DD202048A5

DD202048A5 - Verfahren zur herstellung des actaplaninantibiotikum-komplexes a-4696 mit den faktoren b tief 1, b tief 2, b tief 3, c tief 1 tief a, c tief 3 und e tief 1

Info

Publication number: DD202048A5
Application number: DD81235954A
Authority: DD
Inventors: Manuel Debono; Robert E Weeks; Herald J Cole; Kurt E Merkel
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-12-18
Filing date: 1981-12-18
Publication date: 1983-08-24
Also published as: PL234311A1; GB2089814B; KR830007832A; CS228909B2; IE812971L; IL64485A; AU7859881A; KR850001503B1; HU189548B; GB2089814A; RO82520A; ES508085A0; EP0055070B1; PT74137A; IL64485A0; ATE23192T1; DK562281A; NZ199197A; YU292881A; GR77286B

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung der neuen Faktoren B tief 1, B tief 2, B tief 3, C tief la, C tief 3 und E tief 1 des Antibiotikums A-4696 durch Zuechtung eines Stammes ATCC 31680, ATCC 31682 oder ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis in einem Fermentationsmedium, das uebliche assimilierbare Quellen fuer Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen, bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivitaet, und anschliessende, an sich bekannte Auftrennung d. hierdurch erhaltenen Komplexes des Antibiotikums A-4696 in die jeweiligen Faktoren. Die hierdurch erhaltenen einzelnen Faktoren sind wirksame antibakterielle und antimikrobielle Mittel, die sich unter anderem als wachstumsfoerdernde und die Futterverwertung verbessernde Mittel bei Gefluegel, Schweinen, Schafen und Rindern eignen.

Description

Verfahren zur Herstellung des Actaplaninantibiotikum-Kom- . plexes Α-"4696 mit den Faktoren B, ,.B₂/ B^₇ C, , C, und E,.

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Actaplaninäntibiotikum-Komplexes A-4696 mit den neuen Faktoren B, , Β«, Β-,, C, , C, und E, . Diese neuen Faktoren des Actaplanxnantibiotikums A-4696 sind wirksame antibakterielle und antimikrobiell Mittel, und sie stellen ferner auch wachstumsfördernde Mittel bei Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern dar.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Aus US-PS 3 952 095 ist bereits ein entsprechendes neues Antibiotikum und ein Verfahren zu seiner Herstellung bekannt. Das Antibiotikum A-4696 wird in US-PS 4 064 233 beschrieben. Aus US-PS 4 115 552 gehen die Faktoren A und B. des Antibiotikums Ä-4696 hervor.

Keiner der vorliegenden Faktoren des'Antibiotikums A-4696 ist jedoch mit dem Faktor B des Antibiotikums A-4696 gemäß US-PS 4 064 233 oder US-PS 4 115 552 identisch. Ferner sind die vorliegenden Faktoren des Antibiotikums A-4696

^j 3 ^J μ»

aus dem Stand der Technik weder bekannt noch nahegelegt. Vielmehr geht aus obigen Patenten'hervor, daß irgendwelche zusätzliche Faktoren oder chromatographische Flecke lediglich Artefakten der chromatographischen Verfahren sind,, so daß diese Literatur eigentlich von der Erfindung wegführt. . . . .

Aufgabe der Erfindung: "

Die bekannten Antibiotika verfügen zwar über eine entsprechende Wirksamkeit,, sind diesbezüglich jedoch immer noch verbesserungsbedürftig. Sie unterliegen zudem im Laufe der Zeit einer Resistenzbildung- Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung neuer Antibiotika mit verbesserter Wirksamkeit und ohne-bereits bestehende Resistenz.

Darlegung des Wesens der Erfindung: . '

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch die neuen Faktoren B, , B^, B-., C, , C, und E-. des Actaplaninantibiotikums A-4696 der im folgenden näher beschriebenen Art gelöst, welche wirksame antibakterielle und antimikrobiel-Ie Mittel darstellen. Diese Faktoren beschleunigen das Wachstum und erhöhen die Futterverwertung von"Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern.

Die Faktoren B,, B~, B~, C, * C^. und E₁ des Antibiotikums χ i. j χ a j χ

A-4696 werden aus dem Antibxotikumkomplex A-4696 isoliert, der gebildet wird, indem man einen Mikroorganismus Actinoplanes missouriensis ATCC 31680, ATCC 31682 oder ATCC 31683 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Bedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität entstanden ist.

Das Verfahren zur Erhöhung der Futterverwertung bei Wiederkäuern besteht darin, daß man wiederkauenden Tieren.eine wachstumsfördernde Menge des Antibiotxkumkomplexes A-4696 oder der Faktoren B, , B ', B₃, C, , C₃ und/oder E, des Antibiotikums A-4696 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalzes hiervon in Form eines Futters, Futtervorgemisches oder Ergänzungsfutters verabreicht.

Das Verfahren zur Wachstumsförderung von Hühnchen besteht darin, daß man Hühnchen entweder mit ihrem Futter oder mit dem Trinkwasser eine wachstumsfördernde Menge des Antibiotikumkomplexes A-4696 oder der neuen Faktoren B₁, B„, B₃, C, , C₃ und/oder E, des Antibiotikums A-4696 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon verabfolgt.

Die Erfindung bezieht sich, wie bereits erwähnt, auf die neuen Faktoren B,, B_, B₃ , C, , C₃ und E, des Actaplaninantibiotikums A-4696, Diese neuen Faktoren des Antibiotikums A-4696 werden aus dem Antibiotikum A-4696.in an sich bekannter Weise isoliert, wobei das Antibiotikum A-4696 gebildet wird, indem man einen zu den Actinoplanes gehörenden Mikroorganismus in einem Nährmedium so lange züchtet, bis sich im,Kulturmedium eine wesentliche antibakterielle Aktivität feststellen läßt. · .

Durch entsprechende Hochlexstungsflüssigkeitschromatographie hat sich ergeben, daß der im eingangs erwähnten Stand der Technik beschriebene Antibiotikumkomplex A-4696 mehrere bisher unbekannte Faktoren enthält, die· vorliegend als

die Faktoren B,, Β-, B,, C₁ undC₃ bezeichnet werden. Aus χ α ~> la . j

dem Antibiotikumkomplex A-46 96 läßt sich auch noch ein weiterer Faktor isolieren, der als Faktor E-. bezeichnet wird, und bei dem es sich um ein Abbauprodukt handeln dürf-

5 9 54

te. Die chemischen, physikalischen und.· biologischen Eigenschaften dieser Faktoren zeigen, daß es sich hierbei um neue Antibiotika handelt, die - außer möglicherweise dem Faktor E, - aus dem gleichen Peptidkern (Aglykon) und Aminozucker zusammengesetzt sind und verschiedene Mengen an Glucose, Mannose und Rhamnose enthalten. Der Faktor E, . ähnelt großteils den anderen Faktoren, dürfte jedoch einen etwas abgewandelten Peptidkern haben, Durch bioautographische Verfolgung der Aglykonbildung während der Hydrolyse von sowohl dem Antibiotikumkomplex A-4696 als auch den einzelnen Faktoren hiervon ergibt sich, daß innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeit-ein einfaches Gemisch aus antimikrobiell wirksamem Pseudo-Aglykon und Aglykon entsteht. Die Stelle der antimikrobiellen Wirksamkeit des Antibiotikumkomplexes Ä-4696 und der einzelnen Faktoren dürfte in dem Peptid Pseudo-Aglykon liegen, wobei die einzelnen Faktoren durch Unterschiede in der Zusammensetzung

ihrer Neutralzucker wesentlich.voneinander verschieden '

sind. Die vorhandenen Zucker dürften hauptsächlich die Funktion einer Modulierung der Löslichkeit und anderer wichtiger pharmakodynamischer Parameter haben. Die Art und Weise, in der die vorliegenden antibiotischen Faktoren wirken oder produziert werden, bildet jedoch.keinen Teil der Erfindung. Es soll daher auch keinerlei Beschränkung hinsichtlich des hierin angegebenen postulierten Wirkungsmechanismus geben.

Die erf ijidungsgemäßen antibiotischen Faktoren werden aus dem Antibiotikum A-4696 isoliert, das gebildet wird, indem man den Organismus Actinoplanes missouriensis in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet. Man trennt den Antibiotikumkomplex A-4696 zuerst aus der dabei erhaltenen Fermentationsbrühe ab und isoliert anschließend die einzelnen Faktoren durch Flüssigkeitschromatographie. Vorzugsweise»werden die

erfindungsgemäßen antibiotischen Faktoren in das entsprechende Hydrochlorid oder Sulfat überführt.

