodrebnia sde zadany czynnik, w przypadku wytwarzania czynnika Cs prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATCC 91680 lub ATC 31688 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik, a w przy¬ padku wytwarzania czynnika Ei prowadzi sie ho¬ dowle, szczepu Actinoplanes nrtesouriensis ATCC ^l4» i z, uzyskanego kompleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. Kazdy z produktów mozna prze¬ prowadzic w }ego farmakologicznie dopuszczalna fcpog6b-xw4qilaraania stopnia wyfkorzystywania po¬ karmu przez zwierzeta przezuwajace przy uzyciu zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku polega na podawaniu tym zwierzetom po¬ wodujacej przyspieszenie ich wzrostu dawki kom¬ pleksu antybiotyku A^4Q96 albo czynników Bj, B* Bj, Cu, C9 ii/lub Ei tego antybiotyku albo kn far¬ makologicznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami w postaci paszy, przedmieszki albo do¬ datku do paszy.Sposób pobudzania wzrostu kurczat przy uzyciu zwiazków wytwarzanych sposobem wecHiug wyna¬ lazku polega na podawaniu im z pokarmem lub woda pitna pobudzajacej wzrost dawki komjpleksu antybiotyku A-4666 albo nowych, wspomnianych wyzej czynników Bi, B,, B* Cu, C» i/albo Ei tego antybiotyku lub ich farmakologicznie dopuszczal¬ nych soli addycyjnych z kwasami Badania metoda cieczowej chromatografii cisnie¬ niowej (HPDC) wykazuja, ze kompleks antybiotyku A-4096 opisany w podanych wyzej publikacjach zawiera kilka nie znanych dotychczas czynników, oznaczonych tu symbolami Bi, B,, B* Cia i Cs.Dodatkowy czynnik, oznaczony symbolem Ei, mozna takze wyosobnic z kompleksu antybiotyku A-4096 i moze on stanowic produkt rozkladu. Chemiczne, fizyczne i biologiczne wlasciwosci tych czynnników wskazuja na to, ze sa one nowymi antybiotykami i byc moze za wyjartfeiteon czynnika Ei, skladaja sie z takiego samego rdzenia peptydowego (aglikonu), aminocukru i zmiennych ilosci glikozy, mannozy i ramnozy. Aczkolwiek czynnik Ei. jest pod wie¬ loma wzgledami podobny do innych czynników, to jednak mozliwe jest, ze ma rdzen peptydowy.Bioautografia wytwarzania aglikonu podczas hy¬ drolizy zarówno kompleksu A^4096 jak i poszcze¬ gólnych czynników wykazuje, ze w ciagu krótkiego czasu otrzymuje sie zwykla mieszanine pseudo- aglikonu i aglikonu dzialajaca przeciw drobno¬ ustrojom. Mozliwe, ze zródlo tej aktywnosci kom¬ pleksu A-4096 i poszczególnych jego czynników znajduje sie w peptydowym pseudoaglikonie, a za¬ sadnicza róznica pomiedzy tymi czynnikami spro¬ wadza sie do róznicy w ich obojetnym skladniku cukrowym. Przylaczone cukry moga dzialac glów* nie powodujac zmiane rozpuszczalnosci i wplywac na inne parametry, nie majace znaczenia farmako¬ logicznego. Sposób, w jaki te antybiotyczne czyn¬ niki funkcjonuja lub sa zbudowane, nie stanowi jednak przedmiotu wynalazku i nie ogranicza go. 8 Jak wspomniano wyzej, antyibiotyczne czynniki zgodnie z wynalazkiem wyodrebnia sie z antybio¬ tyku A-4096, wytwarzanego na drodze hodowli mi- kroorganizmju Actinoplanes miissouriensls przez wglebna fermentacje aerobowa w wodnej pozyw- 10 ce. Najpierw odidziela sie wytworzony kompleks antybiotyku A-4606 od brzeczki fermentacyjnej, po czym poszczególne czynniki wyodrebnia sie meto¬ da chromatografii cieczowa]. Wydzielone czynniki atybiotyczne korzystnie przeiprowadza sie w chflo- 15 rowodoiki lub siarczany.Stosowane w opisie i w zastrzezeniach okresle¬ nie „antybiotyk A-4IO9I0" oznacza kompleks akta- planinowanego antybiotyku podczas gdy rózne czynniki wyosobnione z tego kompleksu nazywa 20 sie tu czynnikami A, Bl, B* B* Cu, C* Ek itd. antybiotyku A-4606. Antybiotyk A-4096 i poszcze¬ gólne, wyosobnione z niego czynniki sa wysoce skuteczne w hamowaniu rozwoju mdkroorganizmóW chorobotwórczych u ludzi i zwierzat, a .poza tym * czynniki te stosuje sie jako srodki przyspieszajace wzrost kurczat, trzody chlewnej, owiec i bydla.(Nowe, antybiotyczne czynniki Bi, B,, B», Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4096 sa zwiazkami zasadowymi i moga tworzyc z odpowiednimi kwasami sole. Po- 30 dane ponizej cechy charakterystyczne tych czyn¬ ników odnosza sie do soli tych czynników z kwa¬ sem solnym, ale oczywiscie mozna tez znanymi sposobami wytwarzac i inne sole farmakologicznie dopuszczalnej 98 Badania prowadzone metoda chromatograftocien¬ kowarstwowej (TDC) na zelu krzemionkowym, me¬ toda cieczowej chromatografii cisnieniowej (HPLC) wykazuja, ze przy wyosobnianiu antybiotyku A- -40W otrzymuje sie mieszanine kilku skladników, 40 wykazujacych dzialanie antybiotyczne. Z antybio¬ tyku A-4696 mozna odkfeieMc preparatywnie meto¬ da chromatograf iii na kolumnie poliamidowej czyn¬ niki oznaczone symbolami A, Bi, B* Bj, Cu, Cs i Ei. Otrzymane frakcje bada sie oznaczajac ich * aktywnosc w swietle nadfioletowym i metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej, po czym frakcje chromatograficznie identyczne, zawierajace czynni¬ ki A, Bi, Bs, Bs, Ci., Ca lub Ei laczy sie odpowied¬ nio i suszy przez wymrazanie. Wytworzone pro- 5* dukty identyfikujace sie i oznacza ich czystosc me¬ toda cieczowej chromatografii cisnieniowej.Czynnik A antybiotyku A-4BI0» wyosobniano juz wczesniej i jest on ujawniony w opisie patento¬ wym Stanów Zj. Ameryki nr 411$ 5512 i dane do- 55 tyczace tego czynnika zamieszcza sie ponizej w opi¬ sie jedynie w celu ulatwienia opisania procesu od¬ dzielania nowych czynników antybiotyku A-48&6 i scharakteryzowania ich.Badanie antybiotyku A-4606 metoda chromato-, w grafii cienkowarstwowej z zastosowaniem nalozo¬ nej biowarstwy i z uzycielm metanolu, chlorofor- mu, stezonego wodorotlenku amonowego, H-r||d.- butanolu i wody jako rozpusczakiica oraz Ba^JhW subtilis jako organizmu wykrywajacego, daje M- * stepujace wyniki.134 W 5 Czynnik A-4G96 A Bi *» B3 Cia Wartosc Rf M5 0,35 0^5 (0,40 0,5)1 Tablica 1 Stosunki molowe obojetnych cukrów Badanie antybiotyku A-46&6 metoda cieczowej chromatografii cisnieniowej w temperaturze poko¬ jowej i jprzy uzyciu 2P/t roztworu wodnego kwasu octowego z cyjankiem metylu w stosunku 90:10 oraz w stosunku 70$0 daje nastepujace wyniki.Czynnik A-4096 A , Bi B, B, Cu c, | Ei Wartosc K' 1,00 1,99 8,84 0jl50 2,9(2 4,23 0J3I& 10 15 20 Stosujac metode TDC ii HFLC mozna z antybio¬ tyku A^4Q9B oddzielic takze mniejsze ilosci i in¬ nych czynników, oznaczonych symbolami Cib, C^a, Cib i D, pod wieloma wzgledami podobnych do czynników A, Bi, Ba, B8, Cu, Ca i Ei tego antybio¬ tyku. Oprócz tego, w kompleksie antybiotyku A- -4696 moga byc jeszcze inne czynniki, dotychczas nie odkryte. Czynniki Cib, Cja, C« i D nie zostaly wyosobnione i oczyszczone w ilosciach umozliwia¬ jacych dokonanie ich charakterystyki.Gdy antylbiotyk A-4l6l9i6 lulb jego poszczególne czynniki -poddaje sie hydrolizie w lagodnie kwa¬ snych warunkach (S|V» roztwór HCl w metanolu, temperatura wrzenia pod chlodnica zwrotna, okres trwania reakcji 70 minut), wówczas wytwarza sie pseudo-aglikon. Wytraca sie on z mieszaniny reak¬ cyjnej i w przypadku hydrolizy czynników A, Bi, B2, B3, Cia i C3 antybiotyku A-4696 ma budowe. o wzorze podanym na rysunku. W przypadku czynnika Ei antybiotyku A^4G96 jest mozliwe, choc nie stwierdzono tego z pewnoscia, ze wytworzony piseuido-aglikon ma nieco inna budowe.Badanie metoda bifbulowa i metowa chromato- graifii denkowarstwowejj przesaczy po hydrolizie komipleksu antybiotyku Ah46|96 i poszczególnych czynników tego antylbiotyku wykazuje, ze oprócz rdzenia z pseudo-aglikonu kompleks ten i czynni¬ ki zawieraja rózne ilosci obojetnych cukrów. Ro¬ dzaj tych cukrów i ich wzajemne stosunki molowe podano w taJblicy 1. Wyniki podane w tej tablicy odnosza sie do pochodnych trójmetylosililowych cukrów oznaczonych metoda chromatografii gazo¬ wej. Dla kazdego cukru podano suimje izomerów a i 0.Poszczególne czynniki anltybilotyku A-4J&96 róznia sie glównie ich skladnikami w postaci obojetnego cukru, przylaczonymi do pseudo-aglikonu w nie¬ znanych pozycjach. 30 35 40 45 50 55 Czynnik antybiotyku | A-4^96 A Bi Bx Bz \ Qa Mannoza ai80 2,05 1£0 2,tt AjlB Glikoza 1,0 *,o 1,0 a,o 1,0 Ramnoza ^ 1,01 H \ «—1 1 1,08 65 jCzynnik Bi antybiotyku A-4600 jako sól z kwa¬ sem solnym jest produktem krystalicznym o bar¬ wie bialej, rozpuszczalnym w wodzie* w rozpusz¬ czalnikach hydroksylowych i polarnych, a nieroz¬ puszczalnym w rozpuszczalnikach) takich jak eter, chloroform, benzen, aceton, weglowodory alifaty¬ czne., weglowodory chlorowane Irtp. W roztworach wodnych jest on trwaly przy wartosci pH od oko¬ lo 4 do okolo 9, w temperaturze do okolo 27^C..Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Bi anty¬ biotyku Ah4G9£ wykazuje sklad: ^lfilP/e C; 5,25P/i H; 4,88Vo N; 4fi2fh Cl i reszta tlen. Przyblizony ciezar czasteczkowy, okreslony teoretycznie przez polaczenie ciezarów czasteczkowych pseudo-agliko¬ nu i znanych, przylaczonych cukrów, wynosi 1954.Widmo absorpcyjne w nadfiolecie w wodzie wyka¬ zuje maksimum przy 280 om (EJvJm^*Bi3)- Widmo absorpcyjne tego zwiazku w KBr w podczerwieni przedstawiono na fig. 1 rysunku. Zaobserwowane, dajace sie odrózniac maksima absorpcji przy licz¬ bie falowej 400Q—700 cm-1 sa nastepujace: 3860 szerokie, 2980, 1731, 109% 1054., 1637, 1015, 1588, 1577, 1.501, 1500, 1488, 14120, 1301, 12819, 1229, 1210, 11718, 1)1154, 1121, 1076, 1000, 1000, 1012, 9182, 880, 840, 831 i 8110 cm-i.Czynnik B, antylbiotyku A-4606 w postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o bar¬ wie bialej, rozpuszczalnym, w wodzie, rozpuszczal¬ nikach hydroksylowych i polarnych, a nierozpusz¬ czalnym w rozpuszczalnikach takich jak eter, chlo¬ roform, benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, chlorowane weglowodory itp. W wodnym roztwo¬ rze jest on trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9, w temperaturze do okolo 27,0C. iMikroanaliza chlorowodorku czynnika B, anty¬ biotyku A-4H9I6 wykazuje sklad: 51,96^/t C; 4,67*/e H; S^/f N; 5^8i8P/# CL,, a reszte stanowi tlen. Przy¬ blizony ciezar czajsteczkowy, okreslony teoretycznie przez polaczenie ciezarów czasteczkowych pseudo- -aglikonu i znanych, przylaczonych cukrów, wyno¬ si 1808. Widmo aJbsorpcyjne w nadfiolecie w wo¬ dzie wykazuje maksimum przy 280 nm (E1*/* = = 44,7). Widmo absorpcyjne tego zwiazku w KBr w podczerwieni przedstawiono na fig. 2 rysunku.Zaobserwowane, dajace sie odrózniac maksimum albsorpcji przy liczibie falowej 4000—700 cm-1 sa nastejpujace: 3400 szerokie, 2984, 1730, 1658, 1014, 1588, 15418, 1504, 14913, 1400, 14B6* L290, 1231, 1B10, 1170, iaai, 10B1, ioai, 1017,9187,303, S841 aie cm-i.Czynnik Ba antybiotyku A-4606 w postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnikach134 i«7 hydroksylowych i polarnych, a nieropusoczalnym w rozpuszczalnikach takich jak eter, chloroform, benzen., aceton, weglowodory alifatyczne, weglowo¬ dory chlorowane itp. W roztworze wodnym jest on trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9 w temperaturze do okolo 2I7°C.Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Bs anty¬ biotyku A-4696 wykazuje sklad: mjMf/o C; 4,74P/o H; 5j8&h N; 5$n*h Cl, a reszte stanowi tlen. Przy¬ blizony ciezar czasteczkowy, okreslony teoretycz¬ nie przez polaczenie ciezarów czasteczkowych pseu- do-aglikonu i przylaczonych znanych cukrów, wy¬ nosi 1808. Widmo absorpcyjne w nadfiolecie w wodzie wykazuje maitósdimum przy 280 nm (EJ1^ .= = 46,3). Wkhno absorpcyjne tego zwiazku w KBr w podczerwieni pa^edstawiono na fig., 3 rysunku.Zaobserwowane, dajace sie odrózniac maksima absorpcji przy liczbie falowej 41000—700 cm-1 i 3394 szerokie, 2608, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, lfll'4, 1150)1, 1515, 1504, 14180, 1407, 11350, 12911, 1228, lft09 1180, 1120, 1072, 105(1, 1010, 966, 908, 8(82, 84)6 : 816 cm-1.Czyirmik Cia antybiotyku A-46&6 w postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, w rozpuszczalni¬ kach hydroksylowych i polarnych, a nierozpusz¬ czalnych w takich rozpuszczalnikach jak eter, chlo¬ roform, benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, weglowodory chlorowane itp. W wodnych roztwo¬ rach jest trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9 w temperaturze do okolo ET^.Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Cu anty¬ biotyku A-46196 wykazuje sklad: WjO&k C; 4,74% H; 598t3P/» N; 5$&h Cl i reszte stanowi tlen. Przy¬ blizony ciezar czasteczkowy tego zwiazku, obliczo¬ ny teoretycznie przez polaczenie ciezarów czastecz¬ kowych pseudo-aglikonu i przylaczonych znanych cukrów, wynosi 1702. Widmo absorpcyjne w nad¬ fiolecie w wodzie wykazuije maksimum przy 2T79 nm (Ej1^ =4(7,9). Widmo aibsorpcyjne tego zwiaz¬ ku w KBr w podczerwieni przedstawione na fig. 4 rysunku, wykazuje nastepujace dajace sie odróz¬ niac maksima absorpcji przy liczfbie falowej 4000^- 700 cm-1: 3380 szerokie, 29011, /17BI4, 1650, 1616, 1591, 11506, 14fltt, ,1427, 15619, 12190, U238, 121113, 1177, 1123, 1072, 1061, 10312, 10117, 087, 000, 860, dlfc i 715 cm-*.Czynnik C* antybiotyku A-46196 w (postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnikach hydroksylowych i polarnych, a nierozpuszczalnym w takich rozpuszczalnikach jak eter, chloroform, benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, weglowo¬ dory chlorowcowane itp. W wodnych roztworach jest trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9 w liemperaturze do okolo a7?C.Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Cs anty¬ biotyku A-4&96 wykazuje sklad: i5tl,73P/* C; 4^/o H; &#lk N; 6,0GP/« Cl, a reszte stanowi tlen. Wid¬ mo absorpcyjne tego zwiazku w nadfiolecie w wo¬ dzie wykazuje maksimum przy 080 nm (£}*/• = 1 cm 47,9). Widmo aibsorpcyjne w KBr w podczerwieni, przedstawione na lig. 15 rysunku, wykazuije dajace sie odrózniac maksima aibsorpcji przy liczbie falo¬ wej 4000—7(00 cm-1 jak nastepuje: 3BT7I8 szerokie, 9985, 1738, 168®, 1658, 16B7, 1016, 1-589, 1*57I3 1&46, 1536, ,1820, 1528, ill503, 148)9, 14l74, 145T7-,' 14126, 1421, 1897, 1387, 12186, 12311, 1206, lill21, 1075, 106B, 10(218, 1012, 987, 905, 94l9, 87B, 840, 816, 769 i 708 cm"1. 5 Czynnik Ei antybiotyku A-4696 w .postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiajzkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnikach hydroksylowych i polarnych, a nierozpuszczalnym w rozpuszczalnikach takich jak eter, chloroform, *• benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, weglowo¬ dory chlorowane itp. W roztworach wodnych jest x trwaly przy wartosciach pH od Okolo 4 do okolo 9, w temperaturze do okolo 37*/©. iMikroanaliiza chlorowodorku czynnika Ei anty- i» biotyfcu A-4696 wykazuije sklad: 50,m% C; 4,7flP/o H; 9,0lV» N;l,8tf/t Cl, a reszta stanowi tlen. Wid¬ mo aibsorpcyjne tego zwiazku w nadfiolecie w wo¬ dzie wykazuje maksimum przy 2TCI9 nm (E^m ^ 39,9), a widmo aibsorpcyjne w KBr w podczerwieni, 10 przedstawione na ffe. 6 rysunku, wykazuije dajace sie odrózniac maksima absorpcji przy liczbie falo¬ wej 4O0Oh-7{H) cm-1 jak nastejpuje: 38194 szerokie, 29013, 1667, 1606, UBUO, 15019, ,H5BI8i, 1511, 1505, 14158, 14214, 1393, 1309, 13128, 1320, 1391, 4232, nm, 1178, 25 11420, 1075, 1001, 10311, 1018, 986, 917)3/904, &!8, 847, 813, 770., 75|2, 7818 i 714 cmr-i.Stwierdzono, ze antybiotyczna aktywnosc czyn¬ ników Bi, Ba, B* Cia, G3 i Ei antybiotyku A-4J8i96 w postaci chlorowodorków jest zasadniczo taka * sama, jak aktywnosc antybiotyku A-4686 (cjpis pa¬ tentowy Stanów Zj. Ameryki nr 41T5 5612) przeciw Bacillus suibtilis.Farmakologicznie dopuszczalne sole czynników Bi, B* Bs, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4J096 mozna 35 wytwarzac znanymi, sposobami stosujac kwasy mi¬ neralne, takie jak kwas solny, ibromowodory, kwa¬ sy sulfonowe, .kwasy fosforowe itp. Antyibiotycznie dzialajace sole takich kwasów wytwarza sie np. w ten sposób, ze roztwór antybiotyku w postaci 40 wolnej zasady zakwasza sie odjpowiedniim kwasem i wytraca sól przez dodanie acetonu. Sole takie mozna tez niekiedy wytwarzac droga wymiany jo¬ nów na kolumnie z wymieniaczem jonowym. Moz¬ na tez stosowac inne, znane sposoby wytwarzania 45 solij Nowe czynniki antybiotyku A-4696 hamuja roz¬ wój wielu mikroorganizmów chorobotwórczych dla ludzi, zwierzat i roslin. Stezenia chlorowodorków czynników Bi, B^, 'Bs, Cia, C3 i Ei antybiotyku 50 A-4606, (przy których zwiazki te hamuja rozwój niektórych mdkrooriganizmów, podano w taiblicach 2 i 3. Stezenia te okreslano metoda rozcienczania na agarze i wyrazono je jako najnizsze ©tezenie inhibitujace (MIC) w mifcrogramach na 1 ml (^ig/ w /ml).PonliizSEe dane wykazuja, ze chlorowodorki czyn¬ ników Bi, B2, B3, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4'696 sa skutecznymi^ srodkami przeciw bakteriom i drobnouistrojom, uzytecznymi przy zwalczaniu cho- w robotwórczych mikroorganizmów.Poza tym, czynniki te lulb ich addycyjne sole z kwaisaimi moga Ibyc wtprowadizane do pasty do zebów, zelu, proszku, cieklych preparatów do plu¬ kania ust oraz innych srodków higieny jamy ust- 65 nej, co umozliwia zapobieganie próchnicy i scho-134 197 !• Tablica Najnizsze stezenie itoniibitujac* Badany miikroorgandzim (baikteria) Stapihylococcus epd Hitchen®1 Staphylococcuis epi Bultt.Saiplhylococcuis eipdi Bennet Stajphyilococcus aureus 41203 Stapnylococcus aureias ^05*6 Stapliylococculs aureus 811312 Stapnylococous aureuis H12J5 Staphylococcuis aureuis 310(4 Stapihylococcus aureuls 3123 Staiphylococcuis aureuis H5l36 Stjaiphylococculs aureuis 311311 Strelptococcu& Group D I2i8|2 Streptococcus Group D '2B0 Streptococcuis Grouip D S$i9lQI2 Streptococcus Grouip D 0901 Streptococcus Group D 99fl& Streptococcus Grouip D 99G53 Strerybococcuis Grou(p D Guze .Streptococcus Group D il2M5)3iF Streptococcus vixiidamis 919(402 | Streptococcuis viriidans OlOrttt 1 Sitreptococcuis pyogenes Q2K3 Streptococcuis pyogenes DS6I6B-7I2 Strepitococcus pyogenes DiSi664-7I2 Streptococcuis ipneumoniae Park 1 Streptococcuis pneunioniae Type 14 Staphylococculs aureus 3074 Streptococcus faecalis X66 Proteus morganii HR15 Salmonella tylphosa SA12 Klebsiella pneuimoniae KLnl4 Enterobacter aerogenes EB17 Serratia marcescens SE3 Eschericia coli EC14, Oitrobacter freudiii CFI17 Pseudomonas aaruiginosa Xi2l319 Bordatella bronhiseptica 16 Salmonella typhitmuiriiuim Pseudomonas solanacearuni X185 Erwinia amylovora Oandida troipicalis Al? Trichophyton menitacrophytes 217 Aspergillus flavus E Geratocystis ulmi 2 i czyinniiika w ng/ml B, TU 0^!5 10 119 4 16 4 8 a a »a 2 2 2 2 2 2 2 2 0,6 1 0,5 *;5 •0,5 H),5 0,5 312 1 iaa i28 l|28 1|28 ll28 ll28 1)28 ll28 1)28 1|28 :il2a 64 1128 U28 1|28 H28 ©2 a, 0,25 4 4 2 4 2 4 4 4 4 3 2 1 2 2 2 1 ' 13 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 18 »l 1I2(8 .lB& 103 12f8 (1'2I8 123 lfl8 1'28 m 128* l«2f8 128 1* r* 126 l;2fc B3 2 0,06 2 1 1 12 2 2 1 12 12 0,6 0j5 0y5 0,5 0,3 0y5 0,5 0,5 0,26 0£ 0,25 0,6 0,6 bfi 0J5 4 <0£ lfl» 198 1«28 r28 VZ8 iaa 138 1!28 128 VM 198 112(8 198 1"28 198 128 Cl* 2 0,13 I 1 1 3 1 2 2 2 a o£ 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5 0y5 0,5 0,5 | 0,5 1 0,5 0,5 0,6 0,5 0,5 8 2 128 138 128 128 128 ,m 128 12i8 I2l8 128 128 11218 12fl 128 128 1"28 1 Szczepionka w agarze MH 1 :500 2 Szczepionka w agarze MH li: 10, 5i% krew królicza. rzeniom okolozejbowym powodowanym pirzez bak¬ terie. Mozna tez roztwór jednego luib kilku czyn¬ ników antybiotyku A^4G9I6 liuib ich soli addycyjnych z kwasaimi nakladac na powierzchnie dziasel i ze¬ bów za pomoca odlpowiedniego wacika. jJak wspomniano wyzej, czynniki Bi, B^, B3, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4)6(9^6 przyspieszaja wzrost i zwiekszaja stopien wykorzystywania pokarmu u drobiu, trzody chlewnej, owiec i bydla. Na przy¬ klad, dzienna dawka jednego lulb -kilku tych anty¬ biotyków w ilosci od okolo 0,6 mg do okolo 25 mg na 1 kg masy ciala przyspiesza wizrost i zwieksza wykorzystanie pokarmu u diroibkii i trzody chlew- 55 nej w porównaniu z odipowiednimi olbjawaimti u zwierzat, którym podaje sie tylko podstawowa pa¬ sze, ibez skladnika czynneego. Okreslenie „pasza podstawowa" oznacza tu calkowita pasze podawana zwierzetom i skladajaca sie z roznych skladników 60 pokarmowych, koncentratów, dodatków, substancji mineralnych, przedrndeszek witaminowych i leczni¬ czych, .skladników niestrawnych i innych, koniecz¬ nych w zywieniu zwierzat. Typowe pasze dla dro¬ biu i trzody chlewnej omówiono w opisie patento- 35 wym Stanów Zj. Ameryki nr 4116 5612.134197 li Tablica 3.Najnizsze stezenie inhibiltujajce w |igrtml 12 c.d. taiblicy 3 Badany mikroorganizm (bakteria) * Staphylococcus aureus XLI Staphylococcus aureufi V41 Staphylococcus aureus X4O0 Staphylococcus aureus S13E Stapihylococcuis epklermidis 1 Staphylococcus ep&dermftdis 2 Streptococcus Grouip A C206 Streptococcus Grouip D X68 Streptococcus Group D 9960 Streptococcus i pneuimoniae park Haemophilus infiluenzae sens. CL.Haemophilus influenzae ros. 76 Shigella sonnet N9 E. coli N10 E. coli E014 E. coli TEM Klebeiella X26 Klebsiella KAE Enterobacter aerogenes X6» Enterobacter aerogenes C32 Enterobacter aerogenes EB17 Enterobacter cloacae EB5 Enterobacter cloacae 265A Salmonella typhosa X514 Salmonella typhosa i 1335 Pseudomonas aeruginosa X528 Pseudomonas aeruginosa X239 Pseudomonas aeruginosa Psi® Serratia marcescens X99 Serratia marcescens ¦ SE3 Proteus morganii PR15 Proteuls inconstans PR33 O, 2 , 2 1 2 2 2 1 0,5 1 2 0,5 32 64 i 126 ' 128 128 128 128 128 ll28 128 li28 1&8 128 1I28 1!28 1 lt28 128 128 128 128 U28 128 li 8 ' 16 16 16 16 32' 16 1 4 18 V 12I8 128 H28 128 :128 128 . ¦ !128 128 '128 128 I128 128 iL28 128 128 128 128 128 128 128 128 !128 10 15 35 45 1 a Proteus relftgeri PIR7 Proteus rettgeri X24 Ciifcrobadter freuindii CP17 Bordetella [fronchiseptica 1)6 Cloistridiium defficile 2994 CHostridium perMngens 31( Clostridium seloticuim im Eulbacterium aerofaciens 1235 Peptococcus asaceharolytteuis 1302 Peptococcus prevoti 1120(1 Peptosireptoicoccus anaerobius 14128 Pepltoslreptococcus iintermedius 12641 | Propdoniibaicrteriium acnes 7(9 Bacteroides fnagilis ni Bacteroides fnagilis 187^7 Bacteroides fnagilis 193GB Bacteroides i^etaiotaomocron 141318 Bacteroides melaninogenicus 1856/28 Bacteroides melaminogenicus mse Bacteroides vulgatis 1211 Bacteroides corrodens 11874 Fusobacteriuim symlbnosum 114170 Pusobacteriuim | necrophorum W)54A 2 128 iaa 1128 l!28 1 1 i-i 1 «. 126 !128 2 1 128 128 64 64 K28 128 128 1128 32 128 3 1 128 128 128. 128 1 1. 1 1 1 "¦ 126 »128 • 4 .1 128 ll28 ' ' 128 128 i»128 128 il28 I128 128 tt28 Zgodnie z wynalazkiem, w celu polepszenia wy¬ korzystania pokarmu i przyspieszenia wzrostu, czynniki Bi, B^ Bs, Cia, C3 lub Ei antybiotyku A~4896 afllbo idh pochodne lub mdleszaininy podaje sie doustnie wraz z odpowiednimi pokarmem w ilosci okolo 2—1200 g na 1 tone calkowitego po¬ karmu. Czynniki antybiotyku A-4G96 wytwarzane sposobem wedlug wynalazku korzystnie jest doda¬ wac do paszy dla zwierzat w postaci odpowiedniej przedmiesaki {patrz nip. opds patentowy Stanów Zj.Ameryki nr 41H55I5)2), zawierajacej w 1 kg okolo li—filOO g tych czynników, ich pochodnych lutb mie¬ szanin. Przedmieszke taka wprowadza tfie do go-134197 19 14 towej dawM paszy. Mozna tez mieszac te aktywne czynniki z koncentratem paszowym lu!b innymi dodatkami i nastepnie dodawac do paszy.Wprawdzie nowe czynniki Bi, B* B», Ga, Cs i Ei antybiotyku A-4606 maja wieloraka przydatnosc, ale szczególnie uzyteczne sa jako antybiotyki, co ma istotne znaczenie z uwagi na duze znaczenie zwalczania mikroorganizmów chorobotwórczych.Jak wspomniano wyzej, nowe czynniki antybio- tyczne wyosobnia sie zgodnie z wynalazkieta z an¬ tybiotyku A-4606, wytworzonego przez hodowle pewnych szczepów Actimaplanes w warunkach ae- robowych w odpowiedniej pozywce az dó chwili, gdy uzyska sie w srodowisku hodowlanym znaczna aktywnosc antyibiotyczna. Czynniki te wyosobnia sie i oczyszcza róznymi, odpowiednimi sposobami.Mikroorganizm stosowany do wytwarzania anty¬ biotyku A-4096 stanowi szczep Atotinoplanes mis- souriensis z rodziny Actinoplanaceae, nalezacej do rzedu Actindrnycetales, opisanego przez dr John N. CouCh, Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 66, 2h&— m (1W») i 66, 87M92 (196); Trans New York Acad. Sci., 16, &15M318 (1054); Jour. Elteha Mitchell Sci. Soc., 71, 1W8M155 i 260 aflBW; Bergeyfc Manual of Determinative Bacteriology, wydanie 7, 805MBIB9 (1957) i Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, B&—70 (108B).(Biologicznie czyste hodowle szczepów Actinopla- nes misBouriensas uzyteczne przy wytwarzaniu: an- tyibiotyku A-4606, z którego nastepnie wyosobnia sie czynniki Bi, B* Ba, Cia, Cj i Ei zdeponowano w American Type Culture Collection, RockvHIe, Maryland pod numerami ATOC 510810, ATOC 31682 i ATOC 316&&. Szczep ATOC 31692) jest uzyteczny do wytwarzania antybiotyku A-4806 w celu wy¬ osobnienia zen nastepnie czynników Bi i Ci. anty¬ biotyku A-4096, szczejp ATOC 316B0 sluzy do Wyo¬ sobniania czynników C« 1 B* antybiotyku A-*4!69ti, a szczep ATOC #1688 do wyosobniania czynników Br i Ei antybiotyku A-4606L Charakterystyke fizyczna i hodowlana szczepów ATCC 31660, ATOC 31G8B i ATOC 311688 ACtino- planes missouriensis podano ponizej. Szczejpy te otrzymano w wyniku szeregu mutacji z ATCC 2tfM2, znanego z oiplsu patentowego Stanów Zijedn.Ameryki nr 4110 9512. Szczepy te wytwarzaja po¬ dobna grzybnie i ich morfologia jest zasadniczo taka sama jak szczepy macierzystego. Nie zaobser¬ wowano grzybni powietrznej, grzybni wtórnej ani zarodni, a poza tym, przy stosowaniu techniki ta¬ kiej jak hodowla na ziarnach pylku kwiatowego równiez nie uzyskuje sie zarodni.Glówne róznice pomiedzy szczdpami stosowanymi zgodnie z wynalazkiem wystejpuja w cechach ho¬ dowlanych, zwlaszcza w pigimenltacji pierwotneij i grzybni. Szczep ATOC 31680 ma grzybnie zabar¬ wiona pomaranczowo — od barwy umiarkowanie lub hrazowo^pomaranczowej do barwy silnie po¬ maranczowej, zaleznie od srodowiska. Szczepy ATOC 3161812 i ATOC 31088' nie maja tak wyraz¬ nego zabarwienia i ich grzybnie maja barwe zólta- woszara.W 'taksonomicznych badaniach tych szczeipów stosowano znane metody, zwlaszcza zalecane przez International Streptomyces Project (ISP), opisane przez Shirlkiga i Gottlieba, 1066, Intern. J< of Syistematic Bacterioll. 16 (8), str. SIO—MO. Badania enzymowe prowadzone metoda Blazevica i Edere- ra, 19T75, Prittciples of Biochemical Tests in Dia- 5 gnositic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, a nazwy barw, skróty i niuimery za¬ czerpnieto z metody TSOC-JNBS Ke^y and Judd, 197*6, The ISOC-iNBS Centroid Oolor Charts Stan¬ dard Sample No. 2106, U.S. Dept. of Commerce, 10 National Bureau of Standards, Washington D.C.Odpornosc na dzialanie Iizozymiu i rozklad kazei¬ ny, eskuliny, hypoksantyny, tyrozyny i ksantyny mierzono metoda Berg, 10M3, Appl. Microbiol. 25, str. 66®—€U. Badano równiez wykorzystywanie we- 15 gla i wyniki badan oznaczono nastepujaco: +'+ oznacza wykorzystanie równe lub lepsze od wykorzystania gMkozy, to jest wykorzystanie pozytywne, + oznacza wykorzystanie slabsze od wykorzysta- n nia glikozy, ale widoczne, to jest wykorzy¬ stanie pozytywne, /+/ oznacza wzrost,, to jest wykorzystanie watpli¬ we. <— oznacza brak wzrostu, to Jest brak wykorzy- 25 stania.Ponizej w tablicach 4, 5 i 6 podano taksonome- tryczny opis, w tym równiez cechy hodowlane i fizjologiczne szczefcrów Actinoplanes stosowanychw procesie prowadzonym zgodnie z wynalazkiem. 