DE1209701B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Tuoromycin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

de,' ncursc*^;p

PATEHTASiTtS

Int. α.:

C12d

Deutsche Ki.: 30h-6

Nummer: 1 209 701

Aktenzeichen: C 32745IV a/30 h

Anmeldetag: 28. April 1964

Auslegetag: 27. Januar 1966

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Antibiotikum, das im folgenden mit Tuoromycin bezeichnet wird.

Das Antibiotikum Tuoromycin entsteht bei der Kultur eines neuen Streptomyceten-Stammes, der aus einer bei Säo Paolo gesammelten Erdprobe isoliert wurde und keiner der bekannten Streptomyces-Spezies zugeordnet werden kann. Der Stamm wird im folgenden S. tuirus A 31554 benannt und ist unter dieser Bezeichnung in unseren Laboratorien hinterlegt. Er wird unter der Bezeichnung S. tuirus n. sp. in Univer- *° sidade de Recife, Instituto de Antibioticos, Recife (Brasilien), und unter der Nummer NRRL 3120 im United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, aufbewahrt. Der Stamm bildet Sporenketten in Quirlen, kurz, büschelförmig, meist gewellt, keine Spiralen. Die Sporen sind oval mit Achsenlängen von 1,22 und 2,45 μ. Zur weiteren Charakterisierung wird das Wachstum auf verschiedenen Nährböden beschrieben.

1. Stärke-Agar: Wachstum sehr gut. Vegetatives Mycel farblos bis cremefarben. Luftmycel wollig, weiß, später hellgrau. Unlösliches purpurnes Pigment, das später weinrot wird und sehr stark in das Nährmedium diffundiert. Unterseite ganz dunkel. Bildet zu Beginn des Wachstums kleine separate Kolonien, die später verschmelzen.

2. Glycerin-Pepton-Agar:

Gutes Wachstum. Vegetatives Mycel dunkelcremefarben bis bräunlichrot. Luftmycel wollig, weiß, später bläulichgrau, mäßig entwickelt. Starkes lösliches Pigment, kaffeebraun. Unterseite ganz dunkel. Wächst anfangs in kleinen getrennten Kolonien, die sich später vereinigen.

3. Glycerin-Ammonium-Agar: Gutes Wachstum. Vegetatives Mycel cremefarben, später rot. Das Luftmycel entwickelt sich spät, ist wollig, weiß, wird grau. Unlösliches rotes Pigment. Unterseite stark rot. Wächst anfangs in kleinen getrennten Kolonien, die sich später vereinigen.

4. Gelatine-Agar:

Mäßiges Wachstum, wäßrig, glänzend. Vegetatives Mycel farblos bis cremefarben. Kein Luftmycel. Lösliches Pigment gelbbraun.

5. Glucose-Asparagin-Agar: Gutes Wachstum. Kolonien anfangs cremefarben, später rot. Luftmycel entwickelt sich spät, wollig, weiß bis grau. Unterseite rot. Unlösliches rotes Pigment.

6. Melaninbildendes Medium: Gutes Wachstum. Luftmycel wollig, weiß bis hellgrau. Melaninbildung.

Verfahren zur Herstellung des neuen
Antibiotikums Tuoromycin

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies,

Dr. rer. nat. B. Redies und Dr. rer. nat. D. Türk,

Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr. 27

Als Erfinder benannt:

Oswaldo Goncalves de Lima,

Marisa Machado Albuquerque,

Lizete Oliveira,

Jose Sidney de Barros Coelho,

Francisco Decio de Andrade Lyra,

Vilneyde Mabel Queiroz,

Carlos Antonio Albert,

Gesse Medeiros Maciel, Recife (Brasilien)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 29. April 1963 (5351)

7. Stärke-Casein-Agar:

Sehr gutes Wachstum. Kolonien anfangs cremefarben mit erhobenem rotem Zentrum, später durchgehend rot. Luftmycel wollig, hellgrau. Unlösliches weinrot-purpurnes Pigment, das später ins Nährmedium diffundiert. Unterseite ganz dunkel.

8. Kartoffelpfropfen:

Mäßiges Wachstum. Vegetatives Mycel gelblichcremefarben; Luftmycel weiß. Pfropfen dunkel.