Unter dem Antibiotikum A-4696 wird erfindungsgemäß der Actaplaninantibiotikum-Komplex verstanden, während die aus diesem- Komplex isolierten verschiedenen Faktoren als die Faktoren A, B,, B-, B₃, C-, , C₃, E, usw. des Antibiotikums A-4696 bezeichnet werden. Das Antibiotikum A-4696 und die daraus isolierten.einzelnen Faktoren stellen äußerst wirksame Mittel zur Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen dar_? die Krankheitserreger für Mensch und Tier sind. Darüber hinaus"lassen sich die vorliegenden antibiotischen Faktoren auch in der Landwirtschaft anwenden, und zwar als .wachstumsfördernde Mittel bei Hühnchen, Schweinen, Schafen und Rindern.

Die neuen antibiotisch wirksamen Faktoren B,, B₃, B₃, C-, , C-. und E, des Antibiotikums A-4696 sind basische Verbindungen, die zur Salzbildung mit geeigneten Säuren befähigt sind land aus dem Antibiotikum A-4696 isoliert werden, das produziert'wird, indem man einen zur Spezies Actinoplanes missouriensis gehörenden Mikroorganismus so lange in einem Nährmedium züchtet, bis sich im Kulturmedium eine wesentliche antibakterielle Wirksamkeit feststellen läßt. Die Kennzeichnung der. einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 durch physikalische Daten erfolgt vorliegend in Form der jeweiligen Hydrochloride. Unter Anwendung an sich bekannter Verfahren lassen sich selbstverständlich jedoch auch andere pharmazeutisch unbedenkliche Salze dieser Faktoren herstellen.

Durch Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel, Bioautographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ergibt sich, daß das Antibiotikum A-4696 nach entsprechender Isolierung zu einem Gemisch aus mehreren Kompo-

r- - 6 -

J J J .H *J

nenten führt, die antibiotisch wirksam sind. Diese Komponenten werden als die Faktoren A, B,, B^, B,, C, , C-, und E, des Antibiotikums Ä-4696 bezeichnet, und sie lassen sich präparativ vom Antibiotikum A-4696 durch Chromatographie mittels einer mit einem Polyamid gefüllten Säule abtrennen. Die bei dieser Chromatographie anfallenden Baktionen werden durch ÜV-Aktivität und Dünnschichtchromatographie .überwacht,, wobei identische ehromatographische Fraktionen, die reine Faktoren A, B, , B₂, B₃, C, , C₃ oder E, des Antibiotikums Ä-4696 enthalten, vereinigt und gefriergetrocknet werden., Identität und Reinheit der dabei anfallenden gefriergetrockneten chromatographischen Sammlungen lassen sich durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmen. '. '

Der Faktor A des Antibiotikums A-4 6 96 wurde bereits früher isoliert und verfügt im wesentlichen über physikalische Daten, wie sie aus US-PS 4 115 552 hervorgehen. Die vorliegend in diesem Zusammenhang angegebenen physikalischen Daten über diesen Faktor dienen lediglich zur Erläuterung der Abtrennung und Charakterisierung der anderen neuen Faktoren des Antibiotikums A-4696, die Gegenstand der Erfindung sind,

Durch dunnschichtchromatographische Untersuchung des Antibiotikums A-4696 unter Anwendung einer Bioauflage und Einsatz eines Lösungsmittelgemisches aus Methanol, Chloroform, konzentriertem Ammoniumhydroxid, sekundärem Butanol und Wasser (50:25:25:25:10) sowie unter Anwendung von Bacillus subtilis als Detektionsorganismus zeigt folgende Ergebnisse:

9 5 A

Jeweiliger Faktor des R_f-Wert

Antibiotikums A-4 69 6

B₁ . .· 0,35

B₂ : 0,45

^B3 ' : 0,40

c_la : o,5i

Eine entsprechende Untersuchung des Antibiotikums A-4696 durch Hochleistungsflussigkeitschromatographie bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines 90:10-Gemisches aus 2 %-iger wäßriger Essigsäure und Acetonitril sowie eines 70:30-Gemisches aus 2 %-iger wäßriger Essigsäure und Acetonitril als Lösungsmittel zeigt folgende Ergebnisse: .

Jeweiliger Faktor des K'-Wert

Antibiotikums A-4696

A 1,60

B₁ ' 1,99 B₂ .3,84

B₃ 2,50

C_la 2,92

C₃ . 4,23

E₁ 0,38

Durch Dünnschichtchromatographie und Hochleistungsflussigkeitschromatographie lassen sich auch noch mehrere zusätzliche untergeordnete Faktoren vom Antibiotikum A-4696- abtrennen. Diese Faktoren werden als Faktoren C,,, C„ , C_n.

ib Za δώ

und P bezeichnet und ähneln in mancher Hinsicht den Faktoren A, B,, B₂, B₃, C, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696. Im Antibiotikumkomplex A-4696 können weiter auch noch bisher nicht entdeckte Faktoren enthalten sein. Die im Antibiotikum A-4696 in untergeordneter Menge Vorhände-

Γ r

nen Faktoren konnten nicht durch entsprechende physikalische Daten charakterisiert werden, da sie sich nicht in ausreichender Menge isolieren und reinigen ließen.

Hydrolysiert man entweder das Antibiotikum A-4696 oder die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 unter schwach sauren Bedingungen (5 %-iger methanolischer Chlorwasserstoff saure, Rückflußtemperatur, 70 Minuten), dann wird ein Pseudo-Aglykon_rgebildet. Dieses Pseudo-Aglykon fällt aus dem Hydrolysegemisch aus und hat im Falle der Faktoren A, B,, B„, B folgende Struktur:

C, undC, des Antibiotikums A-4696

CH

Ιοί Ιοί

Η</ "V ^OH Ah

Beim Faktor E, des Antibiotikums A-4696 kann das obige Pseudo-Aglykon etwas abgewandelt sein, was jedoch nicht

sicher ist. . .

Durch papierehromatographische Untersuchung sowie durch dünnschichtchromatographische Untersuchung der Hydrolyse-

2 j.-, S=KO -PS. gum ·< * * M ^ Λ W »^ ·**> *«/ Hr"

filtrate des Antibiotikumkomplexes Ä-4696 und der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 ergibt sich, daß der Komplex und die Faktoren zusätzlich zum Pseudo-Aglykonkern jeweils verschiedene Mengen an Neutral zuckern enthalten. Art und MolVerhältnisse der hierbei für die Faktoren A, B₁, B₀, B, und C₁ des Antibiotikums A-4696

X A j) -L el

gefundenen Neutralzucker gehen aus der folgenden Tabelle I hervor;

TABELLE I Molverhältnisse der Neutralzucker *

Jeweiliger Faktor des Mannose ; Glucose Rhamnose Antibiotikums A-4696

A-

1,01

^B2

^B3

1,08

χα.

* Die Neutral zucker wurden durch gaschromatographische . Analyse ihrer Trimethylsilyl-Derivate bestimmt. Für jeden Zucker ist die Summe aus dem α- und dem ß-Isomer angegeben, . ·

Die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 unterscheiden sich wesentlich voneinander durch die in ihnen ' vorhandenen Neutralzucker, die an unbekannten Stellungen des Pseudo-Aglykons vorhanden sind.

Der Faktor B, des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungs-

2,80	1,0
2,05	1,0
1,80 =	1,0
2,37	1,0
1,12	1,0

mitteln, wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil. ...

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist; .

C = 51,51, H = 5,25, " N = 4,88, Cl= 4,62.

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zukker ein Molekulargewicht von etwa 1954. - ' '

Das Hydrochlorid des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 rrni ein Ultraviolett-Absorptions-

1 % maximum E, von 4 2,8 auf.

Das Hydrochlorid des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 1 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3380 breit, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, .1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229 , 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 und 810 cm"¹.

Der Faktor B₂ des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen

-.11- . >'.. »j ^j ^j ^j ^f

Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser" Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C.stabil. . :

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors B-·des Antibiotikums Ä-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist: -

C = 51,96, H = 4,67, N = 5,72, Cl = 5,88.

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des. Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zucker ein Molekulargewicht von etwa 1808.

Das Hydrochlorid des Faktors B₂ des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

maximum E₁ von 44,7 auf

lern

Das Hydrochlorid des Faktors B„ des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der „Fig. 2 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3409 breit, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987,- 903, 884 und 818 cm"¹.

Der Faktor B., des Antibiotikums A-4696 ist in^.Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen,. Chlorkohlenwasserstoffen und

£L %J *>J

dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27 ⁰C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre. Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist: ' .

C = 51,84, H = 4,74, N = 5,83, Cl = 5,57.

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung .durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zucker ein Molekulargewicht von etwa 1808.

Das Hydrochlorid des Faktors.B~ des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1 % maximum E-, von 46,3 auf. . _; - „ ,„.

Das Hydrochlorid des Faktors B₃ des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 3 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in-diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3394 breit, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359/ 1291, 1228, 1209, 1180, 11"2O, 1072, 1051, 1018, 985, 903,^;882, 846 und 816 cm"¹.

Der Faktor C-, des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloiridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die

löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über ei-

nen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil. . /

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochloride des Faktors C, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der.Rest Sauerstoff ist:

C= 53,05, H = 4,74, N = 5,83, . Cl = 5,39.

