CS228909B2 - Method of preparing antibioticum a-4696 in complex form, or in the form of factor b1,b2,b3,c1a,c3 and e1 - Google Patents

Description

POPIS VYNÁLEZU

K PATENTU

6RBKOSLOVBMSKA SOCIALISTICKÁ

REPUBLIKA (19) 228909 (11) (B2)

(22) Přihlášeno 17 12 81 (21) (PV 9462-81) (32) (31) (33) Právo přednosti od 18 12 80(217962) Spojené státy americké (51) Int, Cl.3C 12 P 17/08 C 12 P 21/04//C 12 R 1/045 (40) Zveřejněno 15 09 83(45) Vydáno 15 08 86

ORAD PRO VYNÁLEZYA OBJEVY (72)

Autor vynálezu DEBONO MANUEL, INDIANAPOLIS, MERKEL KURT EDGAR, MOORESVILLE, WEEKS ROBERT EDGAR, INDIANAPOLIS, COLE HERALDJAMES, INDIANAPOLIS, INDIANA (Sp. st. a.) (73)

Majitel patentu ELI LILLY AND COMPANY, INDIANAPOLIS, INDIANA (Sp. st. a.) (54) Způsob výroby antibiotika A-4696 ve formě komplexu nebo faktorůBt, Ba, Bj, Cla, Cí a El 1

Vynález se týká způsobu výroby antibioti-ka A-4696 faktorů Bi, Bs, Bs, Cja, C3 a El.Jde o účinné antibakteriální a antimikro-biální látky, které rovněž podporují růstdrůbeže, vepřů, ovcí a skotu.

Vynález navazuje na US patent číslo3 952 095 z 20. dubna 1976. Tento patent po-pisuje nové antibiotikum a způsob jeho vý-roby. V US patentu č. 4 064 233 z 20. pro-since 1977 se popisuje antibiotikum A-4696a v US patentu č. 4 115 552 z 19. září 1978se popisují faktory A a B antibiotika A-4696.

Faktor B antibiotika A-4696, popsaný vesvrchu uvedených patentech není totožný sfaktory, jejichž výroba je předmětem vyná-lezu. Mimoto faktory, které jsou předmětemvynálezu nebyly dosud známé a jejich exis-tenci nebylo možno předpokládat. Ve svr-chu uvedených patentových spisech se na-opak uvádí, že jakékoli další faktory neboskvrny, objevující se na chromatogramechjsou pouze artefakty chromatografie a ne-mají žádný význam.

Nyní bylo zjištěno, že nové faktory anti-biotika actaplaninu A-4696, a to faktory Bi,B2, B3, Cia, C3 a Ei jsou účinnými antibak-teriálními a antimikrobiálními látkami. Tytoíaktory současné zrychlují růst a zvyšují vy-užití krmivá u drůbeže, vepřů, ovcí a skotu. Předmětem vynálezu je způsob výroby an- 228909 2 tibiotika A-4696 ve formě komplexu včetněfaktorů Bi, B2, B3, Cía, Cs nebo Ei, vyznaču-jící se tím, že se pěstuje Actionoplanes mis-souriensis kmen ATCC 31 680, ATCC 31 682nebo ATCC 31 683 v živném prostředí s ob-sahem využitelných zdrojů uhlíku, dusíkua anorganických solí v submerzní kultuřeza aerobních podmínek při pH 6,5 až 7,5 apři teplotě 20 až 40 °C do nahromadění an-tibiotika, načež se antibiotikum A-4696 veformě komplexu z živného prostředí izolujea popřípadě se z komplexu izolují faktoryBi, B2, B3, Cia, C3 nebo Ei.

Antibiotikum A-4696, faktory Bt, B3, Cia,C3 a Ei je možno izolovat z komplexu anti-biotika A-4696, který se získá pěstovánímmikroorganismu Actinoplanes missouriensisATCC 31 680, ATCC 31 682 nebo ATCC 31 683v živném prostředí, které obsahuje využitel-né zdroje uhlíku, dusíku a anorganickýchselí v submerzní kultuře za aerobních pod-mínek do nahromadění dostatečného množ-ství antibiotika.

Použití svrchu uvedených faktorů je mož-no zvýšit využití krmivá u přežvýkavců tak,že se těmto živočichům podá takové množ-ství komplexu A-4696 nebo faktoru Bi, B2, B3,Cia, C3 a/nebo Ei, nebo některé z adičníchsolí těchto látek s kyselinami, přijatelnýmiz farmaceutického hlediska, které podporu- 228909 3 je růst těchto zvířat, a to jako krmivo, pří-davná směs nebo přídavné krmivo.

Obdobným způsobem je také možno u-rychlit růst kuřat tak, že se kuřatům podáv krmivu nebo v pitné vodě příslušné množ-ství antibiotika A-4696 ve formě komplexunebo- ve formě některého z nových faktorůBi, B2, B3, Cia, C3 a/nebo Ei, nebo některáze solí těchto látek, přijatelných z farma-ceutického hlediska.

Vynález se tedy týká způsobu výroby no-vých faktorů Βι, B2, B3, Cla, C3 a Ei actapla-ninového- antibiotika A-4696. Tyto faktory sepři provádění způsobu podle vynálezu izo-lují z uvedeného antibiotika, které se získá-vá pěstováním mikroorganismu z rodu Acti-noplanes v živném prostředí tak dlouho, ažse nahromadí v živném prostředí dostateč-né množství antibiotika.

Vysokotlakou kapalinovou chromatografiíje možno prokázat, že antibiotikum A-4696obsahuje několik až dosud neznámých fak-torů, které je možno označit jako Βι, B2, B3,Cia a C3. Mimoto je možno izolovat ještě fak-tor Ei, který je z komplexu rovněž možnoizolovat, který však může být produktemrozkladu. Chemické, fyzikální a biologickévlastnosti jednotlivých faktorů ukazují, žeběží o nová antibiotika a možná s výjimkoufaktoru Ei jsou složeny z téhož peptidovéhojádra (aglykonuj a aminocukru, a mimotoz různých množství glukózy, mannózy arhamnózy. Faktor Ei je podobný ostatnímfaktorům, je však možné, že obsahuje poně-kud modifikované peptidové jádro. Bioauto-grafie tvorby aglykonu v průběhu hydrolý-zy komplexu antibiotika a jednotlivých fak-torů ukazuje, že v průběhu krátké dobyvznikne jednoduchá směs antimikrobiálněúčinného- pseudoaglykonu a aglykonu. Jemožné, že antimikrobiální účinnost komple-xu i jednotlivých faktorů spočívá v pseudo-aglykonu peptidové povahy, přičemž jed-notlivé faktory je od sebe možno odlišit roz-díly ve složení neutrálního cukru. Tyto- cuk-ry mohou ovlivňovat pouze rozpustnost adalší důležité farmakodynamické vlastnos-ti. Způsob účinku však netvoří součást vy-nálezu a není tedy možno definitivně uzavřít,v čem účinek jednotlivých faktorů spočívá.

Faktory, jejichž výroba tvoří předmět vy-nálezu se izolují z antibiotika A-4696, kterése získá pěstováním mikroorganismu Acti-noplanes missouriensis ve vodném živnémprostředí v- submerzní kultuře za aerobníchpodmínek. Nejprve se oddělí komplex z fer-mentačního prostředí a pak se izolují jed-notlivé faktory kapalinovou chromatografií.S výhodou se postupuje tak, že se jednotli-vé faktory převádějí na hydrochloridy nebona sírany.

Pod pojmem „antibiotikum A-4696“ se ro-zumí komplex antibiotik actaplaninového ty-pu, kdežto různé faktory, izolované z kom-plexu se označují jako antibiotikum A-4696 ,ρνρ- faktor A, Βι, B2, B3, Cia, C3, Ei a tak dále.Antibiotikum i jeho jednotlivé faktory jsouvysoce účinné látky, které brání růstu mi-kroorganismu, pathogenních pro člověka iživočicha. Kromě toho mají uvedená antibio-tika význam v zemědělství, jako růstové lát-ky pro kuřata, vepře, ovce a skot.

Nové faktory Βι, B2, B3, Cia, C3 a Ei anti- *biotika A-4696 jsou zásadité látky, které mo-hou tvořit soli s vhodnými kyselinami a jemožno je izolovat z komplexu, který se zís-ká pěstováním mikroorganismu z čeledi Ac-tinoplanes missouriensis v živném prostředído nahromadění antibiotika. Dále uvedenévlastnosti jednotlivých faktorů se týkají hyd-rochloridů, přestože je možno známým způ-sobem připravit i jakékoli jiné z farmaceu-tického hlediska přijatelné soli těchto fak-torů.

Chromatografií na tenké vrstvě silikage-lu, vysokotlakou kapalinovou chromatografiía dalšími metodami je možno prokázat, žeantibiotikum A-4696 při dělení poskytujesměs různých složek, které rovněž mají an-tibiotickou účinnost. Tyto složky je možnochromatograficky oddělit od původního an-tibiotického komplexu chromatografií nasloupci polyamidu. Chromatografické frak-ce se odebírají podle spektra v ultrafialovémsvětle a podle výsledků chromatografie natenké vrstvě a frakce, které obsahují čistéfaktory A, Βι, B2, B3, Cia, C3 nebo Ei se slijía lyofilizují. Totožnost a čistota výslednýchlyofilizovaných chromatografických frakcíse stanoví vysokotlakou kapalinovou chro-matografií.