9. Nähragar:

Mäßiges Wachstum. Vegetatives Mycel wäßrig, glänzend, farblos, später purpurn. Wächst anfangs als farblose Kolonien mit purpurnem Zentrum. Kein Luftmycel. Lösliches gelbbraunes Pigment. 10. Sucrose-Nitrat-Agar:

Vegetatives Mycel sehr gut entwickelt. Wächst anfangs als farblose Kolonien, die von einem purpurnen unlöslichen Pigment umgeben sind. Wird später durchgehend purpurn. Das unlösliche Pigment wird weinrot-purpurn und diffundiert stark in das Nährmedium. Kein Luftmycel.

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3 4

11. Glycerin-Caldummalat-Agar: gefärbte Tuoromycin nach bekannten Methoden Vegetatives Mycel sehr gut entwickelt. Kolonien isoliert, beispielsweise durch Eindampfen und Chrofarblos mit erhobenem Zentrum. Unlösliches rotes matographie oder durch Fällung, beispielsweise mit Pigment. Kein Luftmycel. Petroläther. Das Rohprodukt kann beispielsweise

12. Kartoffel-Glucose-Agar: 5 durch Gegenstromverteilung gereinigt und in kristalli-Sehr gutes Wachstum. Kolonien anfangs creme- sierter Form erhalten werden. Man kann das rohe farben. Werden später rot. Das Zentrum der Antibiotikum auch direkt aus einem geeigneten orgaälteren Kolonien wird purpurrot. Luftmycel wol- nischen Lösungsmittel, z. B. Chloroform, Methylenlig, weiß bis grau, entwickelt sich spät. Unterseite chlorid, Dimethylsulfoxyd, durch Zufügen eines wenipurpurn. Unlösliches Pigment anfangs rot, dann io gergutenLösungsmittels, z.B. Methanol oder Äthanol, weinrot-purpurrot werdend (weniger stark als in vorzugsweise nach Animpfen mit einigen Kristallen, Czapeck's Medium). kristallisieren. Violette Nadeln vom F. 216 bis 220⁰C.

13. Kartoffel-Glycerin-Agar: Die Substanz ist schwach sauer; sie bildet Salze mit Sehr gutes Wachstum. Ineinander übergehende Alkalihydroxyden.

Kolonien mit bräunlichrotem (rostfarbenem) 15 Tuoromycin ist praktisch unlöslich in Wasser, verZentrum und roten Rändern. Wächst runzlich. dünnter Mineralsäure, Diäthyläther, Hexan, schwach Luftmycel wollig, weiß bis grau, entwickelt sich Jöslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Tetrachlorspät. Dunkelbraunes lösliches Pigment, fast kohlenstoff, verdünnter Sodalösung, mäßig löslich in schwarz. Unterseite schwarz. Aceton, Äthylacetat, Propylenglykol, Polyäthylen-

14. Kartoffelbrei-Hafermehl-Agar: 20 glykol, Methylcellosolve, gut löslich in Benzol, Dioxan, Sehr gutes Wachstum. Kolonien mit vegetativem Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylsulfoxyd, ver-Mycel purpurrot. Luftmycel grauweiß, wollig. dünntem Alkali.

Exudattröpfchen auf dem Luftmycel. Unlösliches Elementaranalyse: C = 57,17%, 57,33%;

Pigment weinrot-purpurn. H=3,63%, 3,68%; O(berechnet)=39,20%, 38,99%.

Nitrat wird stark reduziert. Keine Hydrolyse von 25 Das UV-Spektrum in Äthanol weist Maxima auf Stärke. Schnelle Peptonisierung von Milch. Folgende bei 240 ηιμ (Eil = 700), 313 ΐημ (Eil = 343), 347 πιμ Kohlenstoffquellen werden verwertet: Xylose, Arabi- (Ei?« = 205) und 360πιμ (Eil = 185) (vgl. Fig. 1). nose, Glucose, D(+)-Mannose, Glactose, d(—)-Fruc- Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter

tose, L(+)-Rhamnose, Trehalose, Sucrose, Lactose, anderem Banden bei 2,91, 3,39, 5,73, 5,89, 6,14, 6,87, Maltose, D(+)-Raffinose, Inosit, Mannit, Glycerin, 30 7,21, 7,43, 7,89, 8,10, 8,76, 9,70, 10,13, 10,54, 10,85, Natriumsuccinat. 11,70, 12,50, 12,73, 13,08, 13,35, 13,73 und 14,00 μ