30 Tablica 4 Ogólne cechy hodowlane i fizjologiczne szczepu Actinolplanes ATOC 3116810 (stosowanego przy wy¬ twarzaniu czynników Bj i C») j Rodzaj badania | .1 1 Cechy hodowli na pozywce Pozywka ISP nr 2 Pozywka ISP nr 3 Pozywka ESP nr 4 Pozywka ISP nr 5 Pozywka ISP nr 7 Wlasciwosci lufo wynik próby 1 a 1 Wzrost obfity, rewers I ?6.1.yBr; brak grzybni powie¬ trznej, brak barwnika rozpuszczalnego Wzrost dobry, rewers #3.y Gray, brak grzybni powie¬ trznej i rozpuszczalne¬ go barwnika Wzrost dobry, "rewers 9&nuO., brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, polysk, grzybni powietrznej i rewers 5©js.Om brak rozpuszczalnego barw¬ nika Wrost dobry, rewers 54.br.O., brak grzybni powietrznej,'barwnik rozpuszczalny jasno- brazowymm 15 16 cd. tablicy 4 cj& tablicy 4 [ 1 1 Agar Benettfa 1 Jablczan wapniowy 1 Agar Czapek^ 1 Glikoza — asparagina 1 [Pasta pomidorowa i maka owsiana 1 Agar Anio-Hensen^a Pozywka 5I3H Pepton Czapek'a | Rozklad kazeiny 1 Reakcja katalazy Rozklad eskuliny 1 Uplynnianie zelatyny 1 Wytwarzanie HjS w 1 pozywce ISP nr 6 1 Rozklad hypofcsantyny 1 1 Odpornosc na dziala- I nie liizozymu 1 Pigmenty melanoidowe pozywce ISP nr 1 j 1 pozywce ISP nr 6 1 1 pozywce ISP nr 7 1 1 pozywce ISP nr 7 I bez tyrozyny Tolerancja NaCl na 1 | ISP nr 2 | 1 Redukcja azotanu 1 I Wartosc pH przy wzro¬ scie na pozywce ISP nr 2 1 Wytwarzanie fosfa- 1 tazy | 1 2 1 Wzrost obfity, rewers S&jmjO., ibrak grzybni (powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, polysk, 1 rewers 50j&X)., 'brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego | barwnika | Wzrost dobry, rewers SOj&jO., brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, rewers 5Bjm.Q., brak grzybni ipowietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost obfity, rewers 1 i93.rn.iO., brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost ubogi, rewers | 9&.y. Gray, brak grzyb- 1 ni i rozpuszczalnego barwnika Wzrost uibogi, rewers 91jdJgyY, ibrak grzybni ipowietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika | Wzrost obfiity, rewers 54jbr.O., brak girzylbni, powietrznej i rozpu~ szczalnego pilgimentu Pozytywny j Pozytywny Pozytywny Negatywny | Siady 1 Negatywny | Negatywny [ Negatywny 1 Negatywny Negatywny 1 Negatywny 1 SPh Negatywny 6-6,4 Pozytywny 1 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 a Reakcja z mlekiem zbieranym Hydroliza skrobi na 1 ISP nr 4 Tolerancja sacharozy na ISP nr 2 Temperatura wzrostu | na ISP nr i2 1 Rozklad tyrozyny 1 Wytwarzanie ureazy I Wrazliwosc na anty¬ biotyki: Gefalotyna sodowa 30 |*g Erytromycyna (esto- lan) 115 (Ag | Ghlaromycetyna 30 [tg Nowobiocyna 90 |ig Penicylina G 1(0 | jednostek Ryfatmpina 5 lig | Streptomycyna 10 \vg | Tetracyklina 30 (ig 1 Vankomycyna HC1 1 30 |ig 1 Wytwarzanie ksantyny 1 Wykorzystanie wegla w pozywce ISP nr 9 * z dodatkiem: | bez wegla iglikozy 1 L-arabinozy 1 cellobiozy 1 D-fnufctozy 1 Dngalaktozy 1 i^inozytiu I 1 Dnmanniitu 1 1 melibiozy 1 1 rafinozy 1 1 D-ramnozy 1 Dnrybozy salicyny I sacharozy 1 D-ksylozy | | . Z 1 Negatywny 1 Negatywny 1 0OVo BM37°C 1 (Negatywny 1 1 Pozytywny 1 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy | Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy | Wrazliwy | Wrazliwy 1 Negatywny | — | + + +'+ | +'+ + + ++ — 1 + 1 ' + 1 + 1 + + /+/ + + 1 + 1 * Wyjalowione zródla wegla dodawano tak, aby uzyskac stezanie koncowe l,0P/«.ii j •¦-¦:¦;:'.:;: ,_'• Tablica 5 Ogólne''cechy hoBowIane f Ik^Tóglezrie szczepu Actiaoplanes. missouriensis ATCC 91682 (stosowa? nego przy wytwarzaniu czynników A, Bi, B2 i Cia) Rodzaj badania i * Gechy hodowli na pozywce Pozywka ISP nr 2 Pozywka TSPnr 3 1 Pozywka ESP nr 4 (Pozywka ISP nr 5 Pozywka ISP nr 7 1 Agar Benettfa 1 1 Jaiblczan wapniowy 1" Aigar Czapek^ Gljkpza-asparagina Pasta ponilidorowa — maka owsiana Agar Anio-Hensen^. 1— T Wlasciwosci i lu(b wynik próby 1 * ¦ ¦ j Wzrost dobry, rewers 1 9Q.gy.Y, brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, rewers 9B.y Gray, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwnika Wzrost idobry, rewers 7».ljgy.y.Br, .brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego barw¬ nika Wzrost dobry, polysk, rewers 0O.gy.Y, brak grzybni! powietrznej i rozpuszczalnego barw- | nika j Wzrost dosc dobry, rewers $0.gy.yBr, brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego .barw¬ nika Wzrost obfity, rewers I 9!3.y.Gray. brak grzyb¬ ni i rozpuszczalnego barwnika 1 Wzrost dobry, polysk 1 rewers 98.y Gray, brak | grzybni powietrznej i 1 rozpuszczalnego barw¬ nika Wzrost obfity, rewers 1 ®&.y Gray, brak grzyb¬ ni .powietrznej i roz- (puszczalnego barwni¬ ka | Wzrost dobry, rewers 1 9fry Gray, brak grzyb¬ ni .powietrzne! i rozpuszczalnego barw¬ nika Wzrost ohfljty, rewers 1 fltl-d^gy.Y, brak (grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwni¬ ka Wzrost dosc dobry, re- 1 wers 91xi.gy.Y, brak grzyfbni powietrznej;i rozpuszczalnego barw-J ndfca 10 15 40 45 50 00 ." '--'%-'''•• . 1 l Pozywka B3ffl \ 1 • I Pepton Czapek'a 1 Rozklad kazeiny 1 Reakcja katalazy 1 Rozklad eskuliny 1 Uplynnianie zelatyny 1 Wytwarzanie H2S w pozywce ISP nr 6 1 Rozklad hypoksantyny 1 -Odpornosc na dzialanie lizozymu 1 Fig&nenty melanoMo- 1 we na pozywce: 1 ISP nr 1 ISP nr 6 ISP nr 7 | ISP nr 7 bez tyrozyny ~~ 1 Tolerancja NaCl na ISP nr 2 1 Redukcja azotanu 1 Wartosc pH przy wzroscie na ISP nr 2 1 Wytwarzanie fosfatazy 1 Reakcja z inlekiem zbieranym I Hydroliza skrobi na ISP nr 4f 1 Tolerancja,,sacharozy , | na ISP nr 2 1 Temperatura pnzy wzroscie na ISP nr 2 J Rozklad tyrozyny 1 Wytwarzanie urea y 1 Wrazliwosc na anty- [ biótyfci: 1 Cefalotyna sodowa | 30 fig Frytromycyna (esito- | la) 16 yug 1 Chloromecetyina 3K yng I NoWoMocyna 30 [Ag 1 Penicylina G 10 jed¬ nostek Ryfanipina 5 |ig 1 cjd. tablicy 5 1 Q Wzrost dobry, rewers 91.&gy.Y, brak' grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwni¬ ka | Wzrost obfity, rewers 1 9G.gy.Y, brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Pozytywny 1 Pozytywny 1 Pozytywny 1 Pozytywny ClOOP/©) slady 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 [ */*.Negatywny | 6M8 Pozytywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 20Vt 10-n3f7°C Pozytywny 1 Pozytywny 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1134 IW m c.d. tablicy5 cd. tablicy 6 1 I 1 Streptomycyna 10 fig | Tetracyklina 30 jig 1 Vankotnycyna HO 30|*G 1 Wytwarzanie ktoan/tyny 1 Wykorzystanie wegla ¦ | z dodatkiem: | bez wegla 1 glikozy 1 L-arabinozy 1 cellobiozy 1 D-firuktozy D-galaktozy 1 i-inozytu 1 D-mannitu 1 •melibiozy 1 raftnozy 1 D-ramnozy D-rybozy ¦salicynyi sacharozy D-ksylozy » Wrazliwy Wrazliwy Wrazliwy 1 Negatywny — + +, + +¦ + + + + + +. — | + + + + 1 .+. 1 + 1 + 1 + 1 + + 1 * Wyjalowione zródlo wegla dodawac tak, aby wy*ac koncowe stezenie l,0P/n.JTablica 6 Ogólne cechy hodowlane i fizjologiczne szczepu Actinoplanes irisaouriensis ATOC 31660 (stosowa¬ nego przy wytwarzaniu czynników A, Bi, Bs i B3) Rodzaj badania 1 1 1 Cechy hodowli na pozywce: ISP nr 2 ISP nr 3 ISP «r 4 LSP nr 5 | Wlasciwosci lufo wynik próiby * Wzrost dobry, rewers 1 9 ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barw¬ nika Wzrost dobry, rewers 1 90.y Gray, (brak grzyba ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwn- 1 nika | Wzrost dobry, rewers 79J.gy.yBr., brak grzybni powietrznej i putezczalnego barw¬ nika Wzrost dosc dobry, rewers 90-gy.Y, brak | grzybni powietrznej i 1 rozpuszczalnego barw¬ nika [ 1 ^ l ISP nr 7 Agar Bennefa 1 Jablczan wapniowy Agar Czapek'a 1 Glikoza-susparagina 1 Pasta pomidorowa — 1 maka owsiana 1 Agar Anio-Henson'a 1 Pozywka 59H Pepton Czapek'a 1 Rozklad kazeiny 1 Reakcja katalazy | Rozklad eskuliny Uplynniania zelatyny 1 Wytwarzanie H£ na 1 ISP nr 6 Rozklad hypoksantyny 1 Odpornosc na dziala¬ nie lizozynu 1 Pigmenty mnelanoidowe 1 | -na pozywce: . | | ESP nr 1 't \ \ ISP nr 6 | [ ISP nr 7 | 1 K3P nr 7 bez tyrozyny | Tolerancja NaCl na ISP nr 2 | |" ¦ 2 " ' ' ¦ 1 Wzrost dosc dobry, rewers 80.gy.y.Br, brak grzybni powie¬ trznej 1 rozpuszczal- 1 nego barwnika [ Wzrost obfity, rewers 1 flB.y Gray, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barw- | nica | Wzrost dobry, polysk, rewers Oflcy Gray, brak grzybni powietrznej 4 1 rozpuszczalnego barw- | nika 1 Wzrost obfity, rewers fl3.y Gray, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwnika | Wzrost dobry, rewers flO.y Gray, brak grzybni powietrznej ii rozpu- | szczalnego barwnika | Wzrost dobry, rewers 1 AluLgy.Y, brak grfcyb- mi powietrznej i Roz¬ puszczalnego barwnika Wzrost dosc dobry, rewers 9T.d.gy.Y, 'brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego barw¬ nika „ | Wzrost dobry, rewers 1 flljd.gy.Y, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwnika Wzrost obfity, rewers 90.gy.Y, brak grzybni powietrznej i rozpu¬ szczalnego barwnika Pozytywny 1 Pozytywny | Pozytywny 1 Pozytywny (lOtP/t) 1 ^—1—"i< 11 —w r-m r—1 ~l slady 1 Negatywny Negatywny 1 Negatywny | Negatywny Negatywny | Negatywny 1 <20Vt . tara 10 15 !•Ll 184197 ] 1 | Redukcja azotanu Wartosc (pH przy | wzroscie ma USP nr 2 1 Wytwarzanie fosfatazy Reakcja z mlekiem zbieranym 1 Hydrolizm skrobi na | ESP nr 4 1 Tolerancja sacharozy na ISP nr 2 1 Temperatura przy wzroscie na ISP nr 2 1 Rozklad tyrozyny 1 Wytwarzanie ureazy 1 Wrazliwosc na antybiotyki: 1 Cefalotyna sodowa - 30 ng Erytromycyna (euto- | lan 16 fig i OMorómycetyna 30|ig Nowobiocyna d0 fig i Fenicylina G 10 jed- 1 nostek Rytfardpina 5 fig Streptomycyna 10 |ig Tetracyklina 30 jjg Vankomycyna HO 30 fig Wytwarzanie ksantyny I Wykorzystanie wegla oa pozywce ISP nr 9 * | z dodatkiem: | bez wegla | glflkpzy 1 Lr-arabinozy |~oell<3biozy ' 1 • jD-Hruktozy D-galaktozy i-inozyitu D-mannitu melibtozy 1 raffinozy D- 1 D-rybozy 1 salicyny 1 isacharozy (D-fcsyilozy cd. tablicy 6 1 2 Negatywny 6^-8,4 1 Pozytywny 1 Negatywny! . | Negatywny 20Vo a-40°C 1 Pozytywny 1 1 Negatywny 1 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy Wrazliwy Wrazliwy Wrazliwy WrazliWy Wrazliwy i Wrazliwy' Wrazliwy Negatywny — 1 +)+ | + + | + + ¦ •¦ | + + | + + | — | '+ + | + + | + | + | + ¦+¦ 1 + + | 10 15 30 40 45 *Wyjalowione zródla wegla dodawano tak, aby uzycfcac koncowe stezenia l,QP/§.Jak podano wyzej, zgodnie z wynalazkiem hoduje sie szczepy ATOC 3l«80, ATOC 3168(2 i ATOC 31)6188 AcUnoplanes.n^ an- 55 60 65 tyibiotyk A-4JGI96, z którego nastepnie wyosobnia sie nowe czynniki. Hodowle mozna prowadzic na jedp- nej liulb na kilku pozywkach, ale ze wzgledów ekonomicznych, w celu uzyskania maksymalnej wydajnosci oraz ze wzgledu na latwosc wyosobnia¬ nia antybiotyku stosowanie niektórych pozywek jest szczególnie korzystne. Tak np. skrobia jest korzystnym zródlem weglowodanów, a drozdze korzystnym zródlem azotu. Mozna tez stosowac jako zródla weglowodanów melase, glikoze, dek¬ stryne, gliceryne itp., a jako zródla azotu'równiez mieszaniny aminokwasów, peptony itp. jJak odzywcze sole nieorganiczne do pozywki do¬ daje sie znane sole bedace zródlem jonów sodo¬ wych, foranowych, chlorkowych siarczanowych itp. Poza tym mozna stosowac dodatki! wspomagajace wzrost, takie jak rozpuszczalne pozostalosci gorzelniane i wyciagi z drozdzy, co wplywa korzystnie na wy¬ twarzanie czynników antybiotyku A-4006. Tak jest w (przypadku hodowli innych mikroorganizmów, tak tez i pozywka do hodowli szczepów Actimopla- nes stosowanych wedlug wynalazku powinna za¬ wierac pierwiastki sladowe. Pierwiastki takie Wypro¬ wadza sie zwykle w postaci zanieczyszczen sklad¬ nikówpozywki:. - - Mikroorganizmy stosowane do wytwarzania an¬ tybiotyku A-4I6I9I6, z którego nastejpnie wyosobnia sie czynniki Bi, B2, B3, Ci«, C3 i Ei mozna hodo¬ wac w srodowisku o stosunkowo dulzym zakresie wartosci pH, ale korzystnie jest utrzymywac war¬ tosc pH okolo 6,5 do 7,0. Jak w przyfeaidku ho¬ dowli innych (mikroorganizmów Actanomycetes, tak i tu wartosc pH srodowiska zmienia sie stopniowo w okresie fermentacji i pod koniec tego okresu wynosi zwykle od okolo 6,5 do 7J5w Przy wytwarzaniu czynników antybiotyku1 A-4J6&B korzystnie jest stosowac wglebna fermentacje aero- bowa. Stosunkowo male ilosci tydh antybiotyków mozna wytwarzac droga hodowli wstrzajsowej w butlach, ale przy wytwarzaniu duzych ilosci ko¬ rzystniej jest prowadzic wgfflejbna fermentacje aero- bowa w wyjalowionych kadziach, w których po¬ zywke hodowlana zaszczepia sie zawiesina fragmen¬ tów grzybni.Wegetatywna szczepionke mikroorganizmu wy¬ twarza sie zaszczepiajac stosunkowo mala ilosc po¬ zywki fragmentami grzybni danego mikroorganiz¬ mu i otrzymana, mloda jeszcze szczepionke wege¬ tatywna przenosi sie aseptycznie do duzej kadzi Szczepionke wegetatywna mozna wytwarzac w ta¬ kiej samej pozywce jaka stosuije sie na duza ska¬ le do wytwarzania czynników antybiotyku A-4&96, ale mozna tez stosowac i inne pozywki..Szczepy ATOC 31d8l0, ATOC 3fll6fl|2 i ATCCjfUto Actinoplanes moBSpuriensis wytwarzajace czynniki antybiotyku A-4606 rozwijaja sie w temperaturze 20—Atf*C, a najwiejksze ilosci tych czynników sa wytwarzane w temperaturze okolo 3W°C. W toku hodowli wglebnej do srodowiska hodowlanego wdmuchuje isie wyjalowione powietrze w ilosci od okolo 0,1. do okolo 1,0 objetosci na 1 objetosc sro¬ dowiska w * ciagu1 1 minuty, a najkorzystniejszy wzrost mikrorganizmów i najwydatniejsze wytwa¬ rzanie antybiotyku uzyskuje sie wdmuchujac w23 134 19T 21 ciagu 1 minuty co najmniej 11/2. objetosci powie¬ trza na 1 objejtosc srodowiska hodowlanego.Predkosc wytwarzania czynników antybiotyku A-4S96 i nasilenie aktywnosci antybiótycznej sro¬ dowiska hodowlanego mozna sledzic badajac aktyw¬ nosc próbek pobieranych z brzeczki fermentacyjnej w stosunku do organizmów podatnych na dzialanie antybiotyków. Jednym z takich organizmów, który mozna stosowac do tego celu, jest Bacilluis su/btilis.Próbe te mozna prowadzic znanymi metodami ku- bek^fplytka lub metoda kraizka biibuly na plytkach agarowych. Przy prowadzeniu procesu fermentacji metoda wstrzasanych kolb, lulb metoda wglebnej hodowli aerobowej zwykle maksimum wytwarzania antybiotyku wystepuje w cdagu okolo 4—6 dni.Antybiotyk A^4696, z którego nastepnie wyosob¬ nia sie jego czynniki Bi, B2, B3, Cia, C3 i Ei, mozna oddzielac od srodowilska hodowlanego i innych sub¬ stancji ewentualnie obecnych metodami adsorpcji lub ekstrakcji, przy czyim korzystnie stosuje sie adsorpcje, gdyz wówczas unika sie duzych obje¬ tosci rozpuszczalników, niezbednych w procesach ekstrakcji.Poniewaz postepowanie w przypadku szczepu ATGC 316&0 (do wyosobniania czynników B2 i C3 antybiotyku A^4696), szczepu ATOC 3168B (do wy¬ osobniania czynników Bi i Cia antybiotyku A-4606) i szczepu ATOC 31683 (do wyosobniania czynników B3 i Ei antybiotyku A-4696) jest zasadniczo takie samej przeto w celu uproszczenia w przykladach zilustrowano tylko proces w odniesieniu do szczepu ATOC 316J8I2, ale w przykladzie I omówiono tez pewne róznice w postepowaniu w przypadku szcze¬ pu ATOC 3i603 i jego stosowaniu.Przyklad I.A. Fermentacja w kolbach wstrzasanych.'Fragmenty grzybni szczepu ATOC 3161812 Actino- planes missouriens% (lub szczepu ATOC 3(1680 alibo ATOC 31688) zaszczepia sie w pozywce ze skosu agarowego o podanym skladzie w Tablicy 7.. Tablica 7 Skladnik ] Cerelose 1 Dekstryna ziemnia¬ czana 1 Maka Nutrisoy* I Wyciag z drozdzy l CaCOs ..'...| Agar Zawartosc skladnika 0,5 2,0 1,5 0,25 0,1 - 2,0 ..* Maka Nutrisoy jest produktem firmy Archer Daniels Midland Company, 46166 Faries Parkway, Decatur, Illinois St. Zjedn. Am. Zaszczepiony skos poddaje sie hodowiM w temperaturze 30°C w ciagu 6. dni. Hodowla nie wytwarza zarodników totez nalezy macerowac plat grzyfbni wyjalowiona pipe¬ ta. Zmacerowana dojrzala kulture pokrywa sie warstwa wyjalowionej wody destylowanej i skro¬ bie ostrojznie pipeta lujb wyjalowiona paleczka w celu wytworzenia zawiesiny grzybni. Otrzymana zawiesine stosuje sie do zaszczepienia 100 ml wy¬ jalowionej pozywki wegetatywnej o skladzie po¬ danym w Tablicy 8v TabHca 9 (Skladnik Cerelose 1 Dekstryna ziemnia¬ czana 1 Maka Nutrisoy 1 Wyciag z drozdzy | CaCOs Zawartosc skladnika 0,5 2,0 | W 0,25 j w 1 Zaszczepione srodowisko wegetatywne poddaje sie w temperaturze 2Kf*C w ciagu 48 godzin ho¬ dowli* w obrotowej wstrzajsarce o 2150 obrotach/mi¬ nute, po czyim za pomoca 10 ml otrzymanego za¬ szczepionego srodowiska wegetatywnego zaszczepia sie 100 ml wyjalowionego srodowdska „uderzenio¬ wego" o skladzie podanym w Tablicy 9.Tablica 9 Skladnik Cerelose Drozdze Maka Nutrisoy Skrobia ziemniaczana CaC03 Srodek zapobiegajacy pienieniu sie brzeczki (Sag. 471) Zawartosc skladnika 0,5 | 0,215 | 1,6 2,0 J 0,1 0,05 1 Zaszczepione srodowisko „posrednie" poddaje sie hodowli w temperaturze dCPC w ciagu 24 godzin przy stalym wstrzasaniu w obrotowej wstrzasarce o 250 obrotach/minute, po czym za pomoca 0,4 ml' 40 otrzymanego srodowilska zaszczepia sie 100 ml por¬ cje srodowiska produkcyjnego o skladzie podanym w Tablicy 10, znajdujace sie w kolbach Erlenme- yera o pojemnosci 500 ml i wyjalowione w tem¬ peraturze 121% w ciagiu 30 minut. 45 Tablica 10 t 'Skladnik Cerelose Skrobia kukurydziana Sacharoza Melasa Drozdze Proflo (maka z nasion bawelny) CaC03 K2HP04 MgS04-7H20 Srodek zapobiegajacy pienieniu sie brzeczki (Sag 714) , Zawartosc skladnika 1,0 i3,5 ' 3,0 1,5 1,0 1,0 0,2 0,005 0,025 0,5 0,03124IW 26 (Proces fermentacji watrzajsowej prowadzi siev w ciagu 96 godzin w temjperaturze SOPC w obrotowej wistrzaisarce o CS50 otoróiachi/lminute. Wartosc pH srodowiska pod koniec procesu fermentacji wynosi okolo 8,0.Przy wytwarzaniu! czynników Ba i Ei antybiotyku A-4696 do przygotowania opisanego wyzej srodo¬ wiska „posredniego" stosuje sie szczep ATCC 310S3. Za pomoca 0,4 ml tego srodowiska „posred¬ niego" zaszczepia sie 100 ml porcje srodowiska pro¬ dukcyjnego o skladzie (podanym w tablicy 11, znaj¬ dujace sie w 500 ml kolibach Erlenimeyera i wyja* lowione w temperaturze 1121°C w ciagu 30 minut.T a b 1 i c a 11.Skladnik Cerelose. 1 Drozdze CaCOft K?HPC (NH4WSO4 Srodek zapobiegajacy pienieniu sie brzeczki (Sag 471 Zawartosc .skladnika 1,0 BA 0,05 j 0,0215 | 0,03 1 Proces fermentacji wstrzasowej prowadzi sie w ciagu 96 godzin w temperaturze 3<0ioC w obrotowej wistrzaisarce o 260 Obrotach/minute. Wartosc pH srodowiska pod koniec procesu fermentacji wy¬ nosi okolo 8,0.B. Fermentacja w kadzi o pojemnosci 40 litrów Przygotowanie szczepionki prowadzi sie przez wytwarzanie „posredniego" srodowiska jak opisano wyzej w ustepie A, 2i5 litrów opisanego wyzej sro¬ dowiska produkcyjnego wyjalawia sie pnjez auto- klawowanie w temiperaturze 121°C w ciagu 3)0 mi¬ nut, po czym wlewa do kadzi fermentacyjnej o pojemnosci 40 litrów i zaszczepia 100 ml srodo¬ wiska „posredniego" a nastepnie prowadzi fermen¬ tacje w temperaturze 30°C w ciagu 4 dni, wypro¬ wadzajac wyjalowione powietrze w ilosci 0.6 obje¬ tosci na 1 objetosc kultury w ciagu 1 minuty.Pod¬ czas fermentacji miesza sie stosujac mieszadlo wir¬ nikowe, w celu zapewnienia dobrego mieszania sie powietrza ze srodowiskiem. W miare postejpowania procesu hodowli wartosc pH srodowiska wzrasta stopniowo od okolo 6,5 do okolo 8,0, C. Wyosobnianie antybiotyku A-4696.Do 31800 litrów brzeczki fermentacyjnej przygo¬ towanej w slposób wyzej opisany dodaje sie 5i°/o wagowo-objetosciowych srodka ulatwiajacego fil¬ tracje (Celite 54I5) i przesacza. Osad miesza sie z 3600 litrami zdejonizowanej wody i wartosc pH otrzymanej zawiesiny doprowadza do 10.5 za po¬ moca wodnego roztworu wodorotlenku sodowego, po czym odsacza i przemywa osad woda. Przesacz i popluczyny laczy sie i zakwasza 20P/o (wagowo- -objetosciowo) roztworem wodnym kwasu siarko¬ wego do wartosci ,pH 4,5.Zakwaszony roztwór przesacza sie z dodatkiem l*/o srodka ulatwiajacego filtracje (Celite 545) i 10 15 20 35 40 45 50 55 60 65 klarowny roztwór przepuszcza przez kolumne (54X150 cm) zawierajaca 360 litrów zywicy Am- berlifte IR-1,'16 (postac Na+), przemywajac kolumne 1200 litrami zdejoniizowanej wody. Zywice ERmi'6 usuwa sie z kolumny i eluuje partiami przy war¬ tosci pH 10g5 wodnym roztworem Wodorotfenku sodowego (razem 1000 litrów). Eluat zobojetnia sie do wartosci pH 7 20M (wagowo-objetosciowo) roz¬ tworem wodnym kwasu siarkowego i plucze 3 por¬ cjami zdejonizowanej wody (razem 150 litrów). Po¬ pluczyny zobojetnia sie i laczy z zobojetnionym eluatem, po czym zateza i suszy przez wymrazanie, otrzymujac surowy kompleks antylbiotyku o bar¬ wie od brazowej do ciemnobrazowej.D. Usuwanie soli % surowego antybiotyku A-4696, •1,0 kg surowego kompleksu dodaje sie powoli, silnie mieszajac, do 1,5 litra zdejonizowanej wody i otrzymana zawiesine miesza w ciagu 20 minut, po czym zobojetnia do wartosci pH 7 za pomoca l(P/o roztworu wodnego wodorotlenku amonowego.Nie rozpuszczony kompleks antybiotyku A-4696 od¬ sacza sie przez odsysanie, przemywa woda demo¬ nizowana i suszy przez wymrazanie, otrzytmujac suchy, odsolony kompleks z wydajnoscia okolo 80M wydajnosci teoretycznej w oparciu o bioajc- tywnosc.E. Oczyszczalnie odaoionego antybiotyku A-4606, #00 g wysuszonego, odsolonego kompleksu mie¬ sza sie z 2 litrami zdejonizowanej wody i zakwar sza otrzymana zawiesine do wartosci pH 2,7 przez dodawanie 3n kwasu solnego, po czym odwirowuje w ciagu 40 minut przy 2S0O oibrotach/miniute. Od¬ ciek dekantuje sie i wprowadza na kolumne (iaX85 cm) zawierajaca © litrów odbarwiajacej zywicy (Doulite S761), a nastepnie eluuje suibstancje ak¬ tywna zdejonizowana woda przy predkosci prze¬ plywu 3*0 ml/minute, sledzac przebieg eluowania metoda chromatografia cienkowarstwowej. Odciek zawierajacy antybiotyk A-4696 odparowuje sie .pod cisnieniem 40 hPa w temperaturze 36PC do obje¬ tosci 3 litrów i suszy produkt przez wymrazanie, otrzymujac odbarwiony kompleks w postaci sta¬ lego produktu o barwie od bialej do brazowawej, z wydajnoscia okolo 7flVo wydajnosci teoretycznej w oparciu o bioaktywnosc.F. Wyosobnianie chlorowodorków czynników Bi, B2, B3, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4696* 10 g wysusizonego, odbarwionego kompleksu an¬ tybiotyku A-4I6I96 rozpuszcza sie w 100 ml zdejo¬ nizowanej wody, przesacza otrzymany roztwór i podaje go na chromatograficzna kolumne (5£\10Q cm) zawierajaca 2 litry poliamidu Machery and Nagel SC6. Koluanne eluuje sie zdejonizowana wo¬ da, zbierajac 20OM3OO frakcji po 25 mi. Proces eluowania sledzi sie metoda chromatografii cienko¬ warstwowej, laczy frakcje identyczne i wymraza.Niekiedy trzeba stosowac kolumne o podwójnej dlugosci, to jest 200 cm, laczac 2 pojedyncze ko¬ lumny z poliamidem. Powtarzajac proces chroma- tografowania uzyskuje sie produkt dodatkowo oczyszczony.W przypadku wyosobniania czynników Bi i Cia antybiotyku A-4KJ96 postepuje sie w sposób opisany wyzej w ustepach A-^F stosujac szczep ATCC 31082, zas przy wyosobnianiu czynników B2 i C3134197 27 28 tego antybiotyku stosuje sie odpowiednio szczep ATCC 31680, a przy wyosobnianiu czynników B3 i Ei stosuje sie szczep ATOC 31168®.IW celu wyosobnienia czynników Bi, B2, Bs, Cia i Ei antybiotyku A-4096 w postaci chlorowodor¬ ków przy uzyciu jednego ze szczepów Actinopla¬ nes missouriensiB postepuje sie w ten sposób, ze 200 mg odbarwionego kompleksu antybiotyku A-4096, otrzymanego przy uzyciu szczepu ATCC 31083 w sposób podany w ustepach AME przy¬ kladu I, rozpuszcza sie w okolo 2 ml destylowanej wody, przesacza otrzymany roztwór i chromato- graifuje na kolumnie, stosujac adsorbenty w od¬ wróconej fazie. Na przyklad, jako faze stacjonowa¬ na stosuje sde preparat Li Ghiroprep RP-I18 firmy E. Merck, Darmstadt, RFN, a jako faze ruchoma roztwór wodny acetonitrylu o stopniowo zmienia¬ nej zawartosci obu skladników i zawierajacy fos¬ foran trójetyloaminy.Stezenie wodnego roztworu acetoniitrylu zalezy od sposobu, w jaki prowadzono proces fermentacji, ale korzystnie stosuje sie gradient 10—4z0^/». Prze¬ bieg eluowania sledzi sie metoda okreslania ak¬ tywnosci frakcji w nadfiolecie, laczy frakcje za¬ wierajace pojedyncze czynniki i odparowuje aceto- nlftryl pod silnie obnizonym cisnieniem i pozostale wodne roztwory poddaje wymrazankk Otrzymane produkty rozpuszcza sie ponownie w destylowanej wodzie i chromatografuje stosujac odwrócona faze adsorbentów, eluujac 5(P/o roztworem wodnym me¬ tanolu. Jako adsorbenty stosuje sie np. ladunki preparatu Sep. Pak. C1I&, produkcji firmy Waters Associates Inc., Mlilford, Massachusetts, St. Zj. Am.Przyklad II. Wytwarzanie siarczanów czyn¬ ników Bi, Bj, B», Cu, Ca i Ei antybiotyku A-4096. 900 g antybiotyku A-0090, wytworzonego sposo¬ bem podanym w ustepach Al—D przykladu I, mie¬ sza sie z 2 litrami zdejonizowanej wody i otrzy¬ mana zawiesine zakwasza 3m kwasem siarkowyfm do wartosci pH 2,7. Zakwaszony roztwór odwiro¬ wuje sie w ciagu 40 minut przy 2000 Obrotach/mi¬ nute, zdekantowany odciek wprowadza na kolulmne (&X86 cm) zawierajaca 6 litrów odbarwiajacej zy¬ wicy Doulite SflOl i eJuuje skladnik aktywny zde- jonizowana woda z predkoscia 30 ml/minute. Prze¬ bieg eluowania sledzi sie metoda chromatografii cienkowarstwowej i frakcje zawierajace antybio¬ tyk A~4686 zateza pod cisnieniem 40 hPa w tempe¬ raturze ,36°C do Objetosci 3 litrów i wymraza pro¬ dukt. Otrzymuje sie odbarwiony kompleks w po¬ staci stalego produktu o barwie od bialej do bra¬ zowawej, z wydajnoscia wynoszaca okolo 701% wy¬ dajnosci teoretycznej w stosunku do bioaktywnosci. 25 Poszczególne czynniki Bi, B2, Bs, Cia i Ei anty¬ biotyku A-4096 w postaci siarczanów wyosobnia sie w sposób podany w ustepie F przykladu I.ZaiS t rzezem i/a patentowe 1. Sposób wytwarzania kompleksu antybiotyku A-40916 albo nowych czynników Bi, Bj, Ba, Cu, C8 10 i Ei tego antybiotyku, a takze farmakologicznie dopuszczalnych addycyjnych soli z kwasami, zna¬ mienny tym, ze prowadzi sie hodowle mutantów szczepu Actinoplanes missouriensds ATOC 23342 (ATCC 31680 lub ATCC 31680 lub ATOC 3(1083) 15 na drodze wglebnej fermentacji aerobowej na po¬ zywce zawierajacej zródlo przyswajalnego wegla, azotu i nieorganicznych soli^ az do uzyskania pro¬ duktu o duzej aktywnosci antyfbiotycznej, po czym ewentualnie otrzymany produkt rozdziela sie na 20 czynniki aktywne i ewentualnie prowadzi sie prze¬ miane produktu w jego farmakologicznie dopusz¬ czalna addycyjna sol z kwasem. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania czynnika Bi prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes miissouriensis ATOC 3(16812 lub ATOC 3168& i z uzyskanego kom- plekisu wyodrejbnia sie zadany czynnik. 3. Sposób wedlug zastrz. 1,, znamienny tym, ze M w przypadku wytwarzania czynnika Bj prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATCC 3108:0 lub ATOC 3(10813 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 w przypadku wytwarzania czynnika B3 prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATOC 310&i3 i z uzyskanego kompleksu wyodrejbnia sie zadany czynnik. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 40 w przypadku wytwarzania czynnika Cu prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes . miissouriensis ATCC 310812 lub ATOC 3110813 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 45 w przypadku wytwarzania czynnika Cj prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATOC 3(1080 lub ATCC 31088 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 50 w przypadku wytwarzania czynnika Ei prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATOC 31083 i z uzyskanego kompleksu wyodreb¬ nia sie zadany czynnik.134197 (L-rystoza- mina) C I NH Ct NH c NH 0= Wzór Dtugosc fali (jjm) 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 250 Liczba falowa ICM"' FIG. I ""£ 2.5 •^ 100 o 80 8" 3 40 ° 20 !~^\ 3 f—*- *- 4 5 —, i , i ,.,— Dtugosc fali (jjm) 6 7 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 \A[y^^J^^^^\ \r V y \ 1 » * » « « . « * i 4000 3500 3000 2500 2000 1600 1600 1400 1200 1000 800 600 (CM"1) 400 250 Liczba falowa FIG. 2134 197 Dtugosc fali (jjm) 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 " ' r 1 Ul 1 I | , , , ! t = 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 Liczba falowa ,CM"1} FIG. 3 800 600 400 250 Dtugosc fali (pm) 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 250 {CM"1) Liczba falowa FIG. 4 Dtugosc fali (jjm) 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 250 Liczba falowa m'}) fig. 5134 197 40 h 0 4000 Dlugosc fali (jjm) 4 5 6 7 8 9 10 12 W 1f» 18 20 25 30 40 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 2l0 Liczba falowa «*r1 FIG. 6 PL PL PL PL

Claims (4)

1. zastrzezeniach okresle¬ nie „antybiotyk A-4IO9I0" oznacza kompleks akta- planinowanego antybiotyku podczas gdy rózne czynniki wyosobnione z tego kompleksu nazywa 20 sie tu czynnikami A, Bl, B* B* Cu, C* Ek itd. antybiotyku A-4606. Antybiotyk A-4096 i poszcze¬ gólne, wyosobnione z niego czynniki sa wysoce skuteczne w hamowaniu rozwoju mdkroorganizmóW chorobotwórczych u ludzi i zwierzat, a .poza tym * czynniki te stosuje sie jako srodki przyspieszajace wzrost kurczat, trzody chlewnej, owiec i bydla. (Nowe, antybiotyczne czynniki Bi, B,, B», Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4096 sa zwiazkami zasadowymi i moga tworzyc z odpowiednimi kwasami sole. Po- 30 dane ponizej cechy charakterystyczne tych czyn¬ ników odnosza sie do soli tych czynników z kwa¬ sem solnym, ale oczywiscie mozna tez znanymi sposobami wytwarzac i inne sole farmakologicznie dopuszczalnej 98 Badania prowadzone metoda chromatograftocien¬ kowarstwowej (TDC) na zelu krzemionkowym, me¬ toda cieczowej chromatografii cisnieniowej (HPLC) wykazuja, ze przy wyosobnianiu antybiotyku A- -40W otrzymuje sie mieszanine kilku skladników, 40 wykazujacych dzialanie antybiotyczne. Z antybio¬ tyku A-4696 mozna odkfeieMc preparatywnie meto¬ da chromatograf iii na kolumnie poliamidowej czyn¬ niki oznaczone symbolami A, Bi, B* Bj, Cu, Cs i Ei. Otrzymane frakcje bada sie oznaczajac ich * aktywnosc w swietle nadfioletowym i metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej, po czym frakcje chromatograficznie identyczne, zawierajace czynni¬ ki A, Bi, Bs, Bs, Ci., Ca lub Ei laczy sie odpowied¬ nio i suszy przez wymrazanie. Wytworzone pro- 5* dukty identyfikujace sie i oznacza ich czystosc me¬ toda cieczowej chromatografii cisnieniowej. Czynnik A antybiotyku A-4BI0» wyosobniano juz wczesniej i jest on ujawniony w opisie patento¬ wym Stanów Zj. Ameryki nr 411$ 5512 i dane do- 55 tyczace tego czynnika zamieszcza sie ponizej w opi¬ sie jedynie w celu ulatwienia opisania procesu od¬ dzielania nowych czynników antybiotyku A-48&6 i scharakteryzowania ich. Badanie antybiotyku A-4606 metoda chromato-, w grafii cienkowarstwowej z zastosowaniem nalozo¬ nej biowarstwy i z uzycielm metanolu, chlorofor- mu, stezonego wodorotlenku amonowego, H-r||d.- butanolu i wody jako rozpusczakiica oraz Ba^JhW subtilis jako organizmu wykrywajacego, daje M- * stepujace wyniki.134 W 5 Czynnik A-4G96 A Bi *» B3 Cia Wartosc Rf M5 0,35 0^5 (0,40 0,5)1 Tablica 1 Stosunki molowe obojetnych cukrów Badanie antybiotyku A-46&6 metoda cieczowej chromatografii cisnieniowej w temperaturze poko¬ jowej i jprzy uzyciu 2P/t roztworu wodnego kwasu octowego z cyjankiem metylu w stosunku 90:10 oraz w stosunku 70$0 daje nastepujace wyniki. Czynnik A-4096 A , Bi B, B, Cu c, | Ei Wartosc K' 1,00 1,99 8,84 0jl50 2,9(2 4,23 0J3I& 10 15 20 Stosujac metode TDC ii HFLC mozna z antybio¬ tyku A^4Q9B oddzielic takze mniejsze ilosci i in¬ nych czynników, oznaczonych symbolami Cib, C^a, Cib i D, pod wieloma wzgledami podobnych do czynników A, Bi, Ba, B8, Cu, Ca i Ei tego antybio¬ tyku. Oprócz tego, w kompleksie antybiotyku A- -4696 moga byc jeszcze inne czynniki, dotychczas nie odkryte. Czynniki Cib, Cja, C« i D nie zostaly wyosobnione i oczyszczone w ilosciach umozliwia¬ jacych dokonanie ich charakterystyki. Gdy antylbiotyk A-4l6l9i6 lulb jego poszczególne czynniki -poddaje sie hydrolizie w lagodnie kwa¬ snych warunkach (S|V» roztwór HCl w metanolu, temperatura wrzenia pod chlodnica zwrotna, okres trwania reakcji 70 minut), wówczas wytwarza sie pseudo-aglikon. Wytraca sie on z mieszaniny reak¬ cyjnej i w przypadku hydrolizy czynników A, Bi, B2, B3, Cia i C3 antybiotyku A-4696 ma budowe. o wzorze podanym na rysunku. W przypadku czynnika Ei antybiotyku A^4G96 jest mozliwe, choc nie stwierdzono tego z pewnoscia, ze wytworzony piseuido-aglikon ma nieco inna budowe. Badanie metoda bifbulowa i metowa chromato- graifii denkowarstwowejj przesaczy po hydrolizie komipleksu antybiotyku Ah46|96 i poszczególnych czynników tego antylbiotyku wykazuje, ze oprócz rdzenia z pseudo-aglikonu kompleks ten i czynni¬ ki zawieraja rózne ilosci obojetnych cukrów. Ro¬ dzaj tych cukrów i ich wzajemne stosunki molowe podano w taJblicy 1. Wyniki podane w tej tablicy odnosza sie do pochodnych trójmetylosililowych cukrów oznaczonych metoda chromatografii gazo¬ wej. Dla kazdego cukru podano suimje izomerów a i 0. Poszczególne czynniki anltybilotyku A-4J&96 róznia sie glównie ich skladnikami w postaci obojetnego cukru, przylaczonymi do pseudo-aglikonu w nie¬ znanych pozycjach. 30 35 40 45 50 55 Czynnik antybiotyku | A-4^96 A Bi Bx Bz \ Qa Mannoza ai80 2,05 1£0 2,tt AjlB Glikoza 1,0 *,o 1,0 a,o 1,0 Ramnoza ^ 1,01 H \ «—1 1 1,08 65 jCzynnik Bi antybiotyku A-4600 jako sól z kwa¬ sem solnym jest produktem krystalicznym o bar¬ wie bialej, rozpuszczalnym w wodzie* w rozpusz¬ czalnikach hydroksylowych i polarnych, a nieroz¬ puszczalnym w rozpuszczalnikach) takich jak eter, chloroform, benzen, aceton, weglowodory alifaty¬ czne., weglowodory chlorowane Irtp. W roztworach wodnych jest on trwaly przy wartosci pH od oko¬ lo 4 do okolo 9, w temperaturze do okolo 27^C. .Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Bi anty¬ biotyku Ah4G9£ wykazuje sklad: ^lfilP/e C; 5,25P/i H; 4,88Vo N; 4fi2fh Cl i reszta tlen. Przyblizony ciezar czasteczkowy, okreslony teoretycznie przez polaczenie ciezarów czasteczkowych pseudo-agliko¬ nu i znanych, przylaczonych cukrów, wynosi 1954. Widmo absorpcyjne w nadfiolecie w wodzie wyka¬ zuje maksimum przy 280 om (EJvJm^*Bi3)- Widmo absorpcyjne tego zwiazku w KBr w podczerwieni przedstawiono na fig. 1 rysunku. Zaobserwowane, dajace sie odrózniac maksima absorpcji przy licz¬ bie falowej 400Q—700 cm-1 sa nastepujace: 3860 szerokie, 2980, 1731, 109% 1054., 1637, 1015, 1588, 1577, 1.501, 1500, 1488, 14120, 1301, 12819, 1229, 1210, 11718, 1)1154, 1121, 1076, 1000, 1000, 1012, 9182, 880, 840, 831 i 8110 cm-i. Czynnik B, antylbiotyku A-4606 w postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o bar¬ wie bialej, rozpuszczalnym, w wodzie, rozpuszczal¬ nikach hydroksylowych i polarnych, a nierozpusz¬ czalnym w rozpuszczalnikach takich jak eter, chlo¬ roform, benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, chlorowane weglowodory itp. W wodnym roztwo¬ rze jest on trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9, w temperaturze do okolo 27,0C. iMikroanaliza chlorowodorku czynnika B, anty¬ biotyku A-4H9I6 wykazuje sklad: 51,96^/t C; 4,67*/e H; S^/f N; 5^8i8P/# CL,, a reszte stanowi tlen. Przy¬ blizony ciezar czajsteczkowy, okreslony teoretycznie przez polaczenie ciezarów czasteczkowych pseudo- -aglikonu i znanych, przylaczonych cukrów, wyno¬ si 1808. Widmo aJbsorpcyjne w nadfiolecie w wo¬ dzie wykazuje maksimum przy 280 nm (E1*/* = = 44,7). Widmo absorpcyjne tego zwiazku w KBr w podczerwieni przedstawiono na fig. 2 rysunku. Zaobserwowane, dajace sie odrózniac maksimum albsorpcji przy liczibie falowej 4000—700 cm-1 sa nastejpujace: 3400 szerokie, 2984, 1730, 1658, 1014, 1588, 15418, 1504, 14913, 1400, 14B6* L290, 1231, 1B10, 1170, iaai, 10B1, ioai, 1017,9187,303, S841 aie cm-i. Czynnik Ba antybiotyku A-4606 w postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnikach134 i«7 hydroksylowych i polarnych, a nieropusoczalnym w rozpuszczalnikach takich jak eter, chloroform, benzen., aceton, weglowodory alifatyczne, weglowo¬ dory chlorowane itp. W roztworze wodnym jest on trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9 w temperaturze do okolo 2I7°C. Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Bs anty¬ biotyku A-4696 wykazuje sklad: mjMf/o C; 4,74P/o H; 5j8&h N; 5$n*h Cl, a reszte stanowi tlen. Przy¬ blizony ciezar czasteczkowy, okreslony teoretycz¬ nie przez polaczenie ciezarów czasteczkowych pseu- do-aglikonu i przylaczonych znanych cukrów, wy¬ nosi 1808. Widmo absorpcyjne w nadfiolecie w wodzie wykazuje maitósdimum przy 280 nm (EJ1^ .= = 46,3). Wkhno absorpcyjne tego zwiazku w KBr w podczerwieni pa^edstawiono na fig., 3 rysunku. Zaobserwowane, dajace sie odrózniac maksima absorpcji przy liczbie falowej 41000—700 cm-1 i 3394 szerokie, 2608, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, lfll'4, 1150)1, 1515, 1504, 14180, 1407, 11350, 12911, 1228, lft09 1180, 1120, 1072, 105(1, 1010, 966, 908, 8(82, 84)6 : 816 cm-1. Czyirmik Cia antybiotyku A-46&6 w postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, w rozpuszczalni¬ kach hydroksylowych i polarnych, a nierozpusz¬ czalnych w takich rozpuszczalnikach jak eter, chlo¬ roform, benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, weglowodory chlorowane itp. W wodnych roztwo¬ rach jest trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9 w temperaturze do okolo ET^. Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Cu anty¬ biotyku A-46196 wykazuje sklad: WjO&k C; 4,74% H; 598t3P/» N; 5$&h Cl i reszte stanowi tlen. Przy¬ blizony ciezar czasteczkowy tego zwiazku, obliczo¬ ny teoretycznie przez polaczenie ciezarów czastecz¬ kowych pseudo-aglikonu i przylaczonych znanych cukrów, wynosi 1702. Widmo absorpcyjne w nad¬ fiolecie w wodzie wykazuije maksimum przy 2T79 nm (Ej1^ =4(7,9). Widmo aibsorpcyjne tego zwiaz¬ ku w KBr w podczerwieni przedstawione na fig. 4 rysunku, wykazuje nastepujace dajace sie odróz¬ niac maksima absorpcji przy liczfbie falowej 4000^- 700 cm-1: 3380 szerokie, 29011, /17BI4, 1650, 1616, 1591, 11506, 14fltt, ,1427, 15619, 12190, U238, 121113, 1177, 1123, 1072, 1061, 10312, 10117, 087, 000, 860, dlfc i 715 cm-*. Czynnik C* antybiotyku A-46196 w (postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnikach hydroksylowych i polarnych, a nierozpuszczalnym w takich rozpuszczalnikach jak eter, chloroform, benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, weglowo¬ dory chlorowcowane itp. W wodnych roztworach jest trwaly przy wartosci pH od okolo 4 do okolo 9 w liemperaturze do okolo a7?C. Mikroanaliza chlorowodorku czynnika Cs anty¬ biotyku A-4&96 wykazuje sklad: i5tl,73P/* C; 4^/o H; &#lk N; 6,0GP/« Cl, a reszte stanowi tlen. Wid¬ mo absorpcyjne tego zwiazku w nadfiolecie w wo¬ dzie wykazuje maksimum przy 080 nm (£}*/• = 1 cm 47,9). Widmo aibsorpcyjne w KBr w podczerwieni, przedstawione na lig. 15 rysunku, wykazuije dajace sie odrózniac maksima aibsorpcji przy liczbie falo¬ wej 4000—7(00 cm-1 jak nastepuje: 3BT7I8 szerokie, 9985, 1738, 168®, 1658, 16B7, 1016, 1-589, 1*57I3 1&46, 1536, ,1820, 1528, ill503, 148)9, 14l74, 145T7-,' 14126, 1421, 1897, 1387, 12186, 12311, 1206, lill21, 1075, 106B, 10(218, 1012, 987, 905, 94l9, 87B, 840, 816, 769 i 708 cm"1. 5 Czynnik Ei antybiotyku A-4696 w .postaci chlo¬ rowodorku jest krystalicznym zwiajzkiem o barwie bialej, rozpuszczalnym w wodzie, rozpuszczalnikach hydroksylowych i polarnych, a nierozpuszczalnym w rozpuszczalnikach takich jak eter, chloroform, *• benzen, aceton, weglowodory alifatyczne, weglowo¬ dory chlorowane itp. W roztworach wodnych jest x trwaly przy wartosciach pH od Okolo 4 do okolo 9, w temperaturze do okolo 37*/©. iMikroanaliiza chlorowodorku czynnika Ei anty- i» biotyfcu A-4696 wykazuije sklad: 50,m% C; 4,7flP/o H; 9,0lV» N;l,8tf/t Cl, a reszta stanowi tlen. Wid¬ mo aibsorpcyjne tego zwiazku w nadfiolecie w wo¬ dzie wykazuje maksimum przy 2TCI9 nm (E^m ^ 39,9), a widmo aibsorpcyjne w KBr w podczerwieni, 10 przedstawione na ffe. 6 rysunku, wykazuije dajace sie odrózniac maksima absorpcji przy liczbie falo¬ wej 4O0Oh-7{H) cm-1 jak nastejpuje: 38194 szerokie, 29013, 1667, 1606, UBUO, 15019, ,H5BI8i, 1511, 1505, 14158, 14214, 1393, 1309, 13128, 1320, 1391, 4232, nm, 1178, 25 11420, 1075, 1001, 10311, 1018, 986, 917)3/904, &!8, 847, 813, 770., 75|2, 7818 i 714 cmr-i. Stwierdzono, ze antybiotyczna aktywnosc czyn¬ ników Bi, Ba, B* Cia, G3 i Ei antybiotyku A-4J8i96 w postaci chlorowodorków jest zasadniczo taka * sama, jak aktywnosc antybiotyku A-4686 (cjpis pa¬ tentowy Stanów Zj. Ameryki nr 41T5 5612) przeciw Bacillus suibtilis. Farmakologicznie dopuszczalne sole czynników Bi, B* Bs, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4J096 mozna 35 wytwarzac znanymi, sposobami stosujac kwasy mi¬ neralne, takie jak kwas solny, ibromowodory, kwa¬ sy sulfonowe, .kwasy fosforowe itp. Antyibiotycznie dzialajace sole takich kwasów wytwarza sie np. w ten sposób, ze roztwór antybiotyku w postaci 40 wolnej zasady zakwasza sie odjpowiedniim kwasem i wytraca sól przez dodanie acetonu. Sole takie mozna tez niekiedy wytwarzac droga wymiany jo¬ nów na kolumnie z wymieniaczem jonowym. Moz¬ na tez stosowac inne, znane sposoby wytwarzania 45 solij Nowe czynniki antybiotyku A-4696 hamuja roz¬ wój wielu mikroorganizmów chorobotwórczych dla ludzi, zwierzat i roslin. Stezenia chlorowodorków czynników Bi, B^, 'Bs, Cia, C3 i Ei antybiotyku 50 A-4606, (przy których zwiazki te hamuja rozwój niektórych mdkrooriganizmów, podano w taiblicach 2 i 3. Stezenia te okreslano metoda rozcienczania na agarze i wyrazono je jako najnizsze ©tezenie inhibitujace (MIC) w mifcrogramach na 1 ml (^ig/ w /ml). PonliizSEe dane wykazuja, ze chlorowodorki czyn¬ ników Bi, B2, B3, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4'696 sa skutecznymi^ srodkami przeciw bakteriom i drobnouistrojom, uzytecznymi przy zwalczaniu cho- w robotwórczych mikroorganizmów. Poza tym, czynniki te lulb ich addycyjne sole z kwaisaimi moga Ibyc wtprowadizane do pasty do zebów, zelu, proszku, cieklych preparatów do plu¬ kania ust oraz innych srodków higieny jamy ust- 65 nej, co umozliwia zapobieganie próchnicy i scho-134 197 !• Tablica Najnizsze stezenie itoniibitujac* Badany miikroorgandzim (baikteria) Stapihylococcus epd Hitchen®1 Staphylococcuis epi Bultt. Saiplhylococcuis eipdi Bennet Stajphyilococcus aureus 41203 Stapnylococcus aureias ^05*6 Stapliylococculs aureus 811312 Stapnylococous aureuis H12J5 Staphylococcuis aureuis 310(4 Stapihylococcus aureuls 3123 Staiphylococcuis aureuis H5l36 Stjaiphylococculs aureuis 311311 Strelptococcu& Group D I2i8|2 Streptococcus Group D '2B0 Streptococcuis Grouip D S$i9lQI2 Streptococcus Grouip D 0901 Streptococcus Group D 99fl& Streptococcus Grouip D 99G53 Strerybococcuis Grou(p D Guze .Streptococcus Group D il2M5)3iF Streptococcus vixiidamis 919(402 | Streptococcuis viriidans OlOrttt 1 Sitreptococcuis pyogenes Q2K3 Streptococcuis pyogenes DS6I6B-7I2 Strepitococcus pyogenes DiSi664-7I2 Streptococcuis ipneumoniae Park 1 Streptococcuis pneunioniae Type 14 Staphylococculs aureus 3074 Streptococcus faecalis X66 Proteus morganii HR15 Salmonella tylphosa SA12 Klebsiella pneuimoniae KLnl4 Enterobacter aerogenes EB17 Serratia marcescens SE3 Eschericia coli EC14, Oitrobacter freudiii CFI17 Pseudomonas aaruiginosa Xi2l319 Bordatella bronhiseptica 16 Salmonella typhitmuiriiuim Pseudomonas solanacearuni X185 Erwinia amylovora Oandida troipicalis Al? Trichophyton menitacrophytes 217 Aspergillus flavus E Geratocystis ulmi 2 i czyinniiika w ng/ml B, TU 0^!5 10 119 4 16 4 8 a a »a 2 2 2 2 2 2 2 2 0,6 1 0,5 *;5 •0,5 H),5 0,5 312 1 iaa i28 l|28 1|28 ll28 ll28 1)28 ll28 1)28 1|28 :il2a 64 1128 U28 1|28 H28 ©2 a, 0,25 4 4 2 4 2 4 4 4 4 3 2 1 2 2 2 1 ' 13 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 18 »l 1I2(8 .lB& 103 12f8 (1'2I8 123 lfl8 1'28 m 128* l«2f8 128 1* r* 126 l;2fc B3 2 0,06 2 1 1 12 2 2 1 12 12 0,6 0j5 0y5 0,5 0,3 0y5 0,5 0,5 0,26 0£ 0,25 0,6 0,6 bfi 0J5 4 <0£ lfl» 198 1«28 r28 VZ8 iaa 138 1!28 128 VM 198 112(8 198 1"28 198 128 Cl* 2 0,13 I 1 1 3 1 2 2 2 a o£ 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5 0y5 0,5 0,5 | 0,5 1 0,5 0,5 0,6 0,5 0,5 8 2 128 138 128 128 128 ,m 128 12i8 I2l8 128 128 11218 12fl 128 128 1"28 1 Szczepionka w agarze MH 1 :500 2 Szczepionka w agarze MH li: 10, 5i% krew królicza. rzeniom okolozejbowym powodowanym pirzez bak¬ terie. Mozna tez roztwór jednego luib kilku czyn¬ ników antybiotyku A^4G9I6 liuib ich soli addycyjnych z kwasaimi nakladac na powierzchnie dziasel i ze¬ bów za pomoca odlpowiedniego wacika. jJak wspomniano wyzej, czynniki Bi, B^, B3, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4)6(9^6 przyspieszaja wzrost i zwiekszaja stopien wykorzystywania pokarmu u drobiu, trzody chlewnej, owiec i bydla. Na przy¬ klad, dzienna dawka jednego lulb -kilku tych anty¬ biotyków w ilosci od okolo 0,6 mg do okolo 25 mg na 1 kg masy ciala przyspiesza wizrost i zwieksza wykorzystanie pokarmu u diroibkii i trzody chlew- 55 nej w porównaniu z odipowiednimi olbjawaimti u zwierzat, którym podaje sie tylko podstawowa pa¬ sze, ibez skladnika czynneego. Okreslenie „pasza podstawowa" oznacza tu calkowita pasze podawana zwierzetom i skladajaca sie z roznych skladników 60 pokarmowych, koncentratów, dodatków, substancji mineralnych, przedrndeszek witaminowych i leczni¬ czych, .skladników niestrawnych i innych, koniecz¬ nych w zywieniu zwierzat. Typowe pasze dla dro¬ biu i trzody chlewnej omówiono w opisie patento- 35 wym Stanów Zj. Ameryki nr 4116 5612.134197 li Tablica 3. Najnizsze stezenie inhibiltujajce w |igrtml 12 c.d. taiblicy 3 Badany mikroorganizm (bakteria) * Staphylococcus aureus XLI Staphylococcus aureufi V41 Staphylococcus aureus X4O0 Staphylococcus aureus S13E Stapihylococcuis epklermidis 1 Staphylococcus ep&dermftdis 2 Streptococcus Grouip A C206 Streptococcus Grouip D X68 Streptococcus Group D 9960 Streptococcus i pneuimoniae park Haemophilus infiluenzae sens. CL. Haemophilus influenzae ros. 76 Shigella sonnet N9 E. coli N10 E. coli E014 E. coli TEM Klebeiella X26 Klebsiella KAE Enterobacter aerogenes X6» Enterobacter aerogenes C32 Enterobacter aerogenes EB17 Enterobacter cloacae EB5 Enterobacter cloacae 265A Salmonella typhosa X514 Salmonella typhosa i 1335 Pseudomonas aeruginosa X528 Pseudomonas aeruginosa X239 Pseudomonas aeruginosa Psi® Serratia marcescens X99 Serratia marcescens ¦ SE3 Proteus morganii PR15 Proteuls inconstans PR33 O, 2 , 2 1 2 2 2 1 0,5 1 2 0,5 32 64 i 126 ' 128 128 128 128 128 ll28 128 li28 1&8 128 1I28 1!28 1 lt28 128 128 128 128 U28 128 li 8 ' 16 16 16 16 32' 16 1 4 18 V 12I8 128 H28 128 :128 128 . ¦ !128 128 '128 128 I128 128 iL28 128 128 128 128 128 128 128 128 !128 10 15 35 45 1 a Proteus relftgeri PIR7 Proteus rettgeri X24 Ciifcrobadter freuindii CP17 Bordetella [fronchiseptica 1)6 Cloistridiium defficile 2994 CHostridium perMngens 31( Clostridium seloticuim im Eulbacterium aerofaciens 1235 Peptococcus asaceharolytteuis 1302 Peptococcus prevoti 1120(1 Peptosireptoicoccus anaerobius 14128 Pepltoslreptococcus iintermedius 12641 | Propdoniibaicrteriium acnes 7(9 Bacteroides fnagilis ni Bacteroides fnagilis 187^7 Bacteroides fnagilis 193GB Bacteroides i^etaiotaomocron 141318 Bacteroides melaninogenicus 1856/28 Bacteroides melaminogenicus mse Bacteroides vulgatis 1211 Bacteroides corrodens 11874 Fusobacteriuim symlbnosum 114170 Pusobacteriuim | necrophorum W)54A 2 128 iaa 1128 l!28 1 1 i-i 1 «. 126 !128 2 1 128 128 64 64 K28 128 128 1128 32 128 3 1 128 128 128. 128 1 1. 1 1 1 "¦ 126 »128 • 4 .1 128 ll28 ' ' 128 128 i»128 128 il28 I128 128 tt28 Zgodnie z wynalazkiem, w celu polepszenia wy¬ korzystania pokarmu i przyspieszenia wzrostu, czynniki Bi, B^ Bs, Cia, C3 lub Ei antybiotyku A~4896 afllbo idh pochodne lub mdleszaininy podaje sie doustnie wraz z odpowiednimi pokarmem w ilosci okolo 2—1200 g na 1 tone calkowitego po¬ karmu. Czynniki antybiotyku A-4G96 wytwarzane sposobem wedlug wynalazku korzystnie jest doda¬ wac do paszy dla zwierzat w postaci odpowiedniej przedmiesaki {patrz nip. opds patentowy Stanów Zj. Ameryki nr 41H55I5)2), zawierajacej w 1 kg okolo li—filOO g tych czynników, ich pochodnych lutb mie¬ szanin. Przedmieszke taka wprowadza tfie do go-134197 19 14 towej dawM paszy. Mozna tez mieszac te aktywne czynniki z koncentratem paszowym lu!b innymi dodatkami i nastepnie dodawac do paszy. Wprawdzie nowe czynniki Bi, B* B», Ga, Cs i Ei antybiotyku A-4606 maja wieloraka przydatnosc, ale szczególnie uzyteczne sa jako antybiotyki, co ma istotne znaczenie z uwagi na duze znaczenie zwalczania mikroorganizmów chorobotwórczych. Jak wspomniano wyzej, nowe czynniki antybio- tyczne wyosobnia sie zgodnie z wynalazkieta z an¬ tybiotyku A-4606, wytworzonego przez hodowle pewnych szczepów Actimaplanes w warunkach ae- robowych w odpowiedniej pozywce az dó chwili, gdy uzyska sie w srodowisku hodowlanym znaczna aktywnosc antyibiotyczna. Czynniki te wyosobnia sie i oczyszcza róznymi, odpowiednimi sposobami. Mikroorganizm stosowany do wytwarzania anty¬ biotyku A-4096 stanowi szczep Atotinoplanes mis- souriensis z rodziny Actinoplanaceae, nalezacej do rzedu Actindrnycetales, opisanego przez dr John N. CouCh, Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 66, 2h&— m (1W») i 66, 87M92 (196); Trans New York Acad. Sci., 16, &15M318 (1054); Jour. Elteha Mitchell Sci. Soc., 71, 1W8M155 i 260 aflBW; Bergeyfc Manual of Determinative Bacteriology, wydanie 7, 805MBIB9 (1957) i Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, B&—70 (108B). (Biologicznie czyste hodowle szczepów Actinopla- nes misBouriensas uzyteczne przy wytwarzaniu: an- tyibiotyku A-4606, z którego nastepnie wyosobnia sie czynniki Bi, B* Ba, Cia, Cj i Ei zdeponowano w American Type Culture Collection, RockvHIe, Maryland pod numerami ATOC 510810, ATOC 31682 i ATOC 316&&. Szczep ATOC 31692) jest uzyteczny do wytwarzania antybiotyku A-4806 w celu wy¬ osobnienia zen nastepnie czynników Bi i Ci. anty¬ biotyku A-4096, szczejp ATOC 316B0 sluzy do Wyo¬ sobniania czynników C« 1 B* antybiotyku A-*4!69ti, a szczep ATOC #1688 do wyosobniania czynników Br i Ei antybiotyku A-4606L Charakterystyke fizyczna i hodowlana szczepów ATCC 31660, ATOC 31G8B i ATOC 311688 ACtino- planes missouriensis podano ponizej. Szczejpy te otrzymano w wyniku szeregu mutacji z ATCC 2tfM2, znanego z oiplsu patentowego Stanów Zijedn. Ameryki nr 4110 9512. Szczepy te wytwarzaja po¬ dobna grzybnie i ich morfologia jest zasadniczo taka sama jak szczepy macierzystego. Nie zaobser¬ wowano grzybni powietrznej, grzybni wtórnej ani zarodni, a poza tym, przy stosowaniu techniki ta¬ kiej jak hodowla na ziarnach pylku kwiatowego równiez nie uzyskuje sie zarodni. Glówne róznice pomiedzy szczdpami stosowanymi zgodnie z wynalazkiem wystejpuja w cechach ho¬ dowlanych, zwlaszcza w pigimenltacji pierwotneij i grzybni. Szczep ATOC 31680 ma grzybnie zabar¬ wiona pomaranczowo — od barwy umiarkowanie lub hrazowo^pomaranczowej do barwy silnie po¬ maranczowej, zaleznie od srodowiska. Szczepy ATOC 3161812 i ATOC 31088' nie maja tak wyraz¬ nego zabarwienia i ich grzybnie maja barwe zólta- woszara. W 'taksonomicznych badaniach tych szczeipów stosowano znane metody, zwlaszcza zalecane przez International Streptomyces Project (ISP), opisane przez Shirlkiga i Gottlieba, 1066, Intern. J< of Syistematic Bacterioll. 16 (8), str. SIO—MO. Badania enzymowe prowadzone metoda Blazevica i Edere- ra, 19T75, Prittciples of Biochemical Tests in Dia- 5 gnositic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, a nazwy barw, skróty i niuimery za¬ czerpnieto z metody TSOC-JNBS Ke^y and Judd, 197*6, The ISOC-iNBS Centroid Oolor Charts Stan¬ dard Sample No. 2106, U.S. Dept. of Commerce, 10 National Bureau of Standards, Washington D.C. Odpornosc na dzialanie Iizozymiu i rozklad kazei¬ ny, eskuliny, hypoksantyny, tyrozyny i ksantyny mierzono metoda Berg, 10M3, Appl. Microbiol. 25, str. 66®—€U. Badano równiez wykorzystywanie we- 15 gla i wyniki badan oznaczono nastepujaco: +'+ oznacza wykorzystanie równe lub lepsze od wykorzystania gMkozy, to jest wykorzystanie pozytywne, + oznacza wykorzystanie slabsze od wykorzysta- n nia glikozy, ale widoczne, to jest wykorzy¬ stanie pozytywne, /+/ oznacza wzrost,, to jest wykorzystanie watpli¬ we. <— oznacza brak wzrostu, to Jest brak wykorzy- 25 stania. Ponizej w tablicach 4, 5 i 6 podano taksonome- tryczny opis, w tym równiez cechy hodowlane i fizjologiczne szczefcrów Actinoplanes stosowanychw procesie prowadzonym zgodnie z wynalazkiem. 