AT249267B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Tuoromycin - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Tuoromycin 
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Antibiotikum, das im folgenden mit Tuoromycin bezeichnet wird. 



   Das Antibiotikum Tuoromycin entsteht bei der Kultur eines neuen Streptomyceten-Stammes, der aus einer bei Sao Paolo gesammeltenErdprobe isoliert wurde und keiner der bekanntenStreptomyces-Spezies zugeordnet werden kann. Der Stamm wird im folgenden S. tuirus A 31554 benannt und ist unter dieser Bezeichnung in unseren Laboratorien hinterlegt. Er wird unter der Bezeichnung S. tuirus n. sp. in Universidade de Recife, Instituto de Antibioticos, Recife (Brasilien), und unter der Nr. NRRL 3120 im United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, aufbewahrt. Der Stamm bildet Sporenketten in Quirlen, kurz, büschelförmig, meist gewellt, keine Spiralen. Die Sporen sind oval mit Achsenlängen von 1,22 und 2,45   .   Zur weiteren Charakterisierung wird das Wachstum auf verschiedenen Nährböden beschrieben. 



   1. Stärke-Agar
Wachstum sehr gut. Vegetatives Mycel farblos bis   crèmefarben ;   Luftmycel wollig, weiss, später hellgrau. Unlösliches purpurnes Pigment, das später weinrot wird und sehr stark in das Nährmedium diffundiert. Unterseite ganz dunkel. Bildet zu Beginn des Wachstums kleine separate Kolonien, die später verschmelzen. 



   2. Glycerin-Pepton-Agar
Gutes Wachstum. Vegetatives Mycel dunkelcrèmefarben bis bräunlich-rot. Luftmycel wollig, weiss, später bläulich-grau, mässig entwickelt. Starkes lösliches Pigment, kaffeebraun. Unterseite ganz dunkel. 



  Wächst anfangs in kleinen getrennten Kolonien, die sich später vereinigen. 



   3. Glycerin-Ammonium-Agar
Gutes Wachstum. Vegetatives Mycel cremefarben, später rot. Das Luftmycel entwickelt sich spät, ist wollig, weiss, wird grau. Unlösliches rotes Pigment. Unterseite stark rot. Wächst anfangs in kleinen getrennten Kolonien, die sich später vereinigen. 



   4. Gelatine-Agar
Mässiges Wachstum, wässerig, glänzend. Vegetatives Mycel farblos bis cremefarben. Kein Luftmycel. Lösliches Pigment gelbbraun. 



   5. Glucose-Asparagin-Agar
Gutes Wachstum, Kolonien anfangs crèmefarben, später rot. Luftmycel entwickelt sich spät, wollig, weiss bis grau. Unterseite rot. Unlösliches rotes Pigment. 



   6. Melaninbildendes Medium
Gutes Wachstum. Luftmycel wollig, weiss bis hellgrau. Melaninbildung. 



   7. Stärke-Casein-Agar
Sehr gutes Wachstum. Kolonien anfangs cremefarben mit erhobenem rotem Zentrum, später durchgehend rot. Luftmycel wollig, hellgrau. Unlösliches weinrot-purpurnes Pigment, das später ins Nährmedium diffundiert. Unterseite ganz dunkel. 



   8. Kartoffelpfropfen
Mässiges Wachstum. Vegetatives Mycel   gelblich-crèmefarben.   Luftmycel weiss. Pfropfen dunkel. 

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   9. Nähragar
Mässiges Wachstum. Vegetatives Mycel wässerig, glänzend, farblos, später purpurn. Wächst anfangs als farblose Kolonien mit purpurnem Zentrum. Kein Luftmycel. Lösliches gelbbraunes Pigment. 



   10. Sucrose-Nitrat-Agar
Vegetatives Mycel sehr gut entwickelt. Wächst anfangs als farblose Kolonien, die von einem purpurnen unlöslichen Pigment umgeben sind. Wird später durchgehend purpurn. Das unlösliche Pigment wird weinrot-purpum und diffundiert stark in das Nährmedium. Kein Luftmycel. 
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Vegetatives Mycel sehr gut entwickelt. Kolonien farblos mit erhobenem Zentrum. Unlösliches rotes
Pigment. Kein Luftmycel. 



   12. Kartoffel-Glucose-Agar
Sehr gutes Wachstum. Kolonien anfangs cremefarben. Werden später rot. Das Zentrum der älteren
Kolonien wird purpurrot. Luftmycel wollig, weiss bis grau, entwickelt sich spät. Unterseite purpurn. 



   Unlösliches Pigment anfangs rot, dann weinrot-purpurrot werdend (weniger stark als in   Czapek's   Medium). 



   13. Kartoffel-Glycerin-Agar
Sehr gutes Wachstum. Ineinander   übergehende Kolonien   mit bräunlich-rotem (rostfarbenem) Zentrum und roten Rändern. Wächst runzelig. Luftmycel wollig, weiss bis grau, entwickelt sich spät. Dunkelbrau- nes lösliches Pigment, fast schwarz. Unterseite schwarz. 



   14.   Kartoffelbrei-Hafermehl-Agar  
Sehr gutes Wachstum. Kolonien mit vegetativem Mycel purpurrot. Luftmycel grauweiss, wollig. 



   Exudattröpfchen auf dem Luftmycel. Unlösliches Pigment weinrot-purpurn. 



   Nitrat wird stark reduziert. Keine Hydrolyse von Stärke. Schnelle Peptonisierung von Milch. Folgen- de Kohlenstoffquellen werden verwertet : Xylose, Arabinose, Glucose,   D (+)-Mannose, Glactose, D (-)-Fruc-   tose, L (+)-Rhamnose, Trehalose, Sucrose, Lactose, Maltose, D (+)-Raffinose, Inosit, Mannit, Glycerin,
Natriumsuccinat. 



   Das Antibiotikum Tuoromycin wird aus dem Mycel des Stammes   S. tuirus   A 31554 als rubinfarbige Verbindung erhalten. Es ist löslich in Butanol, Aceton u. a. lipophilen Lösungsmitteln. Das UV- Spektrum des erhaltenen Rohproduktes in Äthanol ist in   Fig. l,   das   IR-Spektrum   in Kaliumbromid in Fig. 2 dargestellt. 



   Zur Erzeugung des Antibiotikums Tuoromycin wird der Stamm S. tuirus A 31554 in wässeriger, eine   Kohlenstoff-und Stickstoffquelle   sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung bei 18-400, vorzugsweise 270, unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise submers, gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung aufweist, und das Antibiotikum Tuoromycin hierauf, vorzugsweise durch Extraktion mit Aceton, aus dem Mycel isoliert. 



     Als Kohlenstoff- und Stickstoff quelle   kommen z. B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Alkohole,   wieMannit, Glycerin, Aminosäuren, z. B.   Glycin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder   Trypton,   Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung,   Comsteep-liquor,   Hefe, Samen, insbesondere der Raps-und Sojapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze, Nitrate in Frage. An anorganischenSalzen enthält   die Nährlösung beispielsweise Chloride,   Carbonate, Sulfate, Nitrate, Phosphate von Alkali- und Erdalkalimetallen, von Magnesium, Zink, Mangan, Eisen. 



   Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18   und 400C,   vorzugsweise   270C.   Nach 3-6 Tagen wird das Mycel abgetrennt und in noch feuchtem Zustand unter starkem Schütteln mit Aceton behandelt, bis der rote Farbstoff vollständig extrahiert ist. Aus den so erhaltenen Extrakten wird das rotgefärbte Tuoromycin nach bekannten Methoden isoliert, beispielsweise durch Eindampfen und Chromatographie oder durch   Fällung,   beispielsweise mit Petroläther. Das Rohprodukt kann beispielsweise durch Gegenstromverteilung gereinigt und in kristallisierter Form erhalten werden.

   Man kann das rohe Antibiotikum auch direkt aus einem geeigneten organischen   Lösungsmittel,     z. B. Chloroform,   Methylenchlorid, Dimethylsulfoxyd, durch   Zufugen   eines weniger guten Lösungsmittels, z. B. Methanol oder Äthanol, vorzugsweise nach Animpfen mit einigen Kristallen, kristallisieren. Violette Nadeln vom F.   216 -2200.   Die Substanz ist schwach sauer ; sie bildet Salze mit Alkalihydroxyden. 



   Tuoromycin ist praktisch unlöslich in Wasser, verd. Mineralsäure, Diäthyläther, Hexan ; schwach löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Tetrachlorkohlenstoff, verd.   Sodalösung ;   mässig löslich in Aceton, Äthylacetat, Propylenglykol,   Polyäthylenglykol,     Methylcellosolve ;   gut löslich in Benzol, Di-   oxan,   Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylsulfoxyd, verd. Alkali. 