Antibiotikum A-4696 faktor A již byl izolo-ván a je popsán v US patentu č. 4 115 552. Údaje, týkající se tohoto faktoru, jsou uve-deny pouze k usnadnění popisu dělení apopisu vlastností dalších nových faktorů, je-jichž výroba tvoří předmět vynálezu.

Chromatografie antibiotika A-4696 při po-užití směsi methanolu, chloroformu, kon-centrovaného hydroxidu amonného, sek.bu-tanolu a vody v poměru 50 : 25 : 25 : 25 :10a Bacillus subtilis jako detekčního organis-mu poskytuje výsledky, uvedené v následu-jící tabulce. A-4696 faktor Rf A 0,25 Bi 0,35 b2 0,45 b3 0,40 Cla 0,51 Při vysokotlaké kapalinové chromatogra-fii antibiotika při teplotě místnosti, při po-užití směsi 2% vodného roztoku kyselinyoctové a methylkyanidu v poměru 90 : 10 a2% vodného roztoku kyseliny octové a me-thylkyanidu v poměru 70 : 30 se získají ná-sledující výsledky: 5 228909 A-4696 faktor K‘ A 1,60

Bi 1,99 B2 3,84 B3 2,50

Cia 2,92 C3 4,23

Ei 0,38 Různé další faktory je možno v menšímmnožství oddělit od antibiotika chromato-grafií na tenké vrstvě a vysokotlakou kapa-linovou chromatografií. Tyto faktory je mož-no označit jako Clb, C2a, C2b a D a jsou v(L-ristosamin— j — mnoha směrech podobné ostatním svrchu u-vedeným faktorům. Mimoto nelze vyloučit,že by bylo možno získat ještě další nezjiště-né faktory. Tyto faktory ještě nebyly izolo-vány a čištěny v takovém množství, aby by-lo možno stanovit jejich vlastnosti. V případě, že se antibiotikum A-4696 nebojeho jednotlivé faktory hydrolyzují v mírněkyselém prostředí, například v 5% metha-nolovém roztoku kyseliny chlorovodíkovépři teplotě varu pod zpětným chladičem 70minut, získá se pseudoaglykon. Tuto látkuje možno vysrážet a v případě faktorů A, Bi,B2, B3, Cia a C3 má následující strukturu:

OH

V případě antibiotika A-4696 faktoru Eije možné, že tento aglykon je poněkud mo-difikován, tato skutečnost však dosud neby-la prokázána.

Chromatografií na papíře a na tenké vrst-vě bylo možno prokázat, že po hydrolýzekomplexu a jednotlivých faktorů obsahujítyto látky kromě pseudoaglykonu ještě růz-ná množství neutrálních cukrů. Totožnost amolární poměry těchto neutrálních cukrůjsou uvedeny v následující tabulce 1: TABULKA 1

Molární poměry neutrálních cukrů* A-4696 Mannóza Glukóza Rhamnózafaktor * Cukry byly stanoveny plynovou chroma-tografií ve formě trimethylsililových de-rivátů. Každý cukr je uveden jako souhrnisomerů a a β.

Jednotlivá antibiotika svrchu uvedenéhotypu je tedy možno od sebe odlišit, složenímneutrálního cukru, který je vázán na pseu-doaglykon v poloze, která dosud nebyla ur-čena.

Antibiotikum A-4696, faktor Bi ve forměhydrochloridu je bílá krystalická látka, kte-rá je rozpustná ve vodě a v polárních roz-pouštědlech, včetně těch, které obsahujíhydroxylovou skupinu a nerozpustná v ně-kterých dalších rozpouštědlech, napříkladetheru, chloroformu, benzenu, acetonu, ali-fatických uhlovodících, chlorovaných uhlo-vodících a podobně. Je stálá ve vodném roz-toku při pH 4 až 9 při teplotě až 27 °C. Při mikroanalýze antibiotika A-4696 fak- toru Bi ve formě hydrochloridu je možno prokázat následující složení, přičemž kyslík tvoří zbytek: C 51,51, H 5,25, N 4,88, Cl 4,62. A 2,80 1,0 Bi 2,05 1,0 b2 1,80 1,0 Bs 2,37 1,0 Cla 1,12 1,0 1,08 228909 Přibližná molekulová hmotnost, teoretickystanovená součtem molekulové hmotnostipseudoaglykonu a cukru je 1954.

Absorpční spektrum v ultrafialovém svět-le pro faktor Bi ve formě hydrochloridu vevodě je při 280 nm při E = 42,8.

Absorpční spektrum faktoru Bi ve forměhydrochloridu v infračerveném světle v bro-midu draselném je znázorněno na obr. 1. Jezřejmé, že absorpční maxima v rozsahu 4000až 700 cm-1 se nacházejí při hodnotách: 3380široký, 2930, 1731, 1Θ93, 1654, 1637, 1615,1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289,1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030,1012, 982, 880, 842, 831, 810 cm-1.

Antibiotikum A-4696 faktor B2 ve forměhydrochloridu je bílá krystalická látka, roz-pustná ve vodě, v rozpouštědlech s obsahemhydroxylových skupin a polárních rozpouš-tědel a nerozpustná v některých dalších roz-pouštědlech, například etheru, chloroformu,benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících,chlorovaných uhlovodících a podobně. Jestálá ve vodném roztoku při pH 4 až 9 přiteplotě až 27 °C. Při mikroanalýze antibiotika A-4696 fakto-ru B2 ve formě hydrochloridu bylo stanove-noi následující přibližné složení, přičemžzbytek tvoří kyslík: C 51,96, H 4,67, N 5,72,Cl 5,88. Přibližná molekulová hmotnost, sta-novená teoreticky součtem molekulové hmot-nosti pseudoglykonu a známého cukru je1808.

Absorpční maximum v ultrafialovém svět-le pro antibiotikum A-4696 faktor B2 ve for-mě hydrochloridu ve vodě je při 280 nmpři E J ™ = 44,7.

Spektrum v infračerveném světle pro fak-tor B2 ve formě hydrochloridu v bromidudraselném je znázorněno na obr. 2. Pozoro-vaná absorpční maxima v oblasti 4000 až700 cm-1 jsou při: 3409 široké, 2934, 1730,1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426,1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017,987, 903, 884, 818 cm“1.

Antibiotikum A-4696 faktor B3 ve forměhydrochloridu je bílá krystalická látka, roz-pustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahemhydroxylové skupiny a polárních rozpouš-tědlech a nerozpustná v rozpouštědlech jakojsou ether, chloroform, benzen, aceton, ali-fatické uhlovodíky, chlorované uhlovodíkya podobně. Je stálý ve vodných roztocíchpři pH 4 až 9 při teplotě až 27 CC.

Mikroanalýzou faktoru B3 ve formě hyd-rochloridu je možno prokázat následujícípřibližné složení, přičemž kyslík tvoří zby-tek: C 51,84, H 4,74, N 5,83, Cl 5,57. Přibliž-ná molekulová hmotnost, stanovená teore-ticky součtem molekulových hmotností pseu-doaglykonu a známých cukrů je 1808.

Absorpční maximum faktoru B3 ve forměhydrochloridu ve vodě v ultrafialovém svět-le je při 280 nm při E = 46,3.

Spektrum faktoru B3 ve formě hydrochlo-ridu v bromidu draselném v infračerveném světle je znázorněno na obr. 3. Pozorovatel-ná absorpční maxima v oblasti 4000 až 700cm-1 se nacházejí při: 3394 široké, 2938,1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515,1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209,1180,1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846,816 cm-1.

Antibiotikum A-4696 faktor Cia ve forměhydrochloridu je bílá krystalická látka, roz-pustná ve vodě, v rozpouštědlech s obsahemhydroxylových skupin a polárních rozpouš-tědlech a nerozpustná v rozpouštědlech, ja-ko je ether, chloroform, benzen, aceton, ali-fatické uhlovodíky, chlorované uhlovodíkya podobně. Je stálé ve vodných roztocích připH 4 až 9 při teplotách až 27 °C. Při mikroanalýze antibiotika A-4696 fak-tor Cia ve formě hydrochloridu bylo možnoprokázat následující složení, přičemž kyslíktvoří zbytek: C 53,05, H 4,74, N 5,83, Cl 5,39.Přibližná molekulová hmotnost, stanovenáteoreticky součtem molekulových hmotnos-tí pseudoaglykonu a známého cukru je 1792.

Absorpční maximum v ultrafialovém svět-le pro faktor Cla ve formě hydrochloridu vevodě je při 279 nm při E = 47,9.

Absorpční spektrum v infračerveném svět-le pro faktor Cia ve formě hydrochloridu vbromidu draselném je znázorněn na obr. 4.Absorpční maxima v oblasti 4000 až 700cm-1 jsou při: 3380 široké, 2931, 1734, 1650,1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290,1228,1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987,903, 832, 814, 715 cm-1.

Antibiotikum A-4696 faktor C3 ve forměhydrochloridu je bílá krystalická sloučeni-na, rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s ob-sahem hydroxylové skupiny a polárních roz-pouštědel a nerozpustná v rozpouštědlech,jako jsou ether, chloroform, benzen, aceton,alifatické uhlovodíky, chlorované uhlovodí-ky a podobně. Je stálá ve vodném roztokupři pH 4 až 9 při teplotě až 27 °C.

Mikroanalýza antibiotika A-4696 faktoruC3 ve formě hydrochloridu prokázala násle-dující přibližné složení, přičemž kyslík tvo-ří zbytek: C 51,73, H 4,69, N 5,94, Cl 6,02.

Absorpční spektrum v ultrafialovém svět-le antibiotika A-4696 faktoru C3 ve forměhydrochloridu ve vodě má maximum při280 nm při E j ™ = 47,9.

Absorpční spektrum antibiotika A-4696faktoru C3 ve formě hydrochloridu v infra-červeném světle v bromidu draselném jeznázorněno na obr. 5. Je zřejmé, že obsahu-je absorpční maxima v oblasti 4000 až 700cnr1 při: 3378 široké, 2925, 1728, 1689, 1658,1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536,1529,1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421,1397,1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062,1028,1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769, 708cm-1.

Antibiotikum A-4696 faktor Ei ve formě hydrochloridu je bílá krystalická sloučeni- na, rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s ob- 229909 10 sáhem hydroxylové skupiny a polárních roz-pouštědel a nerozpustná v rozpouštědlech,jako jsou ether, chloroform, benzen, aceton,alifatické uhlovodíky, chlorované uhlovodíkky a, podobně. Je stálá ve vodném roztoku.při.pH 4 až 9 při teplotě až 27 °C.

Mikroanalýza antibiotika A-4696 faktoruEi ve formě hydrochloridu prokázala násle-dující přibližné složení, přičemž kyslík tvo-ří zbytek: C 50,71, H 4,70, N 9,01, Cl 1,84.

Absorpční spektrum v ultrafialovém svět?le antibiotika A-4696 faktoru, Ei ve forměhydrochloridu ve vodě má maximum při;279. nm při E 39,9.

Absorpční spektrum antibiotika A-4696>faktoru Ei ve formě hydrochloridu v infrívčerveném světle v bromidu draselném jeznázorněno na obři 6. Pozorovaná absorpční;maxima se nacházejí v oblasti 4000 až 700cm'1 při: 3394 široké, 2933, 1657, 1636, 1610,1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369,1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075,1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813,770, 752, 738, 714 cm'1.

Antibiotická účinnost antibiotika A-4696faktorů Bi, B2, B3, Cla, G3 nebo, Ei ve formě'hydrochloridu je v podstatě stejná jako ú-činnost, která' byla: prokázána pro celé an-tibiotikum A-4696 podle US patentu číslo4 115'552 proti Bacillus subtilis.

Soli antibiotika A-4696, faktorů Bi, B2, B3,Ciat C3 a El, přijatelné s farmaceutického hlediska je možno připravit8 s5 anorganický-mi kyselinami, například s kyselinou chlo-rovodíkovou, bromovodíkovou, sulfonovou,fosforečnou a podobně. Soli antibiotika stěmito kyselinami je možno získat napříkladtak, že se okyselí roztok volného antibioti-ka příslušnou kyselinou a pak se sůl vysrá-ží přiváděním acetonu do roztoku. Soli jemožno připravit v některých případech ta-ké výměnou iontů při použití sloupce s ná-plní iontoměniče. Stejným způsobem je takémožno použít jiné metody pro výrobu solí.Všechny tyto metody jsou v oboru známy.

Nové faktory antibiotika A-4696 inhibujírůst řady mikroorganismů, které jsou patho-genní pro člověka, živočichy a rostliny, aje tedy možno jich k tomuto účelu použít,V následujících tabulkách 1 a 2 jsou uvede-na množství, při nichž antibiotikum A-4696faktory Bi, B2, B3, Cla, C3 a;Ei působíňnhibi-ci uvedených mikroorganismů. Stanovení by-lo prováděno ředěním na: agaru; a je vy-jádřeno jako minimální inhibiční koncentra-ce (MIC) v mikrogramecb/ml. Při uvedeném testu se zkoumaný organis-mus naočkuje na agarové plotny s obsahemdaného faktoru A-4696 ve formě hydrochlo-ridu v určité koncentraci: Po; inkubaci 48hodin při 37 °C se stanoví MIC podle plotnys nejnižší koncentrací antibiotika s inhibicírůstu. TABULKA 1

Minimální inhibiční koncentraceOrganismus (Bacteria)

Staphylococcus epi Hitchens1’

Staphyloccccus epi Dutt.

Staphylococcus epi Bennet

Staphylococcus aureus 4283-

Staphylococcus aureus 3055

Staphylococcus aureus 3132

Staphylococcus aureus H25

Staphylococcus aureus 3134

Staphylococcus aureus 3123

Staphylococcus aureus H5358

Staphylococcus aureus 3131

Streptccoccus skupina D 282

Streptococcus skupina D 238·

Stteptococcus skupina D SS992

Streptococcus skupina D 9901

Streptococcus skupina D 9913

Streptococcus skupina D 9933

Streptococcus skupina D Guze

Streptococcus skupina D 12753F

Streptococcus viridans 99432)

Streptoccccus viridans 9961

Streptococcus pyogenes C203

Streptococcus pyogenes DS663—72Streptococcus pyogenes DS664—72Streptococcus pneumoniae Park IStreptococcus pneumoniae Týp 14Staphylococcus aureus 3074Streptococcus faecalis X66 Zřeďovací metoda na agaru

Bt Actaplanin.faktor (/íg/ml) c,a Bz Bs, 32 8: 2P 2 0,25 0,25' o;o6 0J13 16 4 2· 1' 16 4 1 1 4 2 1 1' 16 4 2 2- 4 Ž 2 T 8 4 2 2! 8 4 1 2' 8 4 2·' 2- 8 4 2? 1 2 2' 0,5 0,5 2 2 0,5 0,5 2 1 0,5 0,5 2 2 0,5 0,5 2 2 0,5. 0,5 2 2 0,5' 0,5 2 1 0,5 0,5 2 2 0,5 0,5 0,5 1 0,25 0,5 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5' 0,5 0,5 0,5 0,57 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 32 8 4 8: 1 1 <0,5 2

Organismus (Bacteria) Actaplanin faktor ((Ug/ml) 228909

Bi Ba b3 Cla Próteus morganii PR15 >128 >128 >128 >128 Salmonella typhosa SA12 >128 >128 >128 >128 Klebsiella pmeumoniae KL14 >128 >128 >128 >128 Enterobacter aerogenes EB17 >128 >128 >128 >128 Serratia marcescens SE3 >128 >128 >128 >128 Escherichia coli EC14 >128 >128 >128 >128 Citrobacter freundii CF17 >128 >128 >128 >128 Pseudomonas aeruginosa X239 >128 >128 >128 >128 Bordetella bronchiseptica 16 >128 >128 >128 >128 Salmonella typhimurium >128 >128 >128 >128 Pseudomonas solanacearum X185 >128 >128 >128 >128 Erwinia amylovora 64 128 128 128 Candida tropicalis A17 >128 >128 >128 >128 Trichophytoín mentacrophytes 27 >128 >128 >128 >128 Aspergillus flavus E >128 >128 >128 >128 Ceratocystis ulmi >128 >128 >128 >128 υ ΜΗ agar 1 : 5002) MH agar 1 : 10 5% králičí krev TABULKA 2

Minimální inhibičmí koncentrace — Zřeďovací metoda na agaru

Organismus (Bacteria) Actaplanin faktor ((Ug/mlJ C3 Ei

Staphylococcus aureus XI.1 2 16 Staphylococcus aureus V41 1 16 Staphylococcus aureus X400 2 16 Staphylococcus aureus S13E 2 16 Staphylococcus epidermidis 1 2 32 Staphylococcus epidermidis 2 1 16 Streptococcus skupina A C203 0,5 1 Streptococcus skupina D X66 1 4 Streptococcus skupina D 9960 2 8 Streptococcus pneumoniae park. 0,5 2 Haemophilus influenzae sens. C. L. 32 >128 Haemophilus influenzae res. 76 64 >128 Shigella sonnei N9 >128 >128 E. coli N10 >128 >128 E. coli EC14 >128 >128 E. coli TEM 128 >128 Klebsiella X26 >128 >128 Klebsiella KAE >128 >128 Enterobacter aerogenes X68 >128 >128 Enterobacter aerogenes C32 >128 >128 Enterobacter aerogenes EB17 >128 >128 Enterobacter cloacae EB5 >128 >128 Enterobacter cloacae 265A >128 >128 Salmonella typhosa X514 >128 >128 Salmonella typhosa 1335 >128 >128 Pseudomonas aeruginosa X528 >128 >128 Pseudomonas aeruginosa X239 >128 >128 Pseudomonas aeruginosa Psl8 >128 >128 Serratia marcescens X99 >128 >128 Serratia marcescens SE3 >128 >128 Próteus morganii PR15 >128 >128 Próteus inconstans PR33 >128 >128 Próteus rettgeri PR7 >128 >128 Próteus rettgeri C24 >128 >128 Citrobacter freundii CF17 >128 >128 Bordetella fronchiseptica 16 >128 >128 Clostridium difficile 2994 1 1 228909 11 Organismus (Bacteria) 12 Actaplanin faktor (^g/ml) Cj El Clostridium perfringens 81 1 1 Clostridium septicus 1128 1 1 Eubacterium aerofaciens 1235 1 1 Peptococcus asaccharolyticus 1302 0.5 1 Peptococcus prevoti 1281 128 128 Peptostroptococcus anaerobius 1428 >128 >128 Peptostreptococcus intermedius 1264 2 4 Propionihacterium acnes 79 1 1 Bacteroides frogilis 111 128 >128 Bactcroides fragilis 1877 128 > 12.8 Bacteroides fragilis 1936B 64 128 Bacteroides thetaiotaomicron 1438 64 >128 Bacteroides melaninogenicus 1856/28 >128 >128 Bacteroides melaninogenicus 2736 128 >128 Bacteroides vulgaris 1211 128 >128 Bacteroides corrodens 1874 128 >128 Fusobacterium symbiosum 1470 32 128 Fusobacterium necrophoruin 6054A 128 >128

Antibiotikum A-4696, faktory B i, B?, B3,C.a, C3 a Ei ve formě hydrochloridů jsouúčinné antibakteriální a antimikrobiálníprostředky, které je možno užít k inhibicirůstu patogenních mikroorganismů. Mimotoje možno způsobit inhibici růstu těchto mik-roorganismů i tak, že se antibiotikum A--4696,, faktory Βι, B2, Bs, Cla, C3 a Ei nebojejich adiční soli s kyselinami včlení dopasty na zuby, zubního prášku nebo gelunebo ústní vody nebo jiného prostředku proústní hygienu, čímž je možno účinně bránitvzniku a vývoji zubního kazu a vzniku pa-radentózy, která rovněž souvisí s růstembakterií. Je také možno postupovat tak, žese nanese roztok jednoho nebo většího po-čtu faktorů antibiotika A-4696 nebo jehoadiční soli s kyselinou v příslušné koncen-traci na povrch dásní a zubů jakýmkoli ji-ným vhodným způsobem.

Antibiotikum A-4696, faktory Βι, B2, B3,Ci„, C3 a Ei rovněž ovlivňují rychlost růstuv tom smyslu, že urychlují růst a zvyšují vy-užití krmivá u drůbeže, vepřů, ovcí a skotu.Například při denním podávání u drůbežea vepřů v množství 0,5 až 25 mg/kg tělesnéhmotnosti je možno dosáhnout rychlejšíhorůstu a lepšího využití krmivá než v pří-padě zvířat, která jsou krmena stejným kr-mivém bez obsahu účinné látky. Pod pojmem„krmivo“ se rozumí celkový příjem živinu daného zvířete, to jest běžného krmivá,koncentrátů, doplňkových krmiv, anorga-nických solí, vitamínů i směsi s obsahem lé-čivých látek, objemného krmivá a dalšíchsložek krmné dávky zvířete. Typické zá-kladní dávky pro drůbež a vepře jsou uve-deny v US patentu č. 4 115 552. Výhodně se postupuje tak, že se antibio-tikum A-4696, faktory Βι, B2, B3, Cia, C3 a Einebo vhodné deriváty těchto faktorů nebojejich směsi podávají perorálně ve vhodnémkrmivu v množství 2 až 200 g na tunu kr-mivá, čímž je možno dosáhnout lepšího vy- užití krmivá a rychlejšího růstu. Přidánímúčinných faktorů antibiotika A-4696 do kr-mivá se s výhodou provádí tak, že se nejpr-ve připraví vhodná předběžná směs, napří-klad způsobem podle US patentu č. 4 115 552s obsahem 1 až 200 g antibiotika A-4696,faktorů Bi, Ba, B3, Cla, C3 nebo Et nebo vhod-ného derivátu nebo směsi těchto faktorů v1 kg předběžné směsi. Tato směs se pakvmísí do výsledného krmivá. Je také možnopostupovat tak, že se účinná látka vmísí doběžného krmivá ve formě koncentrátu nebodoplňkového krmivá s obsahem této látky.

Je tedy zřejmé, žs nové antibiotikumA-4696, faktory Βι, B>, B3, Ci3, C3 nebo Elje možno užít několika různými způsoby,zvláště vhodné je však jejich použití jakoantibiotika. Látky s tímto typem účinnostijsou velmi cenným přínosem vzhledem ksoučasným problémům zdravotnictví.

Nové faktory antibiotika A-4696 je možnoizolovat z původního antibiotika, které sezískává pěstováním některého kmene Acti-noplanes za aerobních podmínek ve vhod-ném živném prostředí do nahromadění anti-biotika v živném prostředí. Jednotlivé fa-ktory je možno izolovat různými způsobyizolace a čištění.

Mikroorganismus, který produkuje anti-biotikum A-4696, byl identifikován jakokmen Actinoplanes missouriensis z čelediActinoplanaseae. Jde o čeleď mikroorganis-mů z řádu Actinomycetales, která byla po-prvé popsána v publikaci Dr. John N. Couch,Jour. Elisha Mitchell Sci Soc., 65, 315 až318 (1949) a 66, 87 až 92 (1950), Trans.New York Acad. Sci., 16, 315 až 318 (1954),Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 65, 315 aža 269 (19551, Bergey’s Manual of Determi-native Bacteriology, 7. vydání 825 až 829(1957J a Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79,53 až 70 (1963J.

Biologicky čisté kultury kmenů Actinopla- 228909 13 14 nes missouriensis, vhodné pro produkci an-tibiotika A-4696 a pro následnou izolaci je-ho faktorů Bi, B21, B3, Cla, C3 a Et byly ulo-ženy do veřejné sbírky kultur American Ty-pe Culture Collection, Rockville, Maryland,odkud je možno je získat bez omezení podčísly ATCC 31 680, ATCC 31 682 a ATCC31 683. Kmen ATCC 31 682 je vhodný provýrobu antibiotika A-4696 s následnou izo-lací faktorů Bi a Cia. Kmen ATCC 31 680 jevhodný pro izolaci antibiotika A-4696, fak-torů B2 a C3 a kmen ATCC 31 683 je vhodnýpro izolaci antibiotika A-4696, faktorů B3a Ei.

Actinoplanes missouriensis, kmeny ATCC31680, ATCC 31 682 a ATCC 31 683 budouv následujících odstavcích popsány podlesvých fyzikálních vlastností a podle pěsto-vání v kulturách.

Uvedené tři kmeny byly odvozeny řadoumutací z kmene ATCC 23 342, který je po-drobně popsán v US patentu č. 4 115 552.Tyto- kmeny produkují podobné mycelium ajejich morfologie je téměř k nerozeznání odmorfologie původního kmene. Není možnopozorovat mycelium na vzduchu, sekundár-ní mycelium ani sporangia a žádným způ-sobem není možno vyvolat tvorbu sporangií,například ani pěstováním na pylových zrn-kách.

Hlavní rozdíl mezi uvedenými kmeny sejeví při jejich pěstování v kultuře, přičemžběží převážně o pigmentaci primárního my-celia. Kmen ATCC 31 680 má oranžově zbar-vené mycelium, a to hnědooražové až silněoranžové v závislosti na živném prostředí.Kmeny ATCC 31 682 a ATCC 31 683 nemajížádné zřetelné zbarvení a jejich myceliajsou žlutošedá. K taxonomickým studiím kmenů ATCC31 680, ATCC 31 682 a ATCC 31 683 bylo uži-to známých způsobů, většinou těch, kteréjsou doporučeny v International Streptomy-ces Project (ISP) a které byly popsány vpublikaci Shirling a Gottlieb, 1966, Intern.J. of Systematic Bacteriol. 16 (3) : 313 až340. Enzymatické studie byly prováděny po-dle publikace Blazevic a Ederer, 1975, Prin-ciples of Biochemical Tests in DiagnosticMicrobiology, John Wiley and Sons, lne.,New York, a názvy barev, zkratky a číslabyly užity podle metody ISCC-NBS, uvedenév publikaci Kelly a Judd, 1976, The ISCC--NBS Centroid Color Charts Standard Samp-le č. 2106, US Dept. of Commerce, NationalBureau of Standarde, Washington D. C. Odol-nost proti lysozymu, rozklad kaseinu, esku-linu, hypoxanthinu, tyrosinu a xanthinu by-ly měřeny podle publikace Berg, 1973, Appl.Microbiol. 25: 665 až 681. Využití uhlíkubylo hodnoceno následujícím způsobem: + + = rovné nebo větší než kontrolní vzo- rek s obsahem glukózy, pozitivní vy- užití, + = menší než kontrolní vzorek s obsa- hem glukózy, avšak větší než kon-trolní vzorek bez obsahu uhlíku, po-zitivní využití, ( + ) = růst pochybný, využití pochybné, — = žádný růst, negativní využití.

Fyziologické vlastnosti a růst v jednotli-vých prostředích jsou pro kmeny Actinopla-nes, produkujících svrchu uvedená antibio-tika, shrnuty v následující tabulce:

Obecné fyziologické vlastnostia růstové vlastnostikmene Actinoplanes ATCC 31 680

Sledovaná vlastnost Výsledek Růst na: ISP prostředí č. 2 bohatý růst, zadní strana kultury 76.1yBr,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 3 dobrý růst, zadní strana kultury 93. y še-dá, mycelium rna vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 4 růst dobrý, zadní strana kultury 53.m.O,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří. ISP prostředí č, 5 růst dobrý, kultura lesklá, zadní stranakultury 50.s.O, mycelium na vzduchu senetvoří, rozpustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 7 růst dobrý, zadní strana kultury 54.brO,mycelium na vzduchu se netvoří, vytváříse světle hnědý rozpustný pigment.