Dieses Hydrochloric! hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten . Zucker ein Molekulargewicht von etwa 1792.

Das Hydrochlorid des Faktors C, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 279 mn ein Ultraviolett-Absorptions-

1 % maximum E, von 4 7,9 auf.

lern

Das Hydrochlorid des Faktors C, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 4 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3380 breit, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814 und 715 cm"¹.

Der Faktor C₃ des Antibiotikums A-46 96 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors C, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist: . '

C= 51,73, H = 4,69, N = 5,94, Cl = 6,02.

Das Hydrochlorid des Faktors C₃ des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1% maximum Ξ-, von 47,9 auf.·

Das Hydrochlorid des Faktors C-, des Antibiotikums Ä-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 5 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3378 breit, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, .1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397,

1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028,. 1012, 987,

965, 949, 878, 840, 816, 769 und 708 cm"¹.

Der Faktor Ξ, des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors E, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 50,71, H = 4,70, N = 9,01, Cl = 1,84.

Das Hydrochloric! des Faktors E, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 279 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1% '

maximum E-, von 3 9 »9 auf.

1cm . . .

Das Hydrochlorid des Faktors E, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 6 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Äbsorptionsmaxima feststellen: 3394 breit, 2933, 1657, 1636/ 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424,-1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061., 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738 und 714 cm"¹.

Die Hydrochloride der Faktoren B₁, B₀, B.,, C, , C, oder

χ Α ο j. a j

E, des Antibiotikums Ä--4696 sind gegenüber Bacillus subtilis praktisch genauso antibiotisch wirksam wie das Antibiotikum A-4696 (US-PS 4 115 552).

Aus den Faktoren B,, B„, B,, C-, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 lassen sich unter Anwendung an sich bekannter Methoden und Einsatz von Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen entsprechende pharmazeutisch unbedenkliche Salze herstellen. Zur Bildung antibiotisch wirksamer Salze derartiger Säuren säuert man beispielsweise eine Lösung der freien "Base des jeweiligen Antibiotikums mit der gewünschten Säure an und fällt das jeweilige Salz dann durch Zugabe von Aceton zur Lösung aus. In bestimmten Fällen lassen sich solche Salze auch durch Ionenaustausch mittels einer lonenaustauschersäule herstellen. Andere bekannte Methoden zur Bildung antibiotischer Salze können natürlich ebenfalls angewandt werden.

Die neuen Faktoren des Antibiotikums A-4696 hemmen das Wachstum einer Reihe von Mikroorganismen, die Krankheits-

- 16 - L O J ü J

erreger sind für Menschen, Tiere und Pflanzen, und sie eignen sich daher zur Unterdrückung des Wachstums solcher Organismen. Die Konzentrationen, in denen die Hydrochloride der Faktoren B,, B₂, B₃, C, /C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 das Wachstum verschiedener Mikroorganismen hemmen, gehen zahlenmäßig aus den folgenden Tabellen II und III hervor» Die darin enthaltenen Hemmwerte beruhen auf dem sogenannten Agar-Verdünnungsversuch und sind in Form der Werte für die minimale Hemmkonzentration (MIC-Werte) in Mikrograiran pro Milliliter ^g/ml) angegeben.

.Zur Durchführung der hierzu erforderlichen Agar-Verdünnungsversuche bringt man den jeweiligen Versuchsorganismus auf Ägarplatten auf, in deren Agar das jeweilige Hydrochlorid des entsprechenden Faktors des Antibiotikums A-4696 in verschiedener Konzentration enthalten ist. Die Versuchsplatten werden dann 48 Stunden bei 37⁰C inkubiert, worauf man den jeweiligen MIC-Wert in Form der Platte mit der niedrigsten Konzentration an Antibiotikum bestimmt, durch welche das Wachstum des Versuchsorganismus gehemmt wird.

Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse lassen sich den folgenden Tabellen entnehmen. .

TABELLE II

Minimale" Hemmkonzentration -'Agar-Ver-

dünnungsversuch Jeweiliger Äctaplänin-FaktöF" fpg/rnl)

Versuchsorganismen (Bakterien) Β_Ί ^βο E, ' . ' . C₁,

Staphylococcus epi Hitchens— 32 8 2 2

Staphylococcus epi Dutt-' 0,25 0,25 0,06 0,13

Staphylococcus epi Bennet 16 4 2 1

Staphylococcus aureus 4283 16 4 1 X

Staphylococcus aureus 3055 4 2 1 1

Staphylococcus aureus 3132 16 4 2 2 ^

Staphylococcus aureus H25 4 2 2 1

Staphylococcus aureus 3134 8 4.22

Staphylococcus aureus 3123 8 4 1 2

Staphylococcus aureus H535 8 4 2 2 ' Sv \

Staphylococcus aureus 3.131 8 4 2 1

Streptococcus Group D 282 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D 238 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D SS992 .2 1 0,5 0,5

Streptococcus Group D 9901 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D 9913 2 2 0,5 0,5 ,

Streptococcus Group D 9933 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D Guze 2 1 0,5 O₁, 5

Streptococcus Group D 12753F 2 2 0,5 0,5

TABELLE IT (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Ver-

dünnungsversuch

Jeweiliger Actaplanin-Faktor

Versuchsorganismen (Bakterien)	^Bl	ι IT ^B2	^B3	^Cla
Streptococcus viridans 9943—	0,5	1	Ö,2ä.	0, 5
Streptococcus viridans 9961	1	1	' 0,5	0, 5
Streptococcus pyogenes C203	0,5	0,5	0,25	0,5
Streptococcus pyogenes DS663-72	0,5	0,5	0,5	0, 5
Streptococcus pyogenes DS664-72	0,5	0,5	0,5	0, 5
Streptococcus pneumoniae Park I	0,5	0,5	0,5	0,5
Streptococcus pneumoniae Type 14	0,5	0,5	0,5	0,5
Staphylococcus aureus 3074	32	8	4 '.	8
Streptococcus faecalis X66	1	1	<0,5	2
Proteus morganii PR15	>128	>128	>128	>128
Salmonella typhosa SA12	>128	>128	>128	>128
Klebsiella pneumoniae KL14	>128	>128	>128	>128
Enterobacter aerogenes EB17	>128	>128	>128	>128
Serratia marcescens SE3	>128	>128	>128	>128
Eschericia coli EC14	>128 j	>128	>128	>128
Citrobacter freundii CP17	>128	>128	>128	>128

TABELLE II(Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Ver-

dünnungsversuch Jeweiliger Actaplanin-Faktor {μq/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien)

Pseudomonas aeruginosa X239 Bordetella bronchiseptica 16 Salmonella typhimurium Pseudomonas solanacearüm X185 Erwinia amylovora Candida tropicalis A17 Trichophyton mentacrophytes 27 Aspergillus flavus E Ceratocystis ulmi

1/ MH Agarinokulum- 1:500 2/ MH Agarinokulum- 1:10 5% Hasenblut i 'la

>128	: . >128	>128	>128
>128	>128	>123	. >128
>128	>128 -	>128	>128
>128 .	>128	>128	>128
64	128	128	128
>128	>128	>128	>128
>128	>128	>128	>128
>128	>128	>128	>128
>128	>128	>128	>128

TABELLE III

Minimale HeiBrnkönzentratiori - Ägar-Lösungsversuch

Actaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien)

Staphylococcus aureus Xl. 1 Staphylococcus aureus V41 Staphylococcus aureus X400 Staphylococcus aureus S13E Staphylococcus epiderniidis Staphylococcus epidermidis Streptococcus Group A C203 Streptococcus Group D X66 Streptococcus Group D 9960 Streptococcus pneumoniae park Haemophilus influenzae sens. CL. Haemophilus influenzae res. Shigella sonnei N9 E. coli NlO E. coli EC14 E. coli TEM Klebsiella X26 Klebsieila KAE

E,

2	16
1	16
2	16
2	16
2	32
1	16
Or δ-	1
1	4
2	8
0,5	2
32	>128
64	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
128	>128
>128	>128
>128	>128

TABELLE III (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration -„ Agar-LÖsungsversuch

Äctaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien) Enterobacter aerogenes X68 Enterobacter aerogenes C32 Enterobacter aerogenes EB17 Enterobacter cloacae EB5 Enterobacter cloacae 265A Salmonella typhosa X514 Salmonella typhosa 1335 Pseudomonas aeruginosa X528 Pseudomonas aeruginosa X239 Pseudomonas aeruginosa Psl8 Serratia marcescens X99 Serratia marcescens SE3 Proteus morganii PR15 Proteus inconstans PR33 Proteus rettgeri PR7 Proteus rettgeri C24 E-