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C13,   73,-14, 00 li   (vgl.   Fig. 2).   



   Dünnschichtchromatogramm an Silicagel : im System Chloroform-Methanol (8 : 2) Rf = 0, 85 ; im System Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser (50: 30: 10   : 10) Rf= 0, 75 ;   Papierchromatogramm : im System Benzol-Chloroform (2 : 1), Papier imprägniert mit 20% Formamid in Aceton, Rf=0, 7. 



   Das Antibiotikum Tuoromycin und seine Salze besitzen eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegen- über grampositiven Mikroorganismen und eine gute Wirkung gegen Candida albicans, vgl. Tabelle 1. 



   Tabelle 1 
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<tb> 
<tb> Mikroorganismen <SEP> Aktivität <SEP> (y/ml)
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 06-0, <SEP> 08
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> W <SEP> 0, <SEP> 06- <SEP> 0, <SEP> 08
<tb> Br. <SEP> suis <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 3, <SEP> 0
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> > <SEP> 30,0
<tb> N. <SEP> asteroides <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 3, <SEP> 0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> > <SEP> 50, <SEP> 0
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> > <SEP> 50,0
<tb> Pr. <SEP> vulgaris <SEP> > <SEP> 50, <SEP> 0
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 50, <SEP> 0
<tb> C. <SEP> albicans, <SEP> IBB-50 <SEP> 10, <SEP> 0-20, <SEP> 0
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In vivo weist das Antibiotikum eine antitumorale Wirkung gegenüber dem Walker Carzinom 256 bei der Prüfung an weissen Ratten (Sprague Dawley) auf (mehr als   60loge   Hemmung bei 10tägiger Behandlung mit 50 mg/kg s.

     c.).   Die Toxizität des neuen Antibiotikums ist gering. Mäuse vertragen 1 x 1000 mg/kg s. c. ohne Schaden. 



   Das Antibiotikum Tuoromycin kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten das Antibiotikum in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit dem Antibiotikum nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgierungsmittel.

   Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. 



   Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. 



     Beispiel l :   Der Stamm S. tuirus A 31554 wird unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung gezüchtet, die pro Liter Leitungswasser 20 g Sojamehl, 2 g Calciumcarbonat und 5 g Natriumchlorid enthält. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein PH von 6,7 bis 6, 9. Die Animpfung erfolgt mit einer Kultur, die auf Czapekmedium mit halber Salzkonzentration in Erlenmeyerkolben von 125 ml gezüchtet wurde. Ein Achtel dieser Kultur wird jeweils in Fernbachflaschen von 2000 ml Inhalt mit 300 ml Nährlösung übertragen. Nach 96 h Inkubation unter Schütteln (180 Umdr/min) wird filtriert. Man erhält zirka   1CF/o   feuchtes Mycel. Das so erhaltene rote Mycel wird unter starkem Schütteln mit Aceton extrahiert, bis kein Farbstoff mehr im Mycel vorhanden ist.

   Die rotgefärbten Extrakte werden im Vakuum auf etwa 1/10 des Volumens eingedampft, dann mit Cellulosepulver (Whatman) vermischt und im Vakuum getrocknet. Man siebt das Produkt und bringt es auf eine Cellulosesäule, so dass es 1/3 der Säulenlänge einnimmt. Das Chromatogramm wird mit Chloroform bei Normaldruck entwickelt, bis das Lösungsmittel mit hellroter Farbe wandert. Der durchlaufende Chloroformanteil wird filtriert, im Vakuum eingeengt und mit Petrol- 

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 äther gefällt. Man wäscht den Niederschlag mit Naphtha (hochsiedendem Benzin), bis dieses farblos abläuft, und trocknet ihn dann im Vakuum. Das so erhaltene amorphe Tuoromycin von rubinroter Farbe (vgl.

   A Dictionary of Color, Maerz and Paul) zeigt eine Wirksamkeit von 0,04 bis 0,06   Y/ml   gegen B. subtilis 9 und S. aureus W. 
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 = 630) ; 315 mg13,   73 ; 14,   00   J1   (vgl.   Fig. 2).   