Bennettův agar bohatý růst, zadní strana kultury 53.m.O,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří.

Prostředí s malátem vápenatýmdobrý růst, kultura lesklá, zadní stranakultury 50.S.O, mycelium na vzduchu senetvoří, rozpustný pigment se netvoří.

Czapkův agar růst dobrý, zadní strana kultury 50.S.O,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří.

Agar s glukózou a asparaginemrůst průměrný, zadní strana kultury 53.-m.O, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří. 228909

Sledovaná vlastnost Výsledek

Sledovaná vlastnost Výsledek 15 18

Agar s protlakem rajčat a s ovesnoumoukou růst bohatý, zadní strana kultury 53.m.O,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpustnýpigment se netvoří.

Anio Hensenův agar růst špatný, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pi ,memt se netvoří.

Prostředí 53H růst špatný, zadní strana kultury 91.d.gy-Y, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Czapkův pepton bohatý růst, zadní strana kultury 54.brO,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří.

Roklad kaseinupozitivní.

Reakce na katalázupozitivní.

Rtzklad eskulínupozitivní.

Zkapalnění želatinynegativní.

Produkce sirovodíku na ISP prostředí č. 6stopy.

Rozklad hypoxanthinunegativní.

Odolnost proti lysozymunegativní.

Melanoidní pigmenty na ISP prostředí č. 1negativní, ISP prostředí č. 6negativní, ISP prostředí č. 7negativní, ISP prostředí č. 7 bez tyrosinunegativní.

Tolerance NaCl na ISP prostředí č. 22 %.

Redukce nitrátunegativní. Růst vá oblast pH na ISP prostředí č. 26 až 8,4.

Produkce fosfatázypozitivní.

Reakce s odstředěným mlékemnegativní.

Hydrolýza škrobu na ISP prostředí č. 4negativní.

Tolerance sacharózy na ISP prostředí č. 220 %.

Teplotní rozmezí pro růst na ISP prostředíč. 2 5 až 37 CC.

Rozklad tyrosinunegativní.

Produkce ureázypozitivní.

Citlivost na antibiotika:

Cephalothin (sodná sůl) 30 μ%citlivý.

Erythromycin (esiolát) 15/zgcitlivý.

Chloromycetin 30 jugcitlivý.

Novobiocim 30citlivý.

Penicillin G 10 jednotekcitlivý.

Rifampin 5 ,«gcitlivý.

Streptomycin 10 μ%citlivý.

Tetracyklin 30 ,ugcitlivý.

Vankomycin HC1 30 ,«gcitlivý.

Využití zdrojů uhlíku na ISP prostředí č. 9*s následujícími přísadami: bez zdroje uhlíku — glukóza + + L-arabinčza ++ cellobióza + + D-fruktóza + + D-galaktóza + + i-inositol — D-mannitol + 2 2 8 9 O9 17

Sledovaná vlastnost Výsledek

1S malibióza + raffinóza + D-rhamnóza + + D-ribóza (+) salicin + sacharóza + D-xylóza + + * Sterilizované zdroje uhlíku byly přidánydo stejné konečné koncentrace 1,0 °/o.

Produkce faktoru antibiotika A-4696B2 a Cs,

Fyziologické vlastnostia růstové vlastnostikmene Actinoplanes ATCC 31 682

Sledovaná vlastnostVýsledek Růst na: ISP prostředí č. 2 růst dobrý, zadní strana kultury 9O.gy.Y,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 3 růst dobrý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 4 růst dobrý, zadní strana kultury 79,l.gy-.yBr, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 5 růst dobrý, zadní strana kultury 9O.gy.Y,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 7 růst průměrný, zadní strana kultury 80,-gy.yBr, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří.

Bennettův agar růst bohatý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří.

Agar s malátem vápenatýmrůst dobrý, kultura lesklá, zadní stranakultury 93.y šedá, mycelium na vzduchuse netvoří, rozpustný pigment se netvoří.

Czapkův agar růst bohatý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Agar s glukózou a asparaginemrůst dobrý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Agar s rajským protlakem a ovesnoumoukou růst bohatý, zadní strana kultury 91.d.-gy.Y, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří.

Anio-Hensenův agar růst průměrný, zadní strana kultury 91.-d.gy.Y, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří.

Prostředí 53H růst dobrý, zadní strana kultury 91.d.gy.-Y, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Czapkův pepton růst bohatý, zadní strana kultury 9O.gy.Y,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří.

Rozklad kaseinupozitivní.

Reakce na katalázupozitivní.

Rozklad askulinupozitivní.

Zkapalňovámí želatinypozitivní (100 %).

Produkce sirovodíku na ISP prostředí č. 6stopy.

Rozklad hypoxanthinunegativní.

Odolnost proti lysozymunegativní.

Tvorba melanoidního pigmentu na: ISP prostředí č. 1negativní, ISP prostředí č. 6negativní, ISP prostředí č. 7negativní, ISP prostředí č. 7 bez tyrosiinunegativní.

Tolerance NaCl na ISP prostředí č. 22 «/o.

Redukce nitrátůnegativní. Růstová oblast pH na ISP prostředí č. 2 6 až 8. 228909 19 20

Sledovaná vlastnost Výsledek

Sledovaná vlastnost Výsledek

Produkce fosfatázypozitivní.

Reakce s odstředěným mlékemnegativní.

Hydrolýza škrobu na ISP prostředí č. 4negativní.

Tolerance sacharózy na ISP prostředí č. 220 %.

Teplotní rozmezí pro růst na ISP prostředíč. 2 10 až 37 CC.

Rozklad tyrosimupozitivní.

Produkce ureázypozitivní.

Citlivost na antibiotika:

Cefalothin (sedmá sůl) 30 μ§citlivý.

Erythromycin (estolát) 15 μζcitlivý.

Chloromycetin 30 μξcitlivý.

Novobiocin 30 μξcitlivý.

Penicillin G 10 jednotekcitlivý.

Rifampin 5 μ§citlivý.

Streptomycin 10 ugcitlivý.

Tetracyklin 30 μ™ citlivý.

Vankzmycinhydrochlorid 30 μ§citlivý.

Produkce xanthinu' negativní.

Využití uhlíku na ISP prostředí č. 9*s přidáním: bez přísady — glukóza ++ L-arabinóza + + cellobióza + + D-fruktóza + + D-galaktóza + + j-inositol — D-mannitol + + melibióza + raffinóza + D-rhamnóza + D-ribóza + salicin + sacharóza + D-xylóza + + * Sterilizovaný uhlíkový zdroj byl přidándo výsledné koncentrace 1,0 %.

Produkce faktoru antibiotika A-4696A, Bi, Bz a Cla.

Fyziologické a růstové vlastnostikmene Actinoplames ATCC 31 683 Růst na: ISP prostředí č. 2 růst dobrý, zadní strana kultury 90.gy.Y,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 3 růst dobrý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří roz-pustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 4 růst dobrý, zadní strana kultury 79.1.gy.-yBr, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 5 růst průměrný, zadní strana kultury 90.-gy.Y, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří. ISP prostředí č. 7 růst průměrný, zadní strana kultury 80.-gy.yBr, mycelium na vzduchu se netvoří,vytváří se světle hnědý pigment.

Bennettův agar růst bohatý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Agar s malátem vápenatýmrůst dobrý, kultura lesklá, zadní stranakultury 93.y šedá, mycelium na vzduchuse netvoří, rozpustný pigment se netvoří.

Czapkův agar růst bohatý, zadní strana kultury 93.y še-dá, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Agar s glukózou a asparaginem růst dobrý, zadní strana kultury 93.y še- 228909 21 22

Sledovaná vlastnost Výsledek

Sledovaná vlastnost Výsledek dá, mycelium na vzduchu se netvoři, roz-pustný pigment se netvoři.

Agar s protlakem z rajčat a ovesnoumoukou růst dobrý, zadní strana kultury 91.d.gy.-Y, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Anio-Hensenův agar růst průměrný, zadní strana kultury 91.d.-gy.Y, mycelium na vzduchu se netvoří,rozpustný pigment se netvoří.

Prostředí 53H růst dobrý, zadní strana kultury 91.d.gy.-Y, mycelium na vzduchu se netvoří, roz-pustný pigment se netvoří.

Czapkův pepton růst bohatý, zadní strana kultury 9O.gy.Y,mycelium na vzduchu se netvoří, rozpust-ný pigment se netvoří.

Rozklad kaseinupozitivní.

Reakce na katalázupozitivní.

Rozklad eskulinu pozitivní.

Zkapalnění želatinypozitivní (100 %).

Produkce sirovodíku na ISP prostředí č. 6stopy.

Rozklad hypoxanthinunegativní.

Odolnost proti lysozymunegativní.

Tvorba melanoidního pigmentu na: ISP prostředí č. 1negativní, ISP prostředí č. 6negativní, ISP prostředí č. 7negativní, ISP prostředí č. 7 bez tyrosinunegativní.

Tolerance NaCl na ISP prostředí č. 2< 2 %.

Redukce nitrátůnegativní.

Oblast pH pro růst na ISP prostředí č. 26 až 8,4.

Produkce fosfatázypozitivní.

Reakce s odstředěným mlékemnegativní.

Hydrolýza škrobu na ISP prostředí č. 4negativní.

Tolerance sacharózy na ISP prostředí č, 220 %.

Teplotní rozmezí pro růst na ISP prostředíč. 2 5 až 40 °C.

Rozklad tyrosinupozitivní.

Tvorba ureázynegativní.

Citlivost na antibiotika:

Cefalothin (sodná sůl) 30 ,ugcitlivý.

Erythromycin (estolát) 15 μ%citlivý.

Chlormycetin 30 /zgcitlivý.

Novobiocim 30 ,ugcitlivý.

Penicillin G 10 jednotekcitlivý.

Rifampin 5 μξcitlivý.

Streptomycin 10 μ&amp;citlivý.

Tetracyklin 30 ^gcitlivý.

Vankomycinhydrochlorid 30,«gcitlivý.

Produkce xanthinunegativní.

Využití uhlíkových zdrojů na ISP prostředíč. 9* s přísadou: bez přísady — glukóza + + h-arabinóza ++ 228909

Sledovaná vlastnost Výsledek 23 24 cellobióza + + D-fruktóza + + D-galaktóza + + i-inositol — D-mannitol + + melibióza + raffinóza + D-rhamnóza + D-ribóza + salicin + sacharóza + D-xylóza + + * Sterilizovaný uhlovodíkový zdroj byl při-dán do výsledné koncentrace 1,0 °/o.

Produkce antibiotika A-4696 faktoru A, Βι, B2 a B3.

Jak již bylo uvedeno, je možno pěstovatActinoplanes missouriensis kmeny ATCC č,31 680, ATCC 31 682 a ATCC 31 683 v živnémprostředí k získání antibiotika A-4696 s ná-slednou izolací jeho faktorů. Živné prostředímůže být voleno z celé řady známých pro-středí, avšak z hlediska hospodárnosti, ma-ximálního výtěžku a snadné izolace antibioi-tika jsou některá prostředí výhodnější. Na-příklad škrob je jedním z výhodných zdro-jů uhlíku a kvasinky jsou jedním z výhod-ných zdrojů dusíku. Je však možno užít i ji-né zdroje uhlíku jako melasu, glukózu, dex-trin, glycerol a podobně. Ze zdrojů dusíkuje možnoi užít směsi aminokyselin, peptonya podobně. Z anorganických solí je v živném prostře-dí možno užít běžné soli, poskytující iontysodíku, draslíku, amonné ionty, ionty váp-níku, ionty fosforečmanové, chloridové, síra-nové a podobně. Mimoto je možno přidávatzdroje růstových látek, například lihovar-nické výpalky a extrakt z kvasnic, čímž jemožno dosáhnout příznivého účinku na pro-dukci faktorů antibiotika A-4696.

Stejně jako v případě jiných mikroorga-nismů má živné prostředí pro pěstováníkmenů Actinoplanes obsahovat základní sto-pové prvky, nutné pro růst a vývoj mikro-organismu. Tyto stopové prvky jsou již ob-vykle přítomny jako nečistoty v ostatníchsložkách živného prostředí.

Mikroorganismus, užitý pro výrobu anti-biotika A-4696 s následnou izolací jeho fak-torů Bi, Bz, B3, Či·,, C3 a El je schopen růs-tu v poměrně velkém rozmezí pH. Je všakžádoucí jej pěstovat v rozmezí pH 6,5 až7,0. Stejně jako je tomu v případě ostatníchmikroorganismů řádu Actinomycetes, měníse pH růstového prostředí postupně v prů-běhu růstu, takže na konci se obvykle po-hybuje v rozmezí 6,5 až 7,5.

Pro výrobu antibiotika A-4696 je výhodnépěstovat mikroorganismus v submerzní kul-tuře za aerobních podmínek. Poměrně malá množství antibiotika je možno získat z kul-tur v třepacích láhvích, v případě většíhomnožství antibiotika je nutno užít pěstováníve sterilních tancích ve formě submerzníkultury za aerobních podmínek. Živné pro-středí, obsažené ve sterilním tanku, je mož-no očkovat tak, že se ke sterilnímu prostře-dí přidá suspenze myceliálních fragmentů.

Je tedy žádoucí získat vegetativní očkova-cí materiál mikroorganismu, což se prová-dí tak, že se naočkuje malé množství živné-ho prostředí fragmenty mycelia a jakmilese získá mladá vegetativní kultura, přenesese tento materiál asepticky do většího tan-ku. Živné prostředí pro vypěstování vegeta-tivního očkovacího materiálu může být stej-né jako živné prostředí pro získání většíhomnožství antibiotika, je však možno užít ijiného živného prostředí.

Actinoplanes missouriensis, kmeny ATCC31 680, ATCC 31 682 a ATCC 31 683, produku-jící faktory antibiotika A-4696, je možnopěstovat při teplotě 20 až 40 CC. Největšímnožství faktorů uvedeného antibiotika sezíská v průběhu pěstování při teplotě 30 °C. Při pěstování v submerzní kultuře za ae-robních podmínek se živným prostředím ne-chá procházet sterilní vzduch. Objem vzdu-chu, který prochází živným prostředím, sepohybuje v rozmezí 0,1 až 1,0 objemu vzdu-chu za minutu na objem živného· prostředí.Nejúčinnější růst a produkce antibiotika sedosáhne v případě, že objem vzduchu tvonří alespoň polovinu objemu vzduchu za mi-nutu na 1 objem živného prostředí.

Rychlost produkce antibiotika A-4696 ajeho faktorů a koncentrace antibiotika vživném prostředí se sleduje tak, že se ode-bírají vzorky živného prostředí a podrobíse testům na antibiotickou účinnost proti or-ganismům, které jsou na tyto faktory citli-vé. Jedním z použitelných organismů je Ba-cillus subtilis. Biologickou zkoušku je mož-no provádět standardním způsobem na plot-nách s použitím kalíšků nebo papírovýchkotoučů. K maximální produkci antibiotika obvyk-le dochází v průběhu 4 až 6 dní v třepacíchkulturách i v submerzní kultuře za aerob-ních podmínek.

Antibiotikum A-4696 pro následnou izo-laci svých faktorů Βι, Bz, B3, Cia, C3 a Ei jemožno izolovat z živného prostředí a oddě-lit od ostatních případně přítomných látekběžnými metodami s použitím adsorpce aextrakce. Adsorpční postupy jsou výhodněj-ší, protože při nich není zapotřebí užít vel-kých objemů rozpouštědel, jako je tomu vpřípadě extrakčních postupů.

Protože způsob výroby je přibližně stejnýv případě, že se užívá kmene ATCC 31 680pro izolaci antibiotika A-4696, faktory Bza B3, kmene ATCC 31 682 pro izolaci antibio-tika A-4696 faktorů Bi a Cia a kmene ATCC31 683 pro izolaci antibiotika A-4696 fakto-rů B3 a Ei, je v následujících příkladech 228909 23 26 uveden pro jednoduchost pouze způsobkmene ATCC 31 682. V příkladu 1 jsou rov-něž uvedeny některé rozdíly, které se týka-jí použití kmene ATCC 31 683.

Vynález bude osvětlen následujícími pří-klady: Příklad 1 A. Fermentace ve třepací láhvi

Myceliální fragmenty Actinoplanes missou-riensis kmene ATCC 31 682 se naočkují našikmý živný agar následujícího složení:Složka Množství v % celeróza 0,5 bramborový dextrin 2,0 mouka nutrisoy* 1,5 extrakt z kvasnic 0,25 uhličitá vápenatý 0,1 agar 2,0 * Mouka Nutrisoy je dodávána Archer Da-niels Midland Company, 4666 Faries Park-way, Decatur, Illinois 62 526.

Šikmý agar naočkovaný kmenem ATCC 31 682 se pak inkubuje 6 dnů při teplotě 30°Celsia. Kultura mesporuluje, takže je nutnérozdrtit mycelium sterilní pipetou. Taktoupravená zralá kultura se překryje sterilnídestilovanou vodou a opatrně se odebere pi-petou nebo, sterilní tyčinkou, čímž se získásuspenze mycelia.

Takto získaná suspenze se užije k naočko-vání 100 ml sterilního vegetativního živné-ho prostředí následujícího složení:

Složka Množství v °/o cerelóza 0,5 bramborový dextrin 2,0 mouka Nutrisoy 1,5 extrakt z kvasnic 0,25 uhličitá vápenatý 0,1

Vegetativní živné prostředí se po naoč-kování inkubuje 48 hodin při teplotě 30 °Cna rotační třepačce při 250 otáčkách za mi-nutu. 10 ml naočkovaného živného prostře-dí se užije k naočkování 100 ml dalšího ste-rilního prostředí následujícího složení.Složka Množství v % cerelóza 0,5 kvasinky 0,25 mouka Nutrisoy 1,5 kukuřičný škrob 2,0 uhličitan vápenatý 0,1 Sag 471 (protipěnicí činidlo] 0,05

Toto druhé prostředí se inkubuje 24 ho-din při teplotě 30 °C za stálého třepání rych-lostí 250 otáček za minutu, 0,4 ml tohoto druhého prostředí se užijek naočkování 100 ml produkčního živnéhoprostředí svrchu uvedeného složení, kterése uloží do Erlenmeyerových baněk o obsa-hu 500 ml a předběžně se sterilizuje 30 mi-nut při teplotě 121 °C.

Složka Množství v °/o cerelóza 1,0 kukuřičný škrob 3,5 sacharóza 3,0 melasa 1,5 kvasinky Proflo (mouka 1,0 z bavlníkových semen) 1,0 uhličitan vápenatý 0,2 hydrogenfosforečnan draselný 0,05 síran amonný 0,025 síran hořečnatý . 7 H2O 0,5 Sag 471 0,03 Produkční prostředí se inkubuje 96 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu. Namá živné prostředí pH 8,0. konci fermentace Pro výrobu faktorů B3 a Ei antibiotika A-4396 se užije kmen ATCC 31 683 pro vý-robu vegetativního živného prostředí. 0,4 mlživného prostředí, naočkovaného kmenem ATCC 31 683 se pak užije k naočkování 100 mililitrů produkčního prostředí svrchu uve-deného složení v Erlenmeyerových baňkáchpo 500 ml po. předběžné sterilizaci 30 minut při teplotě 121 °C. Složka Množství v % cerelóza 1,0 kvasinky 2,0 uhličitan vápenatý 0,2 hydrogenfosforečnan draselný 0,05 síran amonný 0,025

Sag 471 0,03

Produkční živné prostředí se inkubuje 96hodin při teplotě 30 CC na rotační třepačceo 250 otáčkách za minutu. Na konci fer-mentace má živné prostředí pH 8,0. B. Fermentace v tanku o objemu 40 litrů

Vegetativní živné prostředí se připravízpůsobem, uvedeným v odstavci A. 25 litrůprodukčního prostředí se sterilizuje 30 mi-nut v autoklávu při teplotě 121 °C a vloží sedo fermentačního tanku o objemu 40 litrů.Toto množství se naočkuje 100 ml vegeta-tivního prostředí. Naočkované produkční pro-středí se pěstuje 4 dny při teplotě 30 °C. Živ-né prostředí se provzdušňuje sterilním vzdu-chem v množství Ϋ2 objemu vzduchu na 1objem živného prostředí za minutu. Míchá-ní se provádí míchacím zařízením pod tla-kem, aby bylo zajištěno dokonalé promíse-ní vzduchu s živným prostředím. V průběhu 228909 27 fermentace stoupá postupně pH živného pro-středí z počáteční hodnoty 6,5 na výslednouhodnotu 8,0. C. Izolace antibiotika A-4696 3800 litrů fermentačního prostředí, při-praveného svrchu uvedeným způsobem, sezfiltruje po přidání 5 % (hmotnostní/obje-mová %) pomocného prostředku pro filtra-ci (Celit 545). Filtrační koláč se znovu uve-de v suspenzi v 3600 litrech deionizovanévody a pH vodné suspenze se upraví na 10,5přidáním vodného roztoku hydroxidu sod-ného. Pevný podíl se oddělí filtrací a promy-je se vodou. Filtrát a promývací voda seslijí a výsledný roztok se okyselí 20% (hmot-inostní/objemová %) vodným roztokem ky-seliny sírové na pH 4,5. Kyselý roztok sevyčeří filtrací za současného přidání 1_ %pomocného prostředku (Celíte 545). Čirýroztok se nechá projít sloupcem o rozměru0,5 x 1,5 metru s obsahem 350 litrů Amber-litu IR-116 v Na + formě a sloupec se promy-je 1200 litry deionizované vody. PryskyřiceIR-116 se odstraní a po částech se vymývápři pH 10,5 celkem 1000 litry vodného roz-toku hydroxidu sodného. Eluát se neutrali-zuje na pH 7 přidáním 20% (hmotnostní//objemová %) vodného roztoku kyseliny sí-rové a pak se třikrát promyje 150 litry de-ionizovamé vody. Voda, užitá k promytí, seneutralizuje a slije s neutralizovaným eluá-tem. Výsledný roztok se koncentruje a paklyofilizuje. Výsledný surový komplex mělšpinavě šedou až tmavě hnědou barvu. D. Odstranění solí ze surového antibiotika A-4696 1,0 kg surového komplexu se pomalu přidáza energického míchání k 1,5 litru deioni-zované vody. Výsledná suspenze se míchá 20minut a pak se neutralizuje na pH 7 připoužití 10% vodného roztoku hydroxiduamonného. Nerozpustný komplex antibiotikaA-4696 se oddělí filtrací ve vakuu, promyjese deionizovanou vodou a lyofilizuje. Usu-šený komplex, zbavený solí, se izoluje vevýtěžku přibližně 80 %, vztaženo na biolo-gickou účinnost. E. Čištění antibiotika A-4696, zbavenéhosolí 300 g sušeného komplexu, zbaveného solí,se uvede v suspenzi ve 2 litrech deionizova-né vody a pH suspenze se upraví na 2,7 při-dáním vodného roztoku kyseliny chlorovo-díkové o koncentraci 3 N. Okyselený roztokse odstřeďuje 40 minut při 2500 otáčkáchza minutu. Supernatant se slije a nanese sena vrchol sloupce o rozměrech 8 x 85 cms obsahem 6 litrů odbarvovacího činidla(Duolit S761). Antibiotikum se vymývá de-ionizovanou vodou při rychlosti průtoku 30mililitrů za minutu. Eluce se sleduje chro- 28 matografií na tenké vrstvě. Eluát s obsahemantibiotika A-4696 se zahustí při teplotě 35°Celsia a tlaku 400 Pa na objem 3 litry a pakse lyofilizuje. Odbarvený komplex se tímtozpůsobem získá jako bílá až špinavě bílápevná látka ve výtěžku přibližně 70 %, vzta-ženo na biologickou účinnost. F. Izolace antibiotika A-4696 faktorů Βι, B2,B3, Cla, C3 a Ei ve formě hydrochloridu 10 g sušeného odbarveného komplexu an-tibiotika A-4696 se rozpustí ve 100 ml deio-nizované vody. Výsledný vodný roztok sezfiltruje a nanese na vrchol chromatogra-fického sloupce o rozměrech 5 x 100 cms obsahem 2 litrů polyamidu (Machery a Na-gel SC6). Sloupec se vymývá deionizovanouvodou a odebírají se frakce po 25 ml. Elucese sleduje ultrafialovým světlem a chroma-tografií na tenké vrstvě. Podle těchto údajůse slijí a lyofilizují frakce s obsahem jed-notlivých faktorů. Pro některé typy děleníbylo zapotřebí prodloužit sloupec na 200 cmtak, že byly užity dva sloupce s obsahempolyamidu za sebou. Další čištění bylo pro-váděno opakovanou chromatografií.

Postupy, uvedené v odstavcích A až F by-ly prováděny při použití kmene ATCC 31 682při izolaci faktorů Bi a CIa antibiotika A--4696, při použití kmene ATCC 31 680 v pří-padě izolace faktorů B2 a C3 antibiotikaA-4696 a při použití kmene ATCC 31 683 vpřípadě izolace faktorů B3 a Ei antibiotikaA-4696. Je sice možno k izolaci svrchu uve-dených faktorů užít i jiné kmeny Actinopla-nes, svrchu uvedené kmeny však jsou proizolaci jednotlivých faktorů antibiotika A--4696 nejvýhodnější.

Je také možno izolovat faktory Βι, B2, B3,Cia, Cj a Ei antibiotika A-4696 ve forměhydrochloridu při použití jediného kmeneActinoplames missouriensis následujícím způ-sobem: 200 mg sušeného odbarveného komplexuantibiotika A-4696, připraveného při použitíkmene ATCC 31 683 způsobem podle pří-kladu 1, odstavce A až E se rozpustí ve 2mililitrech destilované vody. Výsledný vodnýroztok se zfiltruje a dělí se chromatografiína sloupci při použití adsorpčních činidelv reverzní fázi, například Li ChroprepR RP--18 (E. Merck, Darmstadt, NSR) jako sta-cionární fáze, jako mobilní fáze se užijeacetonitrilu s obsahem triethylaminfosfátu,přičemž množství acetonitrilu se v průběhupostupu zvyšuje. Přestože je zřejmé, že od-borník může měnit koncentraci acetonitriluv závislosti na složení fermentačního pro-středí, je možno uvést alespoň, že výhodnérozmezí koncentrace acetonitrilu je 10 až40 %. Eluát se sleduje v ultrafialovém svět-le a frakce s obsahem jednotlivých faktorůse odebírají. Acetonitril se odstraní odpaře-ním ve vysokém vakuu a výsledné vodnéroztoky se lyofilizují, Lyofilizované chromá-

Claims (7)