30 Tablica 4 Ogólne cechy hodowlane i fizjologiczne szczepu Actinolplanes ATOC 3116810 (stosowanego przy wy¬ twarzaniu czynników Bj i C») j Rodzaj badania | .1 1 Cechy hodowli na pozywce Pozywka ISP nr 2 Pozywka ISP nr 3 Pozywka ESP nr 4 Pozywka ISP nr 5 Pozywka ISP nr 7 Wlasciwosci lufo wynik próby 1 a 1 Wzrost obfity, rewers I ?6.1.yBr; brak grzybni powie¬ trznej, brak barwnika rozpuszczalnego Wzrost dobry, rewers #3.y Gray, brak grzybni powie¬ trznej i rozpuszczalne¬ go barwnika Wzrost dobry, "rewers 9&nuO., brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, polysk, grzybni powietrznej i rewers 5©js.Om brak rozpuszczalnego barw¬ nika Wrost dobry, rewers 54.br.O., brak grzybni powietrznej,'barwnik rozpuszczalny jasno- brazowymm 15 16 cd. tablicy 4 cj& tablicy 4 [ 1 1 Agar Benettfa 1 Jablczan wapniowy 1 Agar Czapek^ 1 Glikoza — asparagina 1 [Pasta pomidorowa i maka owsiana 1 Agar Anio-Hensen^a Pozywka 5I3H Pepton Czapek'a | Rozklad kazeiny 1 Reakcja katalazy Rozklad eskuliny 1 Uplynnianie zelatyny 1 Wytwarzanie HjS w 1 pozywce ISP nr 6 1 Rozklad hypofcsantyny 1 1 Odpornosc na dziala- I nie liizozymu 1 Pigmenty melanoidowe pozywce ISP nr 1 j 1 pozywce ISP nr 6 1 1 pozywce ISP nr 7 1 1 pozywce ISP nr 7 I bez tyrozyny Tolerancja NaCl na 1 | ISP nr 2 | 1 Redukcja azotanu 1 I Wartosc pH przy wzro¬ scie na pozywce ISP nr 2 1 Wytwarzanie fosfa- 1 tazy | 1 2 1 Wzrost obfity, rewers S&jmjO., ibrak grzybni (powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, polysk, 1 rewers 50j&X)., 'brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego | barwnika | Wzrost dobry, rewers SOj&jO., brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, rewers 5Bjm.Q., brak grzybni ipowietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost obfity, rewers 1 i93.rn.iO., brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost ubogi, rewers | 9&.y. Gray, brak grzyb- 1 ni i rozpuszczalnego barwnika Wzrost uibogi, rewers 91jdJgyY, ibrak grzybni ipowietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika | Wzrost obfiity, rewers 54jbr.O., brak girzylbni, powietrznej i rozpu~ szczalnego pilgimentu Pozytywny j Pozytywny Pozytywny Negatywny | Siady 1 Negatywny | Negatywny [ Negatywny 1 Negatywny Negatywny 1 Negatywny 1 SPh Negatywny 6-6,4 Pozytywny 1 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 a Reakcja z mlekiem zbieranym Hydroliza skrobi na 1 ISP nr 4 Tolerancja sacharozy na ISP nr 2 Temperatura wzrostu | na ISP nr i2 1 Rozklad tyrozyny 1 Wytwarzanie ureazy I Wrazliwosc na anty¬ biotyki: Gefalotyna sodowa 30 |*g Erytromycyna (esto- lan) 115 (Ag | Ghlaromycetyna 30 [tg Nowobiocyna 90 |ig Penicylina G 1(0 | jednostek Ryfatmpina 5 lig | Streptomycyna 10 \vg | Tetracyklina 30 (ig 1 Vankomycyna HC1 1 30 |ig 1 Wytwarzanie ksantyny 1 Wykorzystanie wegla w pozywce ISP nr 9 * z dodatkiem: | bez wegla iglikozy 1 L-arabinozy 1 cellobiozy 1 D-fnufctozy 1 Dngalaktozy 1 i^inozytiu I 1 Dnmanniitu 1 1 melibiozy 1 1 rafinozy 1 1 D-ramnozy 1 Dnrybozy salicyny I sacharozy 1 D-ksylozy | | . Z 1 Negatywny 1 Negatywny 1 0OVo BM37°C 1 (Negatywny 1 1 Pozytywny 1 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy | Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy | Wrazliwy | Wrazliwy 1 Negatywny | — | + + +'+ | +'+ + + ++ — 1 + 1 ' + 1 + 1 + + /+/ + + 1 + 1 * Wyjalowione zródla wegla dodawano tak, aby uzyskac stezanie koncowe l,0P/«.ii j •¦-¦:¦;:'.:;: ,_'• Tablica 5 Ogólne''cechy hoBowIane f Ik^Tóglezrie szczepu Actiaoplanes. missouriensis ATCC 91682 (stosowa? nego przy wytwarzaniu czynników A, Bi, B2 i Cia) Rodzaj badania i * Gechy hodowli na pozywce Pozywka ISP nr 2 Pozywka TSPnr 3 1 Pozywka ESP nr 4 (Pozywka ISP nr 5 Pozywka ISP nr 7 1 Agar Benettfa 1 1 Jaiblczan wapniowy 1" Aigar Czapek^ Gljkpza-asparagina Pasta ponilidorowa — maka owsiana Agar Anio-Hensen^. 1— T Wlasciwosci i lu(b wynik próby 1 * ¦ ¦ j Wzrost dobry, rewers 1 9Q.gy.Y, brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Wzrost dobry, rewers 9B.y Gray, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwnika Wzrost idobry, rewers 7».ljgy.y.Br, .brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego barw¬ nika Wzrost dobry, polysk, rewers 0O.gy.Y, brak grzybni! powietrznej i rozpuszczalnego barw- | nika j Wzrost dosc dobry, rewers $0.gy.yBr, brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego .barw¬ nika Wzrost obfity, rewers I 9!3.y.Gray. brak grzyb¬ ni i rozpuszczalnego barwnika 1 Wzrost dobry, polysk 1 rewers 98.y Gray, brak | grzybni powietrznej i 1 rozpuszczalnego barw¬ nika Wzrost obfity, rewers 1 ®&.y Gray, brak grzyb¬ ni .powietrznej i roz- (puszczalnego barwni¬ ka | Wzrost dobry, rewers 1 9fry Gray, brak grzyb¬ ni .powietrzne! i rozpuszczalnego barw¬ nika Wzrost ohfljty, rewers 1 fltl-d^gy.Y, brak (grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwni¬ ka Wzrost dosc dobry, re- 1 wers 91xi.gy.Y, brak grzyfbni powietrznej;i rozpuszczalnego barw-J ndfca 10 15 40 45 50 00 ." '--'%-'''•• . 1 l Pozywka B3ffl \ 1 • I Pepton Czapek'a 1 Rozklad kazeiny 1 Reakcja katalazy 1 Rozklad eskuliny 1 Uplynnianie zelatyny 1 Wytwarzanie H2S w pozywce ISP nr 6 1 Rozklad hypoksantyny 1 -Odpornosc na dzialanie lizozymu 1 Fig&nenty melanoMo- 1 we na pozywce: 1 ISP nr 1 ISP nr 6 ISP nr 7 | ISP nr 7 bez tyrozyny ~~ 1 Tolerancja NaCl na ISP nr 2 1 Redukcja azotanu 1 Wartosc pH przy wzroscie na ISP nr 2 1 Wytwarzanie fosfatazy 1 Reakcja z inlekiem zbieranym I Hydroliza skrobi na ISP nr 4f 1 Tolerancja,,sacharozy , | na ISP nr 2 1 Temperatura pnzy wzroscie na ISP nr 2 J Rozklad tyrozyny 1 Wytwarzanie urea y 1 Wrazliwosc na anty- [ biótyfci: 1 Cefalotyna sodowa | 30 fig Frytromycyna (esito- | la) 16 yug 1 Chloromecetyina 3K yng I NoWoMocyna 30 [Ag 1 Penicylina G 10 jed¬ nostek Ryfanipina 5 |ig 1 cjd. tablicy 5 1 Q Wzrost dobry, rewers 91.&gy.Y, brak' grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwni¬ ka | Wzrost obfity, rewers 1 9G.gy.Y, brak grzybni powietrznej i rozpusz¬ czalnego barwnika Pozytywny 1 Pozytywny 1 Pozytywny 1 Pozytywny ClOOP/©) slady 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 [ */*. Negatywny | 6M8 Pozytywny 1 Negatywny 1 Negatywny 1 20Vt 10-n3f7°C Pozytywny 1 Pozytywny 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy 1134 IW m c.d. tablicy5 cd. tablicy 6 1 I 1 Streptomycyna 10 fig | Tetracyklina 30 jig 1 Vankotnycyna HO 30|*G 1 Wytwarzanie ktoan/tyny 1 Wykorzystanie wegla ¦ | z dodatkiem: | bez wegla 1 glikozy 1 L-arabinozy 1 cellobiozy 1 D-firuktozy D-galaktozy 1 i-inozytu 1 D-mannitu 1 •melibiozy 1 raftnozy 1 D-ramnozy D-rybozy ¦salicynyi sacharozy D-ksylozy » Wrazliwy Wrazliwy Wrazliwy 1 Negatywny — + +, + +¦ + + + + + +. — | + + + + 1 .+. 1 + 1 + 1 + 1 + + 1 * Wyjalowione zródlo wegla dodawac tak, aby wy*ac koncowe stezenie l,0P/n. JTablica 6 Ogólne cechy hodowlane i fizjologiczne szczepu Actinoplanes irisaouriensis ATOC 31660 (stosowa¬ nego przy wytwarzaniu czynników A, Bi, Bs i B3) Rodzaj badania 1 1 1 Cechy hodowli na pozywce: ISP nr 2 ISP nr 3 ISP «r 4 LSP nr 5 | Wlasciwosci lufo wynik próiby * Wzrost dobry, rewers 1 9 ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barw¬ nika Wzrost dobry, rewers 1 90.y Gray, (brak grzyba ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwn- 1 nika | Wzrost dobry, rewers 79J.gy.yBr., brak grzybni powietrznej i putezczalnego barw¬ nika Wzrost dosc dobry, rewers 90-gy.Y, brak | grzybni powietrznej i 1 rozpuszczalnego barw¬ nika [ 1 ^ l ISP nr 7 Agar Bennefa 1 Jablczan wapniowy Agar Czapek'a 1 Glikoza-susparagina 1 Pasta pomidorowa — 1 maka owsiana 1 Agar Anio-Henson'a 1 Pozywka 59H Pepton Czapek'a 1 Rozklad kazeiny 1 Reakcja katalazy | Rozklad eskuliny Uplynniania zelatyny 1 Wytwarzanie H£ na 1 ISP nr 6 Rozklad hypoksantyny 1 Odpornosc na dziala¬ nie lizozynu 1 Pigmenty mnelanoidowe 1 | -na pozywce: . | | ESP nr 1 't \ \ ISP nr 6 | [ ISP nr 7 | 1 K3P nr 7 bez tyrozyny | Tolerancja NaCl na ISP nr 2 | |" ¦ 2 " ' ' ¦ 1 Wzrost dosc dobry, rewers 80.gy.y.Br, brak grzybni powie¬ trznej 1 rozpuszczal- 1 nego barwnika [ Wzrost obfity, rewers 1 flB.y Gray, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barw- | nica | Wzrost dobry, polysk, rewers Oflcy Gray, brak grzybni powietrznej 4 1 rozpuszczalnego barw- | nika 1 Wzrost obfity, rewers fl3.y Gray, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwnika | Wzrost dobry, rewers flO.y Gray, brak grzybni powietrznej ii rozpu- | szczalnego barwnika | Wzrost dobry, rewers 1 AluLgy.Y, brak grfcyb- mi powietrznej i Roz¬ puszczalnego barwnika Wzrost dosc dobry, rewers 9T.d.gy.Y, 'brak grzybni powietrznej i rozpuszczalnego barw¬ nika „ | Wzrost dobry, rewers 1 flljd.gy.Y, brak grzyb¬ ni powietrznej i roz¬ puszczalnego barwnika Wzrost obfity, rewers 90.gy.Y, brak grzybni powietrznej i rozpu¬ szczalnego barwnika Pozytywny 1 Pozytywny | Pozytywny 1 Pozytywny (lOtP/t) 1 ^—1—"i< 11 —w r-m r—1 ~l slady 1 Negatywny Negatywny 1 Negatywny | Negatywny Negatywny | Negatywny 1 <20Vt . tara 10 15 !•Ll 184197 ] 1 | Redukcja azotanu Wartosc (pH przy | wzroscie ma USP nr 2 1 Wytwarzanie fosfatazy Reakcja z mlekiem zbieranym 1 Hydrolizm skrobi na | ESP nr 4 1 Tolerancja sacharozy na ISP nr 2 1 Temperatura przy wzroscie na ISP nr 2 1 Rozklad tyrozyny 1 Wytwarzanie ureazy 1 Wrazliwosc na antybiotyki: 1 Cefalotyna sodowa - 30 ng Erytromycyna (euto- | lan 16 fig i OMorómycetyna 30|ig Nowobiocyna d0 fig i Fenicylina G 10 jed- 1 nostek Rytfardpina 5 fig Streptomycyna 10 |ig Tetracyklina 30 jjg Vankomycyna HO 30 fig Wytwarzanie ksantyny I Wykorzystanie wegla oa pozywce ISP nr 9 * | z dodatkiem: | bez wegla | glflkpzy 1 Lr-arabinozy |~oell<3biozy ' 1 • jD-Hruktozy D-galaktozy i-inozyitu D-mannitu melibtozy 1 raffinozy D- 1 D-rybozy 1 salicyny 1 isacharozy (D-fcsyilozy cd. tablicy 6 1 2 Negatywny 6^-8,4 1 Pozytywny 1 Negatywny! . | Negatywny 20Vo a-40°C 1 Pozytywny 1 1 Negatywny 1 1 Wrazliwy 1 Wrazliwy Wrazliwy Wrazliwy Wrazliwy WrazliWy Wrazliwy i Wrazliwy' Wrazliwy Negatywny — 1 +)+ | + + | + + ¦ •¦ | + + | + + | — | '+ + | + + | + | + | + ¦+¦ 1 + + | 10 15 30 40 45 *Wyjalowione zródla wegla dodawano tak, aby uzycfcac koncowe stezenia l,QP/§. Jak podano wyzej, zgodnie z wynalazkiem hoduje sie szczepy ATOC 3l«80, ATOC 3168(2 i ATOC 31)6188 AcUnoplanes.n^ an- 55 60 65 tyibiotyk A-4JGI96, z którego nastepnie wyosobnia sie nowe czynniki. Hodowle mozna prowadzic na jedp- nej liulb na kilku pozywkach, ale ze wzgledów ekonomicznych, w celu uzyskania maksymalnej wydajnosci oraz ze wzgledu na latwosc wyosobnia¬ nia antybiotyku stosowanie niektórych pozywek jest szczególnie korzystne. Tak np. skrobia jest korzystnym zródlem weglowodanów, a drozdze korzystnym zródlem azotu. Mozna tez stosowac jako zródla weglowodanów melase, glikoze, dek¬ stryne, gliceryne itp., a jako zródla azotu'równiez mieszaniny aminokwasów, peptony itp. jJak odzywcze sole nieorganiczne do pozywki do¬ daje sie znane sole bedace zródlem jonów sodo¬ wych, foranowych, chlorkowych siarczanowych itp. Poza tym mozna stosowac dodatki! wspomagajace wzrost, takie jak rozpuszczalne pozostalosci gorzelniane i wyciagi z drozdzy, co wplywa korzystnie na wy¬ twarzanie czynników antybiotyku A-4006. Tak jest w (przypadku hodowli innych mikroorganizmów, tak tez i pozywka do hodowli szczepów Actimopla- nes stosowanych wedlug wynalazku powinna za¬ wierac pierwiastki sladowe. Pierwiastki takie Wypro¬ wadza sie zwykle w postaci zanieczyszczen sklad¬ nikówpozywki:. - - Mikroorganizmy stosowane do wytwarzania an¬ tybiotyku A-4I6I9I6, z którego nastejpnie wyosobnia sie czynniki Bi, B2, B3, Ci«, C3 i Ei mozna hodo¬ wac w srodowisku o stosunkowo dulzym zakresie wartosci pH, ale korzystnie jest utrzymywac war¬ tosc pH okolo 6,5 do 7,0. Jak w przyfeaidku ho¬ dowli innych (mikroorganizmów Actanomycetes, tak i tu wartosc pH srodowiska zmienia sie stopniowo w okresie fermentacji i pod koniec tego okresu wynosi zwykle od okolo 6,5 do 7J5w Przy wytwarzaniu czynników antybiotyku1 A-4J6&B korzystnie jest stosowac wglebna fermentacje aero- bowa. Stosunkowo male ilosci tydh antybiotyków mozna wytwarzac droga hodowli wstrzajsowej w butlach, ale przy wytwarzaniu duzych ilosci ko¬ rzystniej jest prowadzic wgfflejbna fermentacje aero- bowa w wyjalowionych kadziach, w których po¬ zywke hodowlana zaszczepia sie zawiesina fragmen¬ tów grzybni. Wegetatywna szczepionke mikroorganizmu wy¬ twarza sie zaszczepiajac stosunkowo mala ilosc po¬ zywki fragmentami grzybni danego mikroorganiz¬ mu i otrzymana, mloda jeszcze szczepionke wege¬ tatywna przenosi sie aseptycznie do duzej kadzi Szczepionke wegetatywna mozna wytwarzac w ta¬ kiej samej pozywce jaka stosuije sie na duza ska¬ le do wytwarzania czynników antybiotyku A-4&96, ale mozna tez stosowac i inne pozywki.. Szczepy ATOC 31d8l0, ATOC 3fll6fl|2 i ATCCjfUto Actinoplanes moBSpuriensis wytwarzajace czynniki antybiotyku A-4606 rozwijaja sie w temperaturze 20—Atf*C, a najwiejksze ilosci tych czynników sa wytwarzane w temperaturze okolo 3W°C. W toku hodowli wglebnej do srodowiska hodowlanego wdmuchuje isie wyjalowione powietrze w ilosci od okolo 0,1. do okolo 1,0 objetosci na 1 objetosc sro¬ dowiska w * ciagu1 1 minuty, a najkorzystniejszy wzrost mikrorganizmów i najwydatniejsze wytwa¬ rzanie antybiotyku uzyskuje sie wdmuchujac w23 134 19T 21 ciagu 1 minuty co najmniej 11/2. objetosci powie¬ trza na 1 objejtosc srodowiska hodowlanego. Predkosc wytwarzania czynników antybiotyku A-4S96 i nasilenie aktywnosci antybiótycznej sro¬ dowiska hodowlanego mozna sledzic badajac aktyw¬ nosc próbek pobieranych z brzeczki fermentacyjnej w stosunku do organizmów podatnych na dzialanie antybiotyków. Jednym z takich organizmów, który mozna stosowac do tego celu, jest Bacilluis su/btilis. Próbe te mozna prowadzic znanymi metodami ku- bek^fplytka lub metoda kraizka biibuly na plytkach agarowych. Przy prowadzeniu procesu fermentacji metoda wstrzasanych kolb, lulb metoda wglebnej hodowli aerobowej zwykle maksimum wytwarzania antybiotyku wystepuje w cdagu okolo 4—6 dni. Antybiotyk A^4696, z którego nastepnie wyosob¬ nia sie jego czynniki Bi, B2, B3, Cia, C3 i Ei, mozna oddzielac od srodowilska hodowlanego i innych sub¬ stancji ewentualnie obecnych metodami adsorpcji lub ekstrakcji, przy czyim korzystnie stosuje sie adsorpcje, gdyz wówczas unika sie duzych obje¬ tosci rozpuszczalników, niezbednych w procesach ekstrakcji. Poniewaz postepowanie w przypadku szczepu ATGC 316&0 (do wyosobniania czynników B2 i C3 antybiotyku A^4696), szczepu ATOC 3168B (do wy¬ osobniania czynników Bi i Cia antybiotyku A-4606) i szczepu ATOC 31683 (do wyosobniania czynników B3 i Ei antybiotyku A-4696) jest zasadniczo takie samej przeto w celu uproszczenia w przykladach zilustrowano tylko proces w odniesieniu do szczepu ATOC 316J8I2, ale w przykladzie I omówiono tez pewne róznice w postepowaniu w przypadku szcze¬ pu ATOC 3i603 i jego stosowaniu. Przyklad I. A. Fermentacja w kolbach wstrzasanych. 'Fragmenty grzybni szczepu ATOC 3161812 Actino- planes missouriens% (lub szczepu ATOC 3(1680 alibo ATOC 31688) zaszczepia sie w pozywce ze skosu agarowego o podanym skladzie w Tablicy 7. . Tablica 7 Skladnik ] Cerelose 1 Dekstryna ziemnia¬ czana 1 Maka Nutrisoy* I Wyciag z drozdzy l CaCOs ..'... | Agar Zawartosc skladnika 0,5 2,0 1,5 0,25 0,1 - 2,0 ..* Maka Nutrisoy jest produktem firmy Archer Daniels Midland Company, 46166 Faries Parkway, Decatur, Illinois St. Zjedn. Am. Zaszczepiony skos poddaje sie hodowiM w temperaturze 30°C w ciagu 6. dni. Hodowla nie wytwarza zarodników totez nalezy macerowac plat grzyfbni wyjalowiona pipe¬ ta. Zmacerowana dojrzala kulture pokrywa sie warstwa wyjalowionej wody destylowanej i skro¬ bie ostrojznie pipeta lujb wyjalowiona paleczka w celu wytworzenia zawiesiny grzybni. Otrzymana zawiesine stosuje sie do zaszczepienia 100 ml wy¬ jalowionej pozywki wegetatywnej o skladzie po¬ danym w Tablicy 8v TabHca 9 (Skladnik Cerelose 1 Dekstryna ziemnia¬ czana 1 Maka Nutrisoy 1 Wyciag z drozdzy | CaCOs Zawartosc skladnika 0,5 2,0 | W 0,25 j w 1 Zaszczepione srodowisko wegetatywne poddaje sie w temperaturze 2Kf*C w ciagu 48 godzin ho¬ dowli* w obrotowej wstrzajsarce o 2150 obrotach/mi¬ nute, po czyim za pomoca 10 ml otrzymanego za¬ szczepionego srodowiska wegetatywnego zaszczepia sie 100 ml wyjalowionego srodowdska „uderzenio¬ wego" o skladzie podanym w Tablicy 9. Tablica 9 Skladnik Cerelose Drozdze Maka Nutrisoy Skrobia ziemniaczana CaC03 Srodek zapobiegajacy pienieniu sie brzeczki (Sag. 471) Zawartosc skladnika 0,5 | 0,215 | 1,6 2,0 J 0,1 0,05 1 Zaszczepione srodowisko „posrednie" poddaje sie hodowli w temperaturze dCPC w ciagu 24 godzin przy stalym wstrzasaniu w obrotowej wstrzasarce o 250 obrotach/minute, po czym za pomoca 0,4 ml' 40 otrzymanego srodowilska zaszczepia sie 100 ml por¬ cje srodowiska produkcyjnego o skladzie podanym w Tablicy 10, znajdujace sie w kolbach Erlenme- yera o pojemnosci 500 ml i wyjalowione w tem¬ peraturze 121% w ciagiu 30 minut. 45 Tablica 10 t 'Skladnik Cerelose Skrobia kukurydziana Sacharoza Melasa Drozdze Proflo (maka z nasion bawelny) CaC03 K2HP04 MgS04-7H20 Srodek zapobiegajacy pienieniu sie brzeczki (Sag 714) , Zawartosc skladnika 1,0 i3,5 ' 3,0 1,5 1,0 1,0 0,2 0,005 0,025 0,5 0,03124IW 26 (Proces fermentacji watrzajsowej prowadzi siev w ciagu 96 godzin w temjperaturze SOPC w obrotowej wistrzaisarce o CS50 otoróiachi/lminute. Wartosc pH srodowiska pod koniec procesu fermentacji wynosi okolo 8,0. Przy wytwarzaniu! czynników Ba i Ei antybiotyku A-4696 do przygotowania opisanego wyzej srodo¬ wiska „posredniego" stosuje sie szczep ATCC 310S3. Za pomoca 0,4 ml tego srodowiska „posred¬ niego" zaszczepia sie 100 ml porcje srodowiska pro¬ dukcyjnego o skladzie (podanym w tablicy 11, znaj¬ dujace sie w 500 ml kolibach Erlenimeyera i wyja* lowione w temperaturze 1121°C w ciagu 30 minut. T a b 1 i c a 11. Skladnik Cerelose. 1 Drozdze CaCOft K?HPC (NH4WSO4 Srodek zapobiegajacy pienieniu sie brzeczki (Sag 471 Zawartosc .skladnika 1,0 BA 0,05 j 0,0215 | 0,03 1 Proces fermentacji wstrzasowej prowadzi sie w ciagu 96 godzin w temperaturze 3<0ioC w obrotowej wistrzaisarce o 260 Obrotach/minute. Wartosc pH srodowiska pod koniec procesu fermentacji wy¬ nosi okolo 8,0. B. Fermentacja w kadzi o pojemnosci 40 litrów Przygotowanie szczepionki prowadzi sie przez wytwarzanie „posredniego" srodowiska jak opisano wyzej w ustepie A, 2i5 litrów opisanego wyzej sro¬ dowiska produkcyjnego wyjalawia sie pnjez auto- klawowanie w temiperaturze 121°C w ciagu 3)0 mi¬ nut, po czym wlewa do kadzi fermentacyjnej o pojemnosci 40 litrów i zaszczepia 100 ml srodo¬ wiska „posredniego" a nastepnie prowadzi fermen¬ tacje w temperaturze 30°C w ciagu 4 dni, wypro¬ wadzajac wyjalowione powietrze w ilosci 0.6 obje¬ tosci na 1 objetosc kultury w ciagu 1 minuty.Pod¬ czas fermentacji miesza sie stosujac mieszadlo wir¬ nikowe, w celu zapewnienia dobrego mieszania sie powietrza ze srodowiskiem. W miare postejpowania procesu hodowli wartosc pH srodowiska wzrasta stopniowo od okolo 6,5 do okolo 8,0, C. Wyosobnianie antybiotyku A-4696. Do 31800 litrów brzeczki fermentacyjnej przygo¬ towanej w slposób wyzej opisany dodaje sie 5i°/o wagowo-objetosciowych srodka ulatwiajacego fil¬ tracje (Celite 54I5) i przesacza. Osad miesza sie z 3600 litrami zdejonizowanej wody i wartosc pH otrzymanej zawiesiny doprowadza do 10.5 za po¬ moca wodnego roztworu wodorotlenku sodowego, po czym odsacza i przemywa osad woda. Przesacz i popluczyny laczy sie i zakwasza 20P/o (wagowo- -objetosciowo) roztworem wodnym kwasu siarko¬ wego do wartosci ,pH 4,5. Zakwaszony roztwór przesacza sie z dodatkiem l*/o srodka ulatwiajacego filtracje (Celite 545) i 10 15 20 35 40 45 50 55 60 65 klarowny roztwór przepuszcza przez kolumne (54X150 cm) zawierajaca 360 litrów zywicy Am- berlifte IR-1,'16 (postac Na+), przemywajac kolumne 1200 litrami zdejoniizowanej wody. Zywice ERmi'6 usuwa sie z kolumny i eluuje partiami przy war¬ tosci pH 10g5 wodnym roztworem Wodorotfenku sodowego (razem 1000 litrów). Eluat zobojetnia sie do wartosci pH 7 20M (wagowo-objetosciowo) roz¬ tworem wodnym kwasu siarkowego i plucze 3 por¬ cjami zdejonizowanej wody (razem 150 litrów). Po¬ pluczyny zobojetnia sie i laczy z zobojetnionym eluatem, po czym zateza i suszy przez wymrazanie, otrzymujac surowy kompleks antylbiotyku o bar¬ wie od brazowej do ciemnobrazowej. D. Usuwanie soli % surowego antybiotyku A-4696, •1,0 kg surowego kompleksu dodaje sie powoli, silnie mieszajac, do 1,5 litra zdejonizowanej wody i otrzymana zawiesine miesza w ciagu 20 minut, po czym zobojetnia do wartosci pH 7 za pomoca l(P/o roztworu wodnego wodorotlenku amonowego. Nie rozpuszczony kompleks antybiotyku A-4696 od¬ sacza sie przez odsysanie, przemywa woda demo¬ nizowana i suszy przez wymrazanie, otrzytmujac suchy, odsolony kompleks z wydajnoscia okolo 80M wydajnosci teoretycznej w oparciu o bioajc- tywnosc. E. Oczyszczalnie odaoionego antybiotyku A-4606, #00 g wysuszonego, odsolonego kompleksu mie¬ sza sie z 2 litrami zdejonizowanej wody i zakwar sza otrzymana zawiesine do wartosci pH 2,7 przez dodawanie 3n kwasu solnego, po czym odwirowuje w ciagu 40 minut przy 2S0O oibrotach/miniute. Od¬ ciek dekantuje sie i wprowadza na kolumne (iaX85 cm) zawierajaca © litrów odbarwiajacej zywicy (Doulite S761), a nastepnie eluuje suibstancje ak¬ tywna zdejonizowana woda przy predkosci prze¬ plywu 3*0 ml/minute, sledzac przebieg eluowania metoda chromatografia cienkowarstwowej. Odciek zawierajacy antybiotyk A-4696 odparowuje sie .pod cisnieniem 40 hPa w temperaturze 36PC do obje¬ tosci 3 litrów i suszy produkt przez wymrazanie, otrzymujac odbarwiony kompleks w postaci sta¬ lego produktu o barwie od bialej do brazowawej, z wydajnoscia okolo 7flVo wydajnosci teoretycznej w oparciu o bioaktywnosc. F. Wyosobnianie chlorowodorków czynników Bi, B2, B3, Cia, C3 i Ei antybiotyku A-4696* 10 g wysusizonego, odbarwionego kompleksu an¬ tybiotyku A-4I6I96 rozpuszcza sie w 100 ml zdejo¬ nizowanej wody, przesacza otrzymany roztwór i podaje go na chromatograficzna kolumne (5£\10Q cm) zawierajaca 2 litry poliamidu Machery and Nagel SC6. Koluanne eluuje sie zdejonizowana wo¬ da, zbierajac 20OM3OO frakcji po 25 mi. Proces eluowania sledzi sie metoda chromatografii cienko¬ warstwowej, laczy frakcje identyczne i wymraza. Niekiedy trzeba stosowac kolumne o podwójnej dlugosci, to jest 200 cm, laczac 2 pojedyncze ko¬ lumny z poliamidem. Powtarzajac proces chroma- tografowania uzyskuje sie produkt dodatkowo oczyszczony. W przypadku wyosobniania czynników Bi i Cia antybiotyku A-4KJ96 postepuje sie w sposób opisany wyzej w ustepach A-^F stosujac szczep ATCC 31082, zas przy wyosobnianiu czynników B2 i C3134197 27 28 tego antybiotyku stosuje sie odpowiednio szczep ATCC 31680, a przy wyosobnianiu czynników B3 i Ei stosuje sie szczep ATOC 31168®. IW celu wyosobnienia czynników Bi, B2, Bs, Cia i Ei antybiotyku A-4096 w postaci chlorowodor¬ ków przy uzyciu jednego ze szczepów Actinopla¬ nes missouriensiB postepuje sie w ten sposób, ze 200 mg odbarwionego kompleksu antybiotyku A-4096, otrzymanego przy uzyciu szczepu ATCC 31083 w sposób podany w ustepach AME przy¬ kladu I, rozpuszcza sie w okolo 2 ml destylowanej wody, przesacza otrzymany roztwór i chromato- graifuje na kolumnie, stosujac adsorbenty w od¬ wróconej fazie. Na przyklad, jako faze stacjonowa¬ na stosuje sde preparat Li Ghiroprep RP-I18 firmy E. Merck, Darmstadt, RFN, a jako faze ruchoma roztwór wodny acetonitrylu o stopniowo zmienia¬ nej zawartosci obu skladników i zawierajacy fos¬ foran trójetyloaminy. Stezenie wodnego roztworu acetoniitrylu zalezy od sposobu, w jaki prowadzono proces fermentacji, ale korzystnie stosuje sie gradient 10—4z0^/». Prze¬ bieg eluowania sledzi sie metoda okreslania ak¬ tywnosci frakcji w nadfiolecie, laczy frakcje za¬ wierajace pojedyncze czynniki i odparowuje aceto- nlftryl pod silnie obnizonym cisnieniem i pozostale wodne roztwory poddaje wymrazankk Otrzymane produkty rozpuszcza sie ponownie w destylowanej wodzie i chromatografuje stosujac odwrócona faze adsorbentów, eluujac 5(P/o roztworem wodnym me¬ tanolu. Jako adsorbenty stosuje sie np. ladunki preparatu Sep. Pak. C1I&, produkcji firmy Waters Associates Inc., Mlilford, Massachusetts, St. Zj. Am. Przyklad II. Wytwarzanie siarczanów czyn¬ ników Bi, Bj, B», Cu, Ca i Ei antybiotyku A-4096. 900 g antybiotyku A-0090, wytworzonego sposo¬ bem podanym w ustepach Al—D przykladu I, mie¬ sza sie z 2 litrami zdejonizowanej wody i otrzy¬ mana zawiesine zakwasza 3m kwasem siarkowyfm do wartosci pH 2,7. Zakwaszony roztwór odwiro¬ wuje sie w ciagu 40 minut przy 2000 Obrotach/mi¬ nute, zdekantowany odciek wprowadza na kolulmne (&X86 cm) zawierajaca 6 litrów odbarwiajacej zy¬ wicy Doulite SflOl i eJuuje skladnik aktywny zde- jonizowana woda z predkoscia 30 ml/minute. Prze¬ bieg eluowania sledzi sie metoda chromatografii cienkowarstwowej i frakcje zawierajace antybio¬ tyk A~4686 zateza pod cisnieniem 40 hPa w tempe¬ raturze ,36°C do Objetosci 3 litrów i wymraza pro¬ dukt. Otrzymuje sie odbarwiony kompleks w po¬ staci stalego produktu o barwie od bialej do bra¬ zowawej, z wydajnoscia wynoszaca okolo 701% wy¬ dajnosci teoretycznej w stosunku do bioaktywnosci. 25 Poszczególne czynniki Bi, B2, Bs, Cia i Ei anty¬ biotyku A-4096 w postaci siarczanów wyosobnia sie w sposób podany w ustepie F przykladu I. ZaiS t rzezem i/a patentowe 1. Sposób wytwarzania kompleksu antybiotyku A-40916 albo nowych czynników Bi, Bj, Ba, Cu, C8 10 i Ei tego antybiotyku, a takze farmakologicznie dopuszczalnych addycyjnych soli z kwasami, zna¬ mienny tym, ze prowadzi sie hodowle mutantów szczepu Actinoplanes missouriensds ATOC 23342 (ATCC 31680 lub ATCC 31680 lub ATOC 3(1083) 15 na drodze wglebnej fermentacji aerobowej na po¬ zywce zawierajacej zródlo przyswajalnego wegla, azotu i nieorganicznych soli^ az do uzyskania pro¬ duktu o duzej aktywnosci antyfbiotycznej, po czym ewentualnie otrzymany produkt rozdziela sie na 20 czynniki aktywne i ewentualnie prowadzi sie prze¬ miane produktu w jego farmakologicznie dopusz¬ czalna addycyjna sol z kwasem.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania czynnika Bi prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes miissouriensis ATOC 3(16812 lub ATOC 3168& i z uzyskanego kom- plekisu wyodrejbnia sie zadany czynnik.

3. Sposób wedlug zastrz. 1,, znamienny tym, ze M w przypadku wytwarzania czynnika Bj prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATCC 3108:0 lub ATOC 3(10813 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 w przypadku wytwarzania czynnika B3 prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATOC 310&i3 i z uzyskanego kompleksu wyodrejbnia sie zadany czynnik. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 40 w przypadku wytwarzania czynnika Cu prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes . miissouriensis ATCC 310812 lub ATOC 3110813 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 45 w przypadku wytwarzania czynnika Cj prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATOC 3(1080 lub ATCC 31088 i z uzyskanego kom¬ pleksu wyodrebnia sie zadany czynnik. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 50 w przypadku wytwarzania czynnika Ei prowadzi sie hodowle szczepu Actinoplanes missouriensis ATOC 31083 i z uzyskanego kompleksu wyodreb¬ nia sie zadany czynnik.134197 (L-rystoza- mina) C I NH Ct NH c NH 0= Wzór Dtugosc fali (jjm) 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 250 Liczba falowa ICM"' FIG. I ""£ 2.5 •^ 100 o 80 8" 3 40 ° 20 !~^\ 3 f—*- *- 4 5 —, i , i ,.,— Dtugosc fali (jjm) 6 7 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 \A[y^^J^^^^\ \r V y \ 1 » * » « « . « * i 4000 3500 3000 2500 2000 1600 1600 1400 1200 1000 800 600 (CM"1) 400 250 Liczba falowa FIG. 2134 197 Dtugosc fali (jjm) 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 " ' r 1 Ul 1 I | , , , ! t = 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 Liczba falowa ,CM"1} FIG. 3 800 600 400 250 Dtugosc fali (pm) 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 250 {CM"1) Liczba falowa FIG.

4. Dtugosc fali (jjm) 8 9 10 12 14 1618 20 25 30 40 4000 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 250 Liczba falowa m'}) fig. 5134 197 40 h 0 4000 Dlugosc fali (jjm) 4 5 6 7 8 9 10 12 W 1f» 18 20 25 30 40 3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 2l0 Liczba falowa «*r1 FIG. 6 PL PL PL PL