     Beispiel 2: 1   g der in Beispiel 1 erhaltenen amorphen Substanz wird einer Gegenstromverteilung (Craig-Maschine) in einem System, bestehend aus 36 Vol. -Teilen Methanol und 9 Vol. -Teilen Wasser als oberer Phase und je   22,5 Vol. -Teilen   Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff als unterer Phase, unterworfen. Die Substanz wird dazu in je 500   m1   oberer und unterer Phase gelöst und in fünf Rohre zu je 100   m1   Phasenvolumen eingefüllt. Dann verteilt man über 400 Stufen. Die Fraktionen   0 - 110   werden einzeln im Vakuum zur Trockne eingedampft und gewogen, die oberen Phasen der Fraktionen mit höheren Nummern fasst man beim Verlassen der Maschine in Serien zu 10 bzw. 30 zusammen und behandelt sie analog. 



   Eine zuerst hellrote, dann in carminrot übergehende Färbung, verbunden mit langsamer Gewichtszunahme der Fraktionen, lässt sich zwischen den Rohren Nr. 47-74 beobachten. Dann erfolgt ein steiler Gewichtsanstieg bis zu Rohr Nr. 86 und ein ebenso steiler Abfall bis zu Rohr Nr. 95, wobei die Farbe auf violett umschlägt. Bei den Rohren mit höheren Nummern verflacht sich die Gewichtskurve, und die Farbe geht in ein dunkles Violett über. 



   Wie aus der dünnschicht-und papierchromatographischen Prüfung hervorgeht, bestehen die Fraktionen 75-95 aus einer einzigen Substanz und stellen zirka 601o des Gewichtes des eingesetzten Materials dar. Man löst die Substanz in einem möglichst kleinen Volumen eines Gemisches aus 9   Vol.-Teilen   Chloroform und 1 Vol.-Teil Methanol unter ganz leichtem Erwärmen auf und lässt die Lösung einige Zeit im Kühlschrank verschlossen stehen. Dabei bilden sich violette Nadeln vom   F.     216-220    (Koflerblock). 



   Beispiel 3 : 10 g der in Beispiel 1 erhaltenen amorphen Substanz werden in 75 ml eines Gemisches aus 9 Vol.-Teilen Chloroform und 1   Vol.-Teil   Methanol fein verteilt und kurz geschüttelt. Dannwird mit Kristallen aus Beispiel 2 angeimpft und in einer Atmosphäre   von Stickstoff und unter Lichtausschuss   während einer Stunde weiter geschüttelt, wobei sich der Kolben bald mit einer kristallinen Masse füllt. 



  Man lässt über Nacht bei 20 im Kühlschrank stehen und filtriert dann ab. Das Rohkristallisat ist papierchromatographisch schon weitgehend rein und entspricht etwa 70   Gew.- des   eingesetzten Materials. 



  Die Mutterlauge enthält nur noch eine geringe Menge der kristallisierenden Substanz. Durch Auflösen des 
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 weiter reinigen. Vorsicht ist jedoch geboten, da das Antibiotikum in diesem Lösungsmittel gegen Licht und Luft empfindlich ist. 



   Die Substanz ergibt bei der Elementaranalyse folgende Werte : C = 57,1%; 57,33%; H=3,63%; 3,68%;   0 (her.) = 39, 20% ; 38, 99%.   F. 216-220 . 
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 :Dünnschichtchromatogramm an Silicagel : im System Chloroform-Methanol (8 : 2)   Rf=   0,   85 ;   im   System Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser (50 :   30 : 10 : 10) Rf= 0,   75 ; Papierchromato-   gramm : im System Benzol-Chloroform (2   : 1),   Papier imprägniert mit 20% Formamid in Aceton, Rf= 0,7. 
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 in Methanol, Äthanol,   n-Butanol,   Tetrachlorkohlenstoff, verd.

   Sodalösung ; mässig löslich in Aceton, Äthylacetat, Propylenglykol,   Polyäthylenglykol,     Methylcellosolve ; gut löslich   in Benzol, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylsulfoxyd, verd. Alkali. 



   Beispiel 4 : 10 g der in Beispiel 1 erhaltenen amorphen Substanz werden in 175 ml eines Gemisches aus 9   Vol.-Teilen   Chloroform und 1   Vol.-Teil   Methanol unter leichtem Erwärmen gelöst. Dann wird mit den aus Beispiel 2 gewonnenen Kristallen angeimpft und   36   h im Dunkeln bei 20 stehen gelassen. Das dabei gebildete Kristallisat nutscht man ab. Wird dieser kristalline Rückstand mit 100 ml des gleichen Lösungsmittelgemisches fein verrieben und noch 1/2   himDunkeln und unterStickstoff   geschüttelt, 

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