1. 228 29 tografické frakce se pak znovu rozpustí vdestilované vodě, adsorbují na adsorpční či-nidla v reverzní fázi, například na Sep PakRC18 (Waters Associates lne., Milford, Massa-chusetts) a adsorpční činidlo se vymývá50% vodným methanolem. Vodné roztokys obsahem jednotlivých faktorů antibiotikaA-4696 se odpaří dosucha a čištěné faktoryse pak izolují jako amorfní pevné látky. Příklad 2 Způsob výroby faktorů Bi, Bz, B3, Cia, C3 a Eiantibiotika A-4696 ve formě sulfátu 300 g antibiotika A-4696, připravenéhozpůsobem podle příkladu 1 odstavce A ažD se uvede v suspenzi ve 2 litrech deionizo-vané vody a pH suspenze se upraví na 2,7 9 9 30 přidáním 3N vodného roztoku kyseliny sí-rové. Okyselený roztok se odstřeďuje 40 mi-nut při 2500 otáčkách za minutu. Superna-tant se slije a nanese na vrchol sloupce orozměrech 8 x 85 cm s obsahem 6 litrůpryskyřice k odbarvení (Duolit S761). Anti-biotikum se vymývá deionizovanou vodoupři průtoku 30 ml za minutu. Eluát se sle-duje chromatografií na tenké vrstvě a frak-ce s obsahem antibiotika A-4696 se zahustípři teplotě 35 °C a tlaku 400 Pa na objem3 litry a pak se lyofilizují. Odbarvený kom-plex se izoluje jako bílá až špinavě bílá pev-ná látka ve výtěžku přibližně 70 %, vztaže-no na účinnost. Jednotlivé faktory antibio-tika A-4696, a to Βι, B2, B3, Cia, C3 a Ei veformě sulfátů se izolují způsobem podle pří-kladu 1F. P Ř E D Μ E T

   1. Způsob výroby antibiotika A-4696 veformě komplexu nebo faktorů Bi, Bz, B3, Cia,C3 nebo Ei, nebo jejich farmaceuticky při-jatelných solí, vyznačující se tím, že se pěs-tuje mikroorganismus Actinoplanes missou-riensis kmen ATCC 31 680, ATCC 31 682 neboATCC 31 683 v živném prostředí s obsahemvyužitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anor-ganických solí v submerzní kultuře za ae-robních podmínek při pH 6,5 až 7,5 a přiteplotě 20 až 40 °C, načež se antibiotikumA-4696 ve formě komplexu z živného pro-středí izoluje a popřípadě se z komplexuizolují faktory Βι, B2, B3, Cia, C3 nebo Ei, kte-ré se popřípadě převedou na své farmaceu-ticky přijatelné soli.
2. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se antibiotikum A-4696, faktor Binebo jeho z farmaceutického hlediska při-jatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodouve formě hydrochloridu, který je bílá, krys-talická látka rozpustná ve vodě, rozpouš-tědlech s obsahem hydroxylových skupin apolárních rozpouštědlech a nerozpustná vetheru, chloroformu, benzenu, acetonu, ali-fatických uhlovodících a chlorovaných uhlo-vodících s přibližným složením 51,51 % uhlí-ku, 5,25 % vodíku, 4,88 % dusíku, 4,62 %chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teo-retickou molekulovou hmotností 1954, s ab-sorpčním maximem v ultrafialovém světleve vodě při 280 nm při E * = 42,8 s ná- sledujícími pásy v absorpčním spektru v in-fračerveném světle v bromidu draselném3380 široký, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637,1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321,1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060,1030, 1012, 982, 880, 842, 831 a 810 cm“1 izo-luje z komplexu antibiotika A-4696, získa-ného pěstováním Actinoplanes missourien-sis kmene ATCC 31 682 nebo 31 683 a popří-padě se převede na svoji z farmaceutickéhohlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou.
3. 3. Způsob podle bodu 1 nebo 2 vyznaču- ynalezu jící se tím, že se antibiotikum A-4696 faktorB2 nebo jeho z farmaceutického hlediskapřijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodouve formě hydrochloridu, který je bílá, krys-talická látka rozpustná ve vodě, rozpouš-tědlech s obsahem hydroxylových skupin apolárních rozpouštědlech a nerozpustná vetheru, chloroformu, benzenu, acetonu, ali-fatických uhlovodících a chlorovaných uhlo-vodících s přibližným složením 51,96 % uhlí-ku, 4,67 % vodíku, 5,72 % dusíku, 5,88 %chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teo-retickou molekulovou hmotností 1808, s ab-sorpčním maximem v ultrafialovém světleve vodě při 280 nm při EJ^J" = 44,7, s ná-sledujícími pásy v absorpčním spektru v in-fračerveném světle v bromidu draselném:3409 široké, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588,1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231,1210,1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884a 818 cm'1 izoluje z komplexu antibiotikaA-4696, získaného pěstováním Actinoplanesmissouriensis kmene ATCC 31 680 nebo ATCC31 683 a popřípadě se převede na svoji zfarmaceutického hlediska přijatelnou adičnísůl s kyselinou.
4. 4. Způsob podle bodu 1 nebo 2 vyznaču-jící se tím, že se antibiotikum A-4696 faktorB3 nebo jeho z farmaceutického hlediskapřijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodouve formě hydrochloridu, který je bílá, krys-talická látka rozpustná ve vodě, rozpouš-tědlech s obsahem hydroxylových skupin apolárních rozpouštědlech a nerozpustná vetheru, chloroformu, benzenu, acetonu, ali-fatických uhlovodících a chlorovaných uhlo-vodících s přibližným složením 51,84 %uhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,57proč. chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnouteoretickou molekulovou hmotností 1808, sabsorpčním maximem v ultrafialovém svět-le ve vodě při 280 nm při E = 46,3, snásledujícími pásy v absorpčním spektru v 228909 31 32 infračerveném světle v bromidu draselném:3394 široké, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656,1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427,1359,1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051,1018,985, 903, 882, 846 a 816 cm’1 izoluje z kom-plexu antibiotika A-4696 získaného pěstová-ním Actinoplanes missouriensis kmene ATCC31683 a popřípadě se převede na svoji zfarmaceutického hlediska přijatelnou adič-ní sůl s kyselinou.
5. 5. Způsob podle bodu 1 nebo 2 vyznaču-jící se tím, že se antibiotikum A-4696, fak-tor Cia nebo jeho z farmaceutického hledis-ka přijatelná adiční sůl s kyselinou, s vý-hodou ve formě hydrochloridu, který je bí-lá, krystalická látka rozpustné ve vodě, roz-pouštědlech s obsahem hydroxylových sku-pin a polárních rozpouštědlech a nerozpust-ná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu,alifatických uhlovodících a chlorovanýchuhlovodících s přibližným složením 53,05 %uhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,39proč. chloru a zbytkem kyslíku, s přibliž-nou teoretickou molekulovou hmotností1792, s absorpčním maximem v ultrafialo-vém světle ve vodě při 279 nm při Ej™ == 47,9 s následujícími pásy v absorpčnímspektru v infračerveném světle v bromidudraselném: 3380 široké, 2931, 1734, 1650,1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290,1228,1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987,903, 832, 814 a 715 cm'1 izoluje z komplexuantibiotika A-4696 získaného pěstovánímActinoplanes missouriensis kmene ATCC31 682 nebo ATCC 31 683 a popřípadě se pře-vede na svoji z farmaceutického hlediskapřijatelnou adiční sůl s kyselinou.
6. 6. Způsob podle bodu 1 nebo 2 vyznaču-jící se tím, že se antibiotikum A-4696, fak-tor C3 nebo jeho z farmaceutického hledis-ka přijatelná adiční sůl s kyselinou, s vý-hodou ve formě hydrochloridu, který je bí-lá, krystalická látka rozpustná ve vodě, roz-pouštědlech s obsahem hydroxylových sku-pin a polárních rozpouštědlech a nerozpust-ná v etheru, chloroformu, benzenu, aceto- nu, alifatických uhlovodících a chlorova-ných uhlovodících s přibližným složením51,73 % uhlíku, 4,69 % vodíku, 5,94 % du-síku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, sabsorpčním maximem v ultrafialovém svět-le ve vodě při 280 nm při EJ ™ = 47,9 snásledujícími pásy v absorpčním spektru vinfračerveném světle v bromidu draselném:3378 široké, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637,1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523,1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397,1387,1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028,1012,987, 965, 949, 878, 840, 816, 769, 708 cm'1izoluje z komplexu antibiotika A-4696 zís-kaného pěstováním Actinoplanes missou-riensis· kmene ATCC 31 680 nebo ATCC 31 683a popřípadě se převede na svoji z farma-ceutického hlediska přijatelnou adiční sůls kyselinou.
7. 7. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím,že se antibiotikum A-4696, faktor Ei nebojeho z farmaceutického hlediska přijatelnáadiční sůl s kyselinou, s výhodou ve forměhydrochloridu, který je bílá, krystalická lát-ka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s ob-sahem hydroxylových skupin a polárníchrozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chlo-roformu, benzenu, acetonu, alifatickýchuhlovodících a chlorovaných uhlovodícíchs přibližným složením 50,71 % uhlíku, 4,69proč. vodíku, 5,94 % dusíku, 6,02 % chlorua zbytkem kyslíku, s absorpčním maximemv ultrafialovém světle ve vodě při 279 nmpři Ej™' = 39,9 s následujícími pásy v ab-sorpčním spektru v infračerveném světle vbromidu draselném, 3394 široké, 2933, 1657,1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453,1424,1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212,1178,1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904,878, 847, 813, 770, 752, 738, a 714 cm'1 izo-luje z komplexu antibiotika A-4696 získané-ho pěstováním Actinoplanes missouriensiskmene ATCC 31 683 a popřípadě se převedena svoji z farmaceutického hlediska přija-telnou adiční sůl s kyselinou. 6 listů výkresů