>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128

CJl CD

TABELLE III (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Lösungsversuch

Actaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien) ^C3 ^El

Citrobacter freundii CF17 Bordetella fronchiseptica Clostridium difficile 2994 Clostridium perfringens 81 Clostridium septicum 1128 Eubacteruim aerofaciens 1235 Peptococcus asaccharolyticus 1302 Peptococcus prevoti 1281 Peptostreptococcus anaerobius 1428 Peptostreptococcus intermedius 1264 Propionibacterium acnes 79 Bacteroides frogilis 111 BacLeroides fragilis 18?7 Bacteroides fragilis 1936B Bacteroides thetaiotaomicron 1438 Bacteroides melaninogenicus 1856/28

>128	>128
>128	>128
,1	1
ι ·	1
1	1
1	1
0,5	1
128	128
>128	>128
2	4
1	1
128	>128
128	>128
64	128
64	>128
>128	>128

to

OJ • CO

or

TABELLE III (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Lösungsversuch Actaplanin-Faktor {mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien)

Bacteroides melaninogenicus 2736

Bacteroides vulgatis 1211

Bacteroides corrodens 1874

Fusobacterium symnbiosum 1470 32 128 ι

Fusobacterium necrophorum 6054A ^{1OQ sloil} to

^C3	1	>128
128	. >l-28
128	>128
128	128
32	>128
128

Die obigen Versuchsdaten zeigen, daß die Hydrochloride der Faktoren B-,, B₂, B₃, C, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 wirksame antibakterielle und arvtiirvikrobielle Mittel darstellen, die sich allgemein zur Bekämpfung pathogener Mikroorganismen eignen. Durch Zusatz eines Faktors B,, B„, B-,, C, ,C₃ oder E, des Antibiotikums A-4696 oder eines entsprechenden Säureadditionssalzes hiervon zu einer Zahnpaste, einem Zahngel-, einem Zahnpulver oder der-, gleichen oder zu einem Mundwasser oder einem sonstigen Mittel zur Mundhygiene läßt sich ferner auch die Entwicklung von Zahnkaries und Parodontose hemmen, die eine Folge einer bakteriellen Einwirkung ist. Gegebenenfalls kann man auch eine Lösung aus einem oder mehreren Faktoren von Antibiotikum A-4696 oder einem entsprechenden Säüreadditionssalz hiervon in einer geeigneten Konzentration mit einem entsprechenden Tupfer auf die Oberfläche des Gaumens oder der Zähne aufbringen.

Die Faktoren B-,, B₂? B₃, C, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 sind ferner auch wachstumsfördernd wirksam, so daß sie das Wachstum von Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern beschleunigen und die Futterverwertung erhöhen. So führt beispielsweise eine tägliche Aufnahme eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antibiotika durch Geflügel und Schweine in einer Menge von etwa 0,5 bis 25 mg/kg Körpergewicht zu einem rascheren Wachstum und einer höheren Futterverwertung als wenn man den entsprechenden Tieren die 'gleiche Grundfutterration gibt, welche jedoch keinen Wirkstoff enthält. Unter einer solchen Grundfutterration wird die gesamte Futteraufnahme des jeweiligen Tieres verstanden, und hierbei handelt es sich demnach-um die verschiedenen Futtermittel, Konzentrate, Ergänzungsfutter, Mineralien, Vitamine oder wirkstoffhaltigen Vorfutter, Rauhfutter und dergleichen, die die einzelnen Stoffe des jeweiligen Diätplans der Tiere enthalten. Beispiele für entspre-

chende Grundrationen für Geflügel und Schweine gehen aus US-PS 4 115 552 hervor.

Bei einer wichtigen Ausführungsform der Erfindung verabreicht man den jeweiligen Faktor B₁ , B₀, B-., C₁ , C, oder

i. ζ. ο xa .j

E, des Antibiotikums A-4696 oder ein geeignetes Derivat oder Gemisch hiervon oral zusammen mit einem'geeigneten Futter derart in einer Menge von etwa 2 bis 200 g/t Gesamtfutter , daß sich die gewünschte erhöhte Futterausbeute und Wachstumsförderung ergibt. Der Zusatz, der erfindungsgemäßen Faktoren des Antibiotikums A-4696 zu einem entsprechenden Tierfutter erfolgt vorzugsweise in Form eines Vorfuttergemisches (US-PS 4 115 552), das etwa 1 bis 200 g der Faktoren B₁, B₀, B_v C₁ , C₂ oder E₁ des Antibiotikums A-4696 öder eines geeigneten Derivats oder Gemisches hiervon pro kg Vorgemisch enthält. Das hierdurch erhaltene fertige Vorgemisch wird dann der entsprechenden fertigen Futterration zugegeben. Wahlweise kannman in das Futter auch ein wirkstoffhaltiges Konzentrat oder Ergänzungsfutter einmischen.

Die neuen Faktoren B,, B₂, B₃, C-, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 sind zwar in mehreren verschiedenen Richtungen wirksam, sie eignen sich jedoch insbesondere als Antibiotika-Substanzen dieser Wirkungsart werden immer zur Behandlung von mit Mikroorganismen zusammenhängenden Krankheiten benötigt.

Die erfindungsgemäßen neuen antibiotisch wirksamen Faktoren werden aus dem Antibiotikum A-4696 isoliert, das gebildet wird, indem man einen von mehreren Stämmen von Actinoplanes unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium so lange züchtet·, bis das Kulturmedium eine wesentliche antibiotische Aktivität enthält..Die im " Kulturmedium enthaltenen antibiotischen Faktoren lassen

2 35 954 5

sich unter Anwendung der verschiedensten.bekannCen Isolierungs- und Reinigungsverfahren gewinnen. .

Der zur Herstellung des Antibiotikums A-4696 geeignete Mikroorganismus ist als Stamm von Actinoplanes missouriensis aus der Familie der Actinoplanaceen identifiziert worden. Bei den Actinoplanaceen handelt es sich um eine Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales, deren erste Beschreibung zu finden ist.in Sei. Sbc. 65, 315 bis 318 (1949) und 66, 87 bis 92 (1950) , Trans. New York Acad. Sei. 16, 315.. bis 318 (1954), Jour. Elisha Mitchell Sei. Sog. 71, 148 bis 155 und 269 (1955)., Sergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 825 bis 829 (1957) und Jour* Elisha Mitchell Sei.- Soc. 79, 53 bis 70 (1963).

Biologisch reine Kulturen der zur Herstellung des Antibiotikums A-4 6 96 und zur anschließenden Isolierung der Faktoren B,, B„, B₃, C-, , C, und E, des Antibiotikums A-4696 geeigneten Stämme von Actinoplanes missouriensis sind in der ständigen Kulturensammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden und bilden feil dieser Sammlung, wovon sie unter den Nr. ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 ohne jegliche Beschränkung der Öffentlichkeit zugänglich sind.

Der StamnrATCC 31682 eignet sich zur Herstellung des Antibiotikums Ä-4696 und nachfolgenden Isolierung der Faktoren B, sowie C, des Antibiotikums A-4696. Der Stamm ATCC 31680 eignet sich zur Isolierung der Faktoren B ' sowie C₃ des Antibiotikums A-4696. Der Stamm ATCC 31683 läßt sich zur Isolierung der Faktoren B₃ sowie E, des Antibiotikums A-4696 verwenden.

Die Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis zeichnen sich durch die im folgen-

den näher angegebenen physikalischen Eigenschaften und Kultureigenschaften aus.

Die drei Stämme stammen aus einer Reihe von Mutationen des Stammes ATCC 23342, der in US-PS 4 115 552 beschrieben wird. Die vorliegenden Stämme bilden ein ähnliches Substrat oder Mycel, und ihre Morphologie ist von der des UrsprungsStammes praktisch nicht zu unterscheiden. Es lassen sich weder Luftmycelien,Sekundarmycelien noch Sporangien feststellen, wobei ferner auch Techniken, wie ein Wachsenlassen auf Pollenkörnern, ebenfalls keinerlei Sporangien ergibt, _;" ' . '· ·..

Die wesentlichen Unterschiede der vorliegenden Stämme bestehen in den entsprechenden Züchtungseigenschaften, insbesondere der Pigmentation der Primärmycelien. Der Stamm ATCC 31680 hat ein orange gefärbtes Mycel, dessen Farbe je nach dem jeweiligen Medium von mittelorange bis bräun-lich-orange zu stark orange reicht. Die Stämme ATCC 31682 und ATCC 31683 weisen keine derartige unterscheidbare Farbe auf und haben gelblich-graue Mycelien.

Die zur taxonomisehen Untersuchung der Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 geeigneten Methoden sind dem Fachmann bekannt. Im großen und ganzen handelt es sich hierbei um die vom International Streptomyces Project (ISP) hierfür empfohlenen Methoden, wie sie von Shirling und Gottlieb in Intern. J. of Systematic Bacteriol. 16(3)/313 bis 340 (1966) beschrieben sind. Die Biountersuchungen werden durchgeführt nach den Methoden von Blazevic und Ederer, 1975, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.,New York. Die Zuordnung der Farbnamen, Abkürzungen und Zahlen erfolgt nach der Methode ISCC-NBS von Kelly und Judd, 1976, The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106, US-

2359 54

Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington D.C. Die Lysozymresistenz und die Zersetzung von Casein , Aesculin, Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin werden unter Anwendung des Verfahrens von Berg, 1973, Appl. Microbiol. 25, 665 bis 681 ermittelt. Es werden ferner auch Untersuchungen über die Kohlenstoffverwertung durchgeführt, deren Ergebnisse wie folgt bewertet werden:

++ = gleich bis/oder > Glucosekontrolle, positive Verwertung c ^:

+.' = < Glucosekontrolle, > keine Kohlenstoffkontrolle, positive Verwertung

(+).= fragliches Wachstum, fragliche Verwertung - = kein Wachstum, negative Verwertung..

Die folgenden tabellarischen Aufstellungen zeigen eine taxonomische Beschreibung unter Einschluß der Kulturcharakteristiken und der physiologischen Charakteristiken der. erfindungsgemäß zu verwendenden Stämme von Actinoplanes.

Allgemeine Kulturcharakteristiken und physiologische Charakteristiken des Stammes Actinoplanes ATCC 31680

Beobachtete Eigenschaften

Charakteristiken

Kulturcharakteristiken von: ISP-Medium, Nr. 2

ISP-Medium Nr. 3 ISP-Medium Nr. 4

- reichliches Wachstum,Farbe der Unterseite 76. l.yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 93. yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gu£es Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

ISP-Medium Nr.- 5 ISP-Medium Nr. 7 Bennett-Agar Calciummalat Czapek-Agar Glucose-Asparagin Tomatenpaste-Hafermehl Änio-Hensens-Agar' 53H-Medium Czapek-Pepton Gutes Wachstum, glänzend. Farbe der Unterseite^50, S.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 54.brO, kein Luftmycel, hellbraunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 53.rn.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment "

Gutes Wachstum, glänzend Farbe der Unterseite 50. s.o., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment.

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 50.s.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Deutliches Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Schlechtes. Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Schlechtes Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gyY, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 54.brO, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

2 3

Casein-Zersetzung · ~ Catalase-Reaktion Aesculin-Zersetzung Gelatine-Verflüssigung

HpS-Produktipn in ISP-Medium Nr. β . . Hypoxanthin-ZerSetzung Lysozym-Resistenz Melanoidpigmente auf ' ISP-Medium Nr. 1

ISP-Medium Nr. 6

ISP-Medium Nr. 7

ISP-Medium Nr. 7 . ·.. minus Tyrosin ς·

NaCl-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr. 2 - .

Nitrat-Reduktion

pH-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2

Phosphatase-Produktion Magermilch-Reaktion

Stärke-Hydrolyse auf ISP-Medium Nr. 4

Saccharose-Verträglichkeit" auf ISP-Medium Nr. 2

Temperatur-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2

Tyrosin-ZerSetzung ürease-Produktion Antibiotische Empfindlichkeit: Cephalothin (Natrium) 30 μg Erythromycin (Estolat) 15 μ9 Novobiocin 30 ^g Penicillin (G) 10 Einheiten Rifampin 5 μ<3 Streptomycin 10 ^g Tetracyclin 30 μg

Positiv Positiv Positiv. Negativ Spur,·

Negativ Negativ

Negativ Negativ Negativ

Negativ

2 % Negativ

6 bis 8,4 Positiv Negativ

Negativ 20 %

5 bis 37⁰C

Negativ

Positiv

Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv

Vancomycin HCl 30 μg Sensitiv

Xanthin-Produktion- Negativ

KohlenstoffVerwertung auf

ISP-Medium Nr.. 9 * mit: '

keinem Kohlenstoff -

Glucose . .++ . '

L-Ärabinose ++

Cellobiose ++

D-Fructose ++

D-Galactose ++

Isoinosit -

D-Mannit . +

Melibiose .' '· +

JRaffinose . +

D~Rhamnose . ++

D-Ribose ..- ( + )

Salicin "+

Saccharose +

D~Xylose · ++.

* Zusatz sterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 %. .

Bildung von Faktoren des Antibiotikums A-4696 B„ und C-.

Allgemeine Kulturcharakteristiken und physiologische Charakteristiken des Stammes Actinoplanes ATCC 31682

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Kulturcharakteristiken von:

ISP-Medium Nr. 2 Gutes Wachstum, Farbe der

Unterseite 9O.gy.Y., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 3 Gutes Wachstum, Farbe der

Unterseite 93. yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 4 ISP-Medium Nr. 5 ISP-Medium Nr.- 7 Bennett-Agar Calciummalat Czapek-Agar Glucose-Asparagin Tomatenpaste-Hafermehl Anio-Hensen-Agar 53H-Medium Czapek-Pepton

Casein-Zersetzung Catalase-Reaktion Aesculin-Zersetzung Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite,79.1.gy. yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 9O.gy.Y kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes· Wachstum, Farbe der Unterseite 80.gy.yBr, kein Luftmycel, kein lösliches. Pigment

Reichliches Wachstum,,Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 9 3.yGra kein Luftmycel, kein lösliches Pigment . .

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gy.Y., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der .Unterseite 91.cl.gy.-Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 9O.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Positiv Positiv Positiv

Gelatine-Verflüssigung	Positiv (100
HpS-Produktion in ISP-Medium Kr. 6	Cr-,,-,ν- -P--
Hypoxanthin-Zersetzung	Negativ
Lysozym-Resistenz	Negativ
Melanoid-Pigmente auf
.ISP-Medium Nr, 1	"Negativ
ISP-Medium Nr. 6	Negativ
ISP-Medium Mr. 7	Negativ
ISP-Medium Nr. 7. minus Tyrosin , "	Negativ
NaCX-Verträglichkeit auf ISP-Medium Mr. 2	2 %
Nitrat-Reduktion .	Negativ
pH-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2	6 bis 8
Phosphatasa-Produktion	Positiv
Magermilch-Reaktion	Negativ
Stärke-Hydrolyse auf . ISP-Medium Nr. 4	Negativ
Saccharose-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr. 2	20 %
Temperatur-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2	10 bis 37°C
Tyrosin-Zersetzung	Positiv
Urease-Produktion	Positiv
Antibiotische Empfindlichkeit:
Cephalotin (Natrium) 30 μg	Sensitiv
Erythromycin (Estolat) 15 μ?	Sensitiv
Chlormycetin 30 μ9	Sensitiv
Novobiocin 30 μ9	Sensitiv
Penicillin (G) 10 Einheiten	Sensitiv
Rifämpin 5 μ9	Sensitiv
Streptomycin 10 μg	Sensitiv
Tetracyclin 30 μg	Sensitiv
Vancomycin HCl 30 μg	Sensitiv
Xanthin-Produktion	Negativ

5 ψ° S f* K/, «^

Kohlenstoffverwertung auf

ISP-Medium Nr₀ 9 * mit: . . ...

keinem Kohlenstoff . -

Glucose . · .. ++

L-Arabinose ++ ' ' .

Cellobiose ++

. D-Fructose ++

D-Galactose , ++

Isoinosit -

D-Männit " ^ .++

Melibiose ' +

Raffinose ., . . +

D~Rhamnose . +

D-Ribose . . + ' .

Salicin ' + .

Saccharose +

D-Xylose " ++

* Zusatz sterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer

Endkonzentration von 1,0 %.

Bildung von Faktoren des

Antibiotikums A-4696 A, B,, B₀ und C

-4'

'2 la

Allgemeine Kulturcharakteristiken und physiologische " Charakteristiken des Stammes Actinoplanes ATCC 31683

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Kulturcharakteristiken von:

ISP-Mediüm Nr. 2 Gutes Wachstum, Farbe der

Unterseite 9O.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 3 Gutes Wachstum, Farbe der

. Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

J J J J t| j

ISP-Medium Nr. 4 ISP-Medium Nr. 5 ISP-Medium Nr, 7 Bennett-Agar Caleiummalat.

Czapek-Agar Glucose-Asparagin Tomatenpaste-Hafermehl Anio-Hensen-Agar 53H-Medium

Czapek-Pepton

Casein-Zersetzung Catalase-Reaktion Aesculin-Zersetzung Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 79.1.gy.yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 9O.gy.Y, kein Lüftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 8 0.gy.yBr, kein Lüftmycel, hellbraunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Lüftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 9 3,yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment >

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Positiv Positiv Positiv

Gelatine-Verflüssigung - Positiv (100%) H-S-Produktion in

ISP~Mediüm Nr=. 6 Spur--

Hypoxanthin-Zersetzung Negativ

Lysozym-Resistenz , Negativ

Melanoid-Pigmente auf .

ISP-Medium Nr., 1 Negativ

ISP-Medium Nr. 6 Negativ . «

. ISP-Medium Nr. 7 Negativ.

ISP-Medium Nr. 7 .

minus .Tyrosin Negativ

NaCl-Verträglichkeit auf

ISP-Medium Nr., 2 < 2 %

Nitrat-Reduktion . Negativ

pH-Wachstumsbereich auf

ISP-Medium Nr, 2 6 bis 8,4

Phosphatase-Produktion . Positiv Magermilch-Reaktion . ' Negativ

Stärke-Hydrolyse auf .

ISP-Medium.Nr. 4 - ' Negativ

Saccharose-Verträglichkeit auf

ISP-Medium Nr, 2 20 %

Temperaturwachstumsbereich

auf ISP-Medium Nr. 2 5 bis 4 0⁰C

Tyrosin-Zersetzung Positiv

Urease-Produktion . Negativ Antibiotische Empfindlichkeit:

Cephalothin· (Natrium)

30 \xq Sensitiv

Erythromycin (Estolat)

15 ^g Sensitiv

Chlormycetin 2Qi ^q Sensitiv

Novobiocin 30 μg Sensitiv Penicillin (G) 10 Einheiten Sensitiv

Rifampin 5 μg Sensitiv

Streptomycin 10 μg Sensitiv

Tetracyclin 30 μg Sensitiv

' Vancomycin HCl 30 μg Sensitiv

- 37 - · / J D H h

Xanthin-Produktiöh Negativ

Kohlenstoffverwertung auf ISP-Medium Nr. 9 * mit:

keinem Kohlenstoff -

Glucose . · . ' ++ . '..

L-Arabinose ++

.Cellobiose ++ D-Fructose ..++..

_. D-Galactose ...++

Isoinosit ^ - ¹^

D-Mannit ++,

Melibiose . +

Raffinose +

D-Rhainnose . +

D-Ribose · + ' .

Salicin " + _. ' .

Saccharose ' +

D-Xylose ++...-'

* Zusatz sterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 %..

Bildung von Faktoren des

Antibiotikums A-4696 A, B, , B„ und B-.

Wie- bereits oben erwähnt, kann man die Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ÄTCC 31683 von Actinoplanes missouriensis in einem Kulturmedium wachsen lassen, um hierdurch das Antibiotikum A-4696 zu produzieren, aus welchem anschließend die antibiotisch wirksamen Faktoren von A-4696 isoliert werden. Als Kulturmedium läßt sich hierzu irgendeines der verschiedensten bekannten Medien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, maximalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Antibiotikums werden hierzu jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise Stärke eine der bevorzugten Quellen

3 ο y ο 4 D

für Kohlehydrat, ,während Hefe eine* der bevorzugten Quellen für Stickstof f darstellt.. Zu anderen verwendbaren Quellen für Kohlehydrat gehören Melasse, Glucose, Dextrin, Glycerin und dergleichen. Zu weiteren Quellen für Stickstoff gehören Aminosäuregeinische, Peptone und dergleichen.

Zu anorganischen Nährsalzen, die in das Kulturmedium ein-_ geführt werden können, gehören die üblichen Salze, die Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid oder Sulfat liefern. Ferner können auch Quellen für. Wachstumsfaktoren verwendet werden, wie bei der Korndestillation anfallende Rückstände oder Hefeextrakte, die die Bildung der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 günstig beeinflussen. .

In dem Kulturmedium, in dem man die erfindungsgemäßen Stämme von Actinoplanes wachsen läßt, sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, wie man sie auch zum Wachsenlassen und zur Entwicklung anderer Mikroorganismen braucht.. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die den Wachstumserfordernissen des Organismus genügen.

Die zur Bildung des Antibiotikums A-4696 und zur nachfolgenden Isolierung der Faktoren B,, B₂, B₃, C, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 verwendeten Organismen können in einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich wachsen. Zweckmäßigerweise züchtet man den jeweiligen" Organismus jedoch in einem Medium, das einen pH-Wert zwischen etwa 6,5 und 7,0 hat. Wie bei anderen Actinomyceten, so verändert sich auch im vorliegenden Fall der pH-Wert des wachsenden Mediums allmählich während der Wachstumszeit, so daß der pH-Wert am Ende der Fermentationszeit gewöhnlich zwischen

etwa 6,5 und 7,5 liegt.

Für die Bildung der Faktoren des Antibiotikums Ä-4696 werden submerse aerobe Kulturbedingungen bevorzugt. Durch Schüttelkolben-Fermentation lassen sich verhältnismäßig geringe Mengen der Antibiotika erzeugen. Zur Herstellung größerer Mengen hiervon wird jedoch eine Züchtung unter subrnersen aeroben Bedingungen in sterilen Tanks bevorzugt. Das im jeweiligen sterilen Tank befindliche Kulturmedium kann mit einer Suspension von Mycelfragmenten beimpft werden.

Es empfiehlt sich demnach, durch Beimpfen einer verhältnismäßig geringen Menge eines Kulturmediums mit den Mycelbruchstücken des jeweiligen Organismus zuerst «ein vegetatives Inokulum des Organismus zu bilden', und das hierdurch erhaltene junge aktive vegetative Inokulum dann unter aseptischen Bedingungen in den großen Tank zu übertragen. Zum Wachsenlassen des vegetativen Inokulums kann man das gleiche Medium verwenden wie für die großtechnische Produktion der einzelnen Faktoren des Antibiotikums Ä-4596; Es können jedoch auch jeweils andere Medien eingesetzt werden. - .

Die die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 bildenden Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC-31683 von Actinoplanes missouriensis wachsen bei Temperaturen zwischen 20 und 40⁰C. Die größten Mengen an Faktoren des Antibiotikums A-4696 scheinen bei einer Temperatur von etwa 30⁰C gebildet zu werden.

Beim submersen aeroben Züchtungsverfahren wird durch das Kulturmedium sterile"Luft geblasen. Die Menge an in das Kulturmedium eingeleiteter Luft schwankt zwischen etwa . 0,1 und 1,0 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumen Kulturmedium. Am besten sind Wachstum und Bildung

3 Γ" Π T* / π M λ Λ ^ -J J H

an Antibiotikum bei Einleitung einer Luft in einer Menge von wenigstens 0,5 VoIumenteilen Luft pro Minute und pro Volumen an Kulturmedium.

Das. Ausmaß der Bildung der Faktoren des Antibiotikums . A-4696 und die Konzentration der antibiotischen Aktivität im Kulturmedium läßt sich während der Wachstumszeit verfolgen, indem man Proben der Fermentationsbrühe bezüglich ihrer antibiotischen Wirksamkeit gegenüber Organismen untersucht, von denen man weiß, daß sie antibiotikaempfindlich sind. Ein hierfür geeigneter Prüforganismus ist Bacillus subtilis. Diese Biountersuchung läßt sich unter Verwendung der üblichen Becher-Platten-Methoden oder mit Hilfe von Papierscheiben auf Agarplatten durchführen.

Sine maximale Bildung an Antibiotikum erfolgt im allgemeinen innerhalb von etwa ..4 bis 6 Tagen in Schüttelkol-. ben-Fermentationen oder bei submersen aeroben Kulturbe-. dingungen. ' -

Das beim vorliegenden Verfahren erhaltene Antibiotikum A-4696 kann zur anschließenden Isolierung der Faktoren B₁, B₀, Β.,, C, , C₃ und E₁ des Antibiotikums A-4696 vom Kulturmedium abgetrennt und von anderen eventuell vorhandenen Substanzen befreit werden, wozu man sich üblicher Adsorptionsverfahren und Extraktionsverfahren bedient. . Die Adsorptionsverfahren werden hierzu bevorzugt, da man hierbei im Gegensatz zu den Extraktionsverfahren nicht mit großen Lösungsmittelvolumina arbeiten muß.

Die Verfahren zur Erläuterung der Erfindung sind für ein Arbeiten mit den Stämmen ATCC 31680 (zur Isolierung der Faktoren B₂ und C₃ des Antibiotikums A-4696), ATCC 31682 (zur Isolierung der Faktoren B, und C-, des Antibiotikums A-4696) und ATCC 31683 (zur Isolierung der Faktoren B₃

235954

und E, des Antibiotikums A-4696) praktisch gleich, so daß die Erfindung im folgenden der Einfachheit halber lediglich unter Verwendung von ATCC 31682 beispielsiüäJ3ig erläutert wird. Bestimmte verfahrensmäßige Unterschiede in bezug auf das Produktionsmedium und die Verwendung des Stammes ATCC 31683 sind bei Beispiel 1 jedoch ebenfalls angegeben- ... .

Ausführunqsbeispiele;

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.

Beispiel 1 . .

A* Schüttelkolben-Fermentation

Man beimpft.Mycelbruchstücke von Actinoplanes missouriensis, nämlich im vorliegenden Fall vom Stamm ATCC 31682, auf einer Nähragarschräge folgender Zusammensetzung:

Bestandteile . . Mengen

Cerelose 0,5 %

Kartoffeldextrin 2,0 %

Sojabohnenmehl * 1,5 %

Hefeextrakt 0,25 %

CaCO₃ 0,1 %

Agar 2,0 %

* Nutrisoy-Flour von Archer Daniels Midland Company, 4666 Faries Parkway, Decatur, Illinois 62526.

Die mit ATCC 31682 beimpfte Schräge wird dann 6 Tage bei 30⁰C inkubiert. Die Kultur bildet keine Sporen, so daß man die Mycelmatter mit einer sterilen Pipette zerkleinern muß. Die zerkleinerte reife Kultur wird mit

2359 54 5

sterilem destilliertem Wasser überdeckt und sorgfältig mit der Pipette oder einem sterilen Stab abgeschabt, wodurch man zu einer Mycelsuspension gelangt.

Die auf diese Weise erhaltene Suspension verwendet man dann zur Beimpfung von 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung: .

Bestandteile^' " Mengen

Cerelose 0,5 %

Kartoffeldextrin 2,0 %

Sojabohnehmehl 1,5 %

Hefeextrakt _ . 0,25 %

CaCO₃ « 0,1 %

Das' inokulierte vegetative Medium läßt man 48 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler wachsen, der mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen/Minute bewegt wird..Sodann inokuliert man 1.0.ml dieses.vegetativen Mediums in 100 ml eines., sterilen Änsgangsmediums {StoßmediuitiV . folgender '"Zusammensetzung:

Bestandteile Mengen

Cerelose 0,5 %

Hefe . 0,25 %

Sojabohnenmehl 1,5%

Maisstärke 2,0%

CaCO₃ 0,1 %

Sag 471 0,05. %

Das erhaltene inokulierte Ausgangsmedium inkubiert man dann 24 Stunden bei 30⁰C unter ständigem Schütteln eines mit 250 Umdrehungen/Minute betriebenen RotationsSchüttlers.

0,4 ml des so gebildeten Ausgangsmediums inokuliert man hierauf jeweils in 100 ml eines Produktionsmediums mit folgender Zusammensetzung, das m 5Ü0 ml fassenden Erlenmeyerkolben enthalten und bei 121⁰C über eine Zeitdauer von 30 Minuten sterilisiert worden ist.

Bestandteile ·.· Mengen

Cerelose	1,0%
Maisstärke .·. , .	3,5 %
Saccharose ' ,	3,0 %
Melasse	1,5 %
Hefe ' " , ·	1,0 %
Baumwollsaatmehl (Proflo)	1,0 %
CaCO₃	0,2 %
K₂HPO₄	0,05 %
(NH₄)₂SO₄	0,025 %
MgSO₄.7H₂O .	0,5%
Sag 471 .	0,03 %

Das obige Produktionsmedium wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C auf einem mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen/Minute betriebenen Rotationsschüttler geschüttelt. Am Ende der Fermentationsdauer verfügt dieses Medium über einen pH-Wert von etwa 8,0.

Für die Herstellung der Faktoren B₃ und E, des Antibiotikums A-4696 verwendet man den Stamm ATCC 31683 für die Bildung des als Produktionsmedium benötigten Ausgangsmediums. Zu diesem Zweck impft man 0,4 ml des den Stamm ATCC 31683 enthaltenden Ausgangsmediums in jeweils 100 ml eines Produktiönsmediums folgender Zusammensetzung ein, das in 500 ml fassenden Erlenmeyerkolben enthalten ist und bei 121⁰C über eine Zeitdauer von 30 Minuten sterilisiert worden ist. ·

2 359 54

Bestandteile . Mengen

Cerelose 1,0 %

Hefe 2,0%

CaCO₃ . .·.'.- 0,2 %

K₃HPO₃ ,:. 0,05 %

)₂SO₄ 0,025 %

Sag 471 0,03 %

Das so gebildete Produktionsmedium wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von,30⁰C auf einem bei 250 Umdrehungen/Minute betriebenen Rotationsschüttler geschüttelt. Am Ende der Fermentationszeit verfügt das Medium über einen pH-Wert von etwa 8,0.

B. Tankfermentation in einem 40 1 fassenden Tank

Zur Herstellung des benötigten Inokulums geht man wie oben unter Abschnitt A. beschrieben bis zur Inkubation des Ausgangsmediums vor. 25 1 eines Produktionsmediums der angegebenen Art sterilisiert man dann durch 30 Minuten lange Behandlung bei 121⁰C in einem Autoklav und gibt das Ganze hierauf in einen 40 1 fassenden Fermentationstank.. Das sterile Produktionsmedium beimpft man hierauf mit 100 ml des Ausgangsmediums. Sodann läßt man das beimpfte Produktionsmedium 4 Tage bei 30⁰C fermentieren. Die Fermentation wird mit steriler Luft in einer Menge von etwa 0,5 Volumenteilen Luft/Volumenteil Kulturmedium/Minute belüftet. Das fermentierende Produktionsmedium wird mit einem mit Schaufeln versehenen Mischer bewegt? um hierdurch für eine saubere Durchmischung von Luft und Medium zu sorgen. Mit fortschreitender Fermentation erhöht sich der pH-Wert des Kulturmediums allmählich von einem Anfangswert von etwa 6,5 auf etwa 8,0.

59 5

C. Isolierung des Antibiotikums A-4696

Die nach obigem Verfahren hergestellte Fermentationsbrühe (3800 1) wird nach Zugabe von 5 % (Gewicht/Volumen). Filterhilfe (Celite 545) filtriert. Der erhaltene Filterkuchen wird in deionisiertem Wasser (3600 1) suspendiert und der pH-Wert der wäßrigen Suspension mittels wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt. Die suspendierten Feststoffe werden durch Filtrieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen, Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt, und die hierbei.erhaltene Lösung wird mit 20 %-iger (Gewicht/Volumen) wäßriger Schwefelsäure auf pH 4,5 angesäuert. Die saure Lösung wird durch Filtrieren unter Verwendung von 1 % Filterhilfe (Celite 545) geklärt. Die klare Lösung wird dann durch eine Säule (0,55 χ 1,5. m) geführt, die 350 1 AmberIite" IR-116 (Na⁺- Form) enthält, und die Säule wird hierauf mit deionisiertem Wasser (1200 1) gewaschen. Hierauf wird das IR-116-Harz aus der Säule entfernt und absatzweise bei pH 10,5 mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid (insgesamt 1000 1) eluiert. Das erhaltene Harzeluat wird mit 20 %- iger (Gewicht/Volumen) wäßriger Schwefelsäure neutralisiert (pH 7) und dann dreimal mit deionisiertem Wasser (insgesamt 150 1) gewaschen. Das Waschwasser wird neutralisiert und mit dem neutralisierten Eluat vereinigt. Die erhaltene Lösung wird konzentriert und dann gefriergetrocknet. Der auf diese Weise hergestellte rohe Komplex schwankt in seiner Farbe von lohfarben bis dunkelbraun.

D. Entfernung der Salze aus dem rohen Antibiotikum A-4696

Man gibt den obigen rohen Komplex (1,0 kg) langsam unter kräftigem Rühren zu deionisiertem Wasser (1,5 1). Die erhaltene Suspension wird 20 Minuten gerührt und dann unter Verwendung von 10 %-iger wäßriger Ammoniumhydroxid-

lösung neutralisiert (pH 7). Der unlösliche Komplex des Antibiotikums Ä-4696 wird durch Vakuumfiltration abgetrennt, mit deionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhält man-den getrockneten und von Salz befreiten Komplex in einer Ausbeute von etwa 80 % (bezogen auf die Biowirksamkeit).

Ξ. Reinigung des von Salzen befreiten Antibiotikums A-4696

Der in obiger Weise erhaltene getrocknete und von Salz befreite Komplex (300 g) wird in deionisiertem Wasser (2 1) suspendiert, worauf man den pH-Wert der Suspension durch Zugabe von 3n wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,1 einstellt. Die angesäuerte Lösung wird 40 Minuten bei 2500 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und auf eine Säule (8 χ 85 cm) gegeben, die 6 1 Entfärbungsharz (Duolite S761) enthält.Die Aktivität wird von der Säule mit deionisiertem Wasser unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Minute eluiert. Die Eluierung wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Der das Antibiotikum A-4696 enthaltende Säulenabstrom wird unter Vakuum (3 mm, 35⁰C) auf ein Volumen von 3 1 eingeengt und dann gefriergetrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu einem entsprechend entfärbten Komplex in Form eines weißen bis lohfarbenen Feststoffs in einer Ausbeute von etwa 70 % (bezogen auf die entsprechende Bioaktivität).

F. Isolierung der Hydrochloride der Faktoren B,, B₂,

B., C₁ , C, und E₁ des Antibiotikums A-4696 .5 la j ι

Der in obiger Weise gebildete getrocknete und entfärbte Komplex des Antibiotikums A-4696 (10 g) wird in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die erhaltene wäßrige Lösung wird filtriert und auf eine chromatographische Sau-

λ —J M Λ WSv 1 Ά \λλ.

23595

Ie (5 χ 100 cm) gegeben, die 2 1 eines Polyamidharzes (Machery & Nagel SC6) enthält. Die Säule wird mit deionisiertem Wasser eluiert, wobei 200 bis 300 Fraktionen (jeweils 25 ml) aufgefangen werden. Die Elution wird durch UV-Aktivität und Dünnschichtchromatographie überwacht. Die Fraktionen werden aufgrund der dünnschichtchromatographischen Identität vereinigt und gefriergetrocknet. Bei einigen Auftrennungen ist eine Verdoppelung der Länge der Säule (200 cm) erforderlich, indem man zwei in Reihe geschaltete und mit Polyamidgel gefüllte Säulen, verwendet. Durch wiederholte Chromatographie läßt sich eine weitere Reinigung erreichen..

Die oben unter A. bis F. beschriebenen Verfahren werden im einzelnen wiederholt, und zwar unter Verwendung des Stammes ATCC 31682, wenn man die Faktoren B, und C-, des Antibiotikums A-4696 isolieren möchte, unter Verwendung des Stammes ATCC 31680, wenn man die Faktoren B„ und C-des Antibiotikums A-4696 isolieren möchte, und unter Verwendung des Stammes ATCC 31683, wenn man die Faktoren B.. und E, des Antibiotikums A-4696 isolieren möchte. Zur Isolierung der oben erwähnten Faktoren lassen sich zwar auch andere Stämme von Actinoplanes verwenden, doch werden für die Isolierung der erfindungsgemäßen Faktoren des Antibiotikums A-4696 vorzugsweise die angegebenen Stämme herangezogen.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Hydrochloride der Faktoren B,, B₂, B.,, C-, , C-. und E, des Antibiotikums A-4696 unter Verwendung eines einzelnen Stammes von Actinoplanes missouriensis wird wie folgt durchgeführt.

Der getrocknete und entfärbte Komplex des Antibiotikums A-4696 (200 mg, hergestellt aus dem Stamm ATCC 31683 gemäß Beispiel 1, Stufen A. bis E.) wird in etwa 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene wäßrige Lösung

2 35 9 5 4 5

wird filtriert und durch Säulenchromatographie aufgetrennt, und zwar unter Verwendung von Umkehrphasenadsorbentien, wie

R beispielsweise Li Chroprep RP-I8* als stationäre Phase und wäßrigen Acetonitrilgradienten, die Triethylaminphosphat enthalten, als mobile Phase.. Vorzugsweise wird mit einer Gradientenkonzentration von 10 bis 40 % gearbeitet. Je nach der Zusammensetzung der jeweiligen Fermentationen kann der Fachmann die Acetonitrilgradienten-Konzentration natürlich ändern. Der Säulenabstrom wird durch UV-Aktivität überwacht, und die die einzelnen Faktoren enthaltenden Fraktionen werden .gesammelt. Das Acetonitril wird un-' ter Hochvakuum verdampft, und die erhaltenen wäßrigen Lösungen werden gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten chromatographischen Fraktionen werden in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wird auf Umkehrphasenad-

sorbentien, beispielsweise auf mit Sep Pak C18 gefüllte Patronen ** aufgegeben, die man mit 50 %-igem wäßrigem Methanol eluiert. Die die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 enthaltenden wäßrigen Lösungen werden zur Trockne eingedampft, worauf, man die gereinigten Faktoren des Antibiotikums A-4696 in Form trockener amorpher Feststoffe gewinnt.

* Erhältlich von E. Merck, Darmstadt, Deutschland ** Erhältlich von Waters Associates Inc., MiIford, Massachusetts, V.St.A.

Beispiel 2

Herstellung der Sulfatsalze der Faktoren B,, B„, B,, C, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696

Das Antibiotikum A-4696 (300 g/ hergestellt gemäß Beispiel 1, Stufen A. bis D.) wird in deionisiertem Wasser (2 1) suspendiert, und der pH-Wert der Suspension wird durch Zugabe von 3n wäßriger Schwefelsäure auf pH 2,7 einge-

stellt. Die angesäuerte Lösung wird 40 Minuten bei 2500 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und auf eine Säule (8 χ 85 cm) gegeben/ die 6.1 Entfärbungsharz (DuoIite S761) enthält. Die Aktivität wird mit deionisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Minute eluiert. Die Elution wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Der das Antibiotikum A-4696 enthaltende Säulenabstrom wird unter Vakuum (3 mm, 35⁰C) auf ein Volumen von 3 1 eingeengt und dann gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhält man den entfärbten Komplex in Form eines weißen bis lohfarbenen Feststoffs in einer Ausbeute von etwa .70 % (bezogen auf die entsprechende Bioaktivität). Die Sulfate der einzelnen Faktoren B,, B„, B^, C, , C-. und E, des Antibiotikums A-4696 werden nach dem in Beispiel 1 unter Stufe F. beschriebenen Verfahren isoliert.

Claims

J J J J 4 D

Erfindungsansprüche: . ' \

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes A-4δ96, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm ATCC 31680, ATCC 31682 oder ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet ist.
2. Verfahren nach Punkt .1, d a d u r c h g e kennzeichnet , daß man den Antibiotikumkomplex A-^4696 in einer weiteren Stufe aus dem Kulturmedium isoliert.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2,dadurch

ge.kenn ζ ei chnet , daß man den Faktor B, des

Antibiotikums A-4 696 oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon herstellt, wobei dieser Faktor B, in Form seines Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,51 % Kohlenstoff, 5,25 % Wasserstoff, 4,88 % Stickstoff, 4,62 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1954 aufweist, über ein Ul- traviolett-Absorptionsmaximum in Wasser bei 280 nm bei

1%
E, von 42,8 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3380 breit, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982,

880, 842, 831 und 810 cm , wobei dieser Faktor B, aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31682 oder ATCC 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.
4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man den Faktor B„ des Antibiotikums A-4696 oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon herstellt, wobei dieser Faktor B„ in Form seines Hydrochlorids eine weiße,kristalline Substanz ist_r die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusarnmensetzung von 51,96 % Kohlenstoff, 4,67 % Wasserstoff, 5,72 % Stickstoff, 5,88 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1808 aufweist, über ein Ultr.aviolett-Absorptionsmaximum in Wasser bei 280 nm bei

1%
E, von 44,7 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei. einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat; 3409 breit, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884 und 818 cm"¹, wobei dieser Faktor B„ aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31680 oder ATCC 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist,
5. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man den Faktor B₃ des Antibiotikums A-4696 oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon herstellt, wobei dieser Faktor B₃ in Form seines Hydrochlorids eine weiße,.kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie.polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, ali-

phatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,84 % Kohlenstoff, 4,74 % Wasserstoff, 5,83 % Stickstoff, 5,57 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1808 aufweist, über ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum in Wasser bei 280 nm bei

1 %
E, von 46,3 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3394 breit, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 und 816 cm , wobei dieser Faktor B, aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.

6'. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, d a d u r c h gekennzeichnet , daß man den Faktor C-. des Antibiotikums A-46 96 oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon herstellt, wobei dieser Faktor C, in Form seines Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffe^ eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 53,05 % Kohlenstoff, 4,74 % Wasserstoff, 5,83 % Stickstoff, 5,39 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1792 aufweist, über ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum in Wasser bei 279 nm bei

1%
E, von 47,9 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3380 breit, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814 und 715 cm"¹, wobei dieser Faktor C, aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31682 oder ATCC 31683 gebildeten Komplex

2 ^ Γ" Γ\ Γ" /

A-4696 isoliert worden ist.

Ί. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man den Faktor C, des Antibiotikums Ä-4696 oder ein pharmazeutsch unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon herstellt, wobei dieser Faktor C-. in Form seines Hydrochlorids eine weiße,kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,73 % Kohlenstoff, 4,69 % Wasserstoff, 5,94 % Stickstoff, 6,02 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, über ein ültraviolett-

1 % Absorptionsmaximum in Wasser bei 280 nm bei E, von 47,9 verfügt und im. Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3378 breit, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987," 965, 949, 878, 840, 816, 769 und 708 cm , wobei dieser Faktor C₃ aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31680 oder ATCC 31683 gebildeten Komplex A-469 6 isoliert worden ist.
8. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man den Faktor E, des Antibiotikums A-4696 oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon herstellt, wobei- dieser Faktor E, in Form seines Hydrochlorids eine weiße,kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 50,71 % Kohlenstoff, 4,70 % Wasserstoff, 9,01 % Stickstoff, 1,84 %

9 5 4 b

Chlor und Sauerstoff als Rest hat, über ein Ultraviolett-

Ab so rpt i on smax imum in Wasser bei 279 nm bei E.° von 39,9 ^ 1 cm

verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3394 breit, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738 und 714 cm"¹, wobei dieser Faktor C-. aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31863 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.
9. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 bis 8,dadurch gekennzeichnet,' daß es Actinoplanes missouriensis ATCC 31680 und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
10. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es Actinoplanes missouriensis ATCC 31682 und assimilierbar Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
11. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet _s. daß es Actinoplanes missouriensis ATCC 31683 und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.

Kernt ο Seilen Zeichnungen