Das Antibiotikum Tuoromycin wird aus dem Mycel (vgl. Fig. 2).

des Stammes S. tuirus A 31554 als rubinfarbige Ver- DünnsctachtchromatogrammanSilicagel: Im System

bindung erhalten. Es ist löslich in Butanol, Aceton Chloroform—Methanol (8:2) Rf = 0,85, im System und anderen lipophilen Lösungsmitteln. Das UV- 35 Äthylacetat—Methyläthylketon—Ameisensäure—Was-Spektrum des erhaltenen Rohproduktes in Äthanol ser (50: 30:10:10) Rf = 0,75.
ist in Fig. 1, das IR-Spektrum in Kaliumbromid in Papierchromatogramm: Im System Benzol—Chloro-

Fig. 2 dargestellt. form (2:1), Papier imprägniert mit 20% Formamid

Zur Erzeugung des Antibiotikums Tuoromycin wird in Aceton, Rf = 0,7.

der Stamm S. tuirus A 31554 in wäßriger, eine Kohlen- 40 Das Antibiotikum Tuoromycin und seine Salze stoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze besitzen eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegenenthaltender Nährlösung gezüchtet, bis diese eine über grampositiven Mikroorganismen und eine gute wesentliche antibakterielle Wirkung aufweist, und Wirkung gegen Candida albicans (vgl. Tabelle),
das Antibiotikum Tuoromycin hierauf isoliert.

Als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle kommen z. B. 45 Tabelle

Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Alkohole, wie Mannit, Glycerin, Aminosäuren, ζ. Β. Glycin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais so oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Cornsteep-liquor, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Soyapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze, Nitrate in Frage. An anorganischen Salzen enthält die Nährlösung beispielsweise Chloride, 55 Carbonate, Sulfate, Nitrate, Phosphate von Alkali- und Erdalkalimetallen, von Magnesium, Zink, Mangan, Eisen.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in
ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise sub- 60 In vivo weist das Antibiotikum eine antitumorale mers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Wirkung gegenüber dem Walker-Carzinom 256 bei Sauerstoff in Schüttelfiaschen oder den bekannten der Prüfung an weißen Ratten (Sprague Dawley) auf Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche (mehr als 60%ig^e Hemmung bei lOtägiger Behandlung zwischen 18 und 40⁰C, vorzugsweise 27⁰C. Nach mit 50 mg/kg s. c). Die Toxizität des neuen Anti-3 bis 6 Tagen wird das Mycel abgetrennt und in noch 65 biotikums ist gering. Mäuse vertragen 1 · 1000 mg/kg feuchtem Zustand unter starkem Schütteln mit Aceton s. c. ohne Schaden.

behandelt, bis der rote Farbstoff vollständig extrahiert Das Antibiotikum Tuoromycin kann als Heilmittel,

ist. Aus den so erhaltenen Extrakten wird das rot- z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwen-

Mikroorganismen	Aktivität (y/ml)
B. subtil 9 S. aureus W Br. suis	0,06 bis 0,08 0,06 bis 0,08 1,0 bis 3,0 >30,0 1,0 bis 3,0 >50,0 >50,0 >50,0 >50,0 10,0 bis 20,0
Mycobacterium 607 N. asteroides E. coli
K. pneumoniae Pr. vulgaris Ps. aeruginosa C. albicans, IBB-50

5 6

dung finden. Diese enthalten das Antibiotikum in dazu in je 500 ml oberer und unterer Phase gelöst und

Mischung mit einem für die enterale oder parenterale in fünf Rohre zu je 100 ml Phasenvolumen eingefüllt.

Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen Dann verteilt man über 400 Stufen. Die Fraktionen 0

oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe bis 110 werden einzeln im Vakuum zur Trockne ein-

kommen solche Stoffe in Betracht, die mit dem Anti- 5 gedampft und gewogen, die oberen Phasen der Frak-

biotikum nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milch- tionen mit höheren Nummern faßt man beim Verlassen

zucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Öle, der Maschine in Serien zu zehn bzw. dreißig zusammen

Benzylalkohol oder andere bekannte Arzneimittel- und behandelt sie analog.

träger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. Eine zuerst hellrote, dann in carminrot übergehende

als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien oder in io Färbung, verbunden mit langsamer Gewichtszunahme

flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emul- der Fraktionen, läßt sich zwischen den Rohren Nr. 47

sionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert bis 74 beobachten. Dann erfolgt ein steiler Gewichts-

und/oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs- anstieg bis zu Rohr Nr. 86 und ein ebenso steiler

mittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgierungsmittel. Abfall bis zu Rohr Nr. 95, wobei die Farbe auf Violett

Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle 15 umschlägt. Bei den Rohren mit höheren Nummern

Stoffe enthalten. verflacht sich die Gewichtskurve und die Farbe geht

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen in ein dunkles Violett über.

beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden Wie aus der dünnschicht- und papierchromatogra-

angegeben. phischen Prüfung hervorgeht, bestehen die Fraktionen

B e i s D i e 1 1 20 75 bis 95 aus einer einzigen Substanz und stellen etwa

60% des Gewichtes des eingesetzten Materials dar.

Der Stamm S. tuirus A 31554 wird unter aeroben Man löst die Substanz in einem möglichst kleinen Bedingungen in einer Nährlösung gezüchtet, die pro Volumen eines Gemisches aus 9 Volumteilen Chloro-Liter Leitungswasser 20 g Sojamehl, 2 g Calcium- form und 1 Volumteil Methanol unter ganz leichcarbonat und 5 g Natriumchlorid enthält. Die sterili- 25 tem Erwärmen auf und läßt die Lösung einige Zeit sierte Nährlösung zeigt ein pH von 6,7 bis 6,9. Die im Kühlschrank verschlossen stehen. Dabei bilden Animpfung erfolgt mit einer Kultur, die auf Czapek- sich violette Nadeln vom F. 216 bis 220° (Koflerblock). medium mit halber Salzkonzentration in Erlenmeyer- . .
kolben von 125 ml gezüchtet wurde. Ein Achtel dieser Beispiel 3
Kultur wird jeweils in Fernbachflaschen von 2000 ml 30 10 g der im Beispiel 1 erhaltenen amorphen Sub-Inhalt mit 300 ml Nährlösung übertragen. Nach stanz werden in 75 ml eines Gemisches aus 9 Volum-96 Stunden Inkubation unter Schütteln (180 U/Min.) teilen Chloroform und 1 Volumteil Methanol fein verwird filtriert. Man erhält etwa 10% feuchtes Mycel. teilt und kurz geschüttelt. Dann wird mit Kristallen Das so erhaltene rote Mycel wird unter starkem aus Beispiel 2 angeimpft und in einer Atmosphäre von Schütteln mit Aceton extrahiert, bis kein Farbstoff 35 Stickstoff und unter Lichtausschuß während einer mehr im Mycel vorhanden ist. Die rotgefärbten Stunde weiter geschüttelt, wobei sich der Kolben bald Extrakte werden im Vakuum auf etwa ein Zehntel mit einer kristallinen Masse füllt. Man läßt über des Volumens eingedampft, dann mit Cellulosepulver Nacht bei 2° im Kühlschrank stehen und filtriert (W h a t m a n) vermischt und im Vakuum getrock- dann ab. Das Rohkristallisat ist papierchromatogranet. Man siebt das Produkt und bringt es auf eine 40 phisch schon weitgehend rein und entspricht etwa Cellulosesäule, so daß es ein Drittel der Säulenlänge 70 % Gewichtsprozent des eingesetzten Materials. Die einnimmt. Das Chromatogramm wird mit Chloroform Mutterlauge enthält nur noch eine geringe Menge der bei Normaldruck entwickelt, bis das Lösungsmittel kristallisierenden Substanz. Durch Auflösen des Rohmit hellroter Farbe wandert. Der durchlaufende kristallisats im obenerwähnten Chloroform-Methanol-Chloroformanteil wird filtriert, im Vakuum eingeengt 45 Gemisch, Behandeln mit wenig Aktivkohle, Hyflo-Fil- und mit Petroläther gefällt. Man wäscht den Nieder- tration der Lösung, Einengen des Filtrates und anschlag mit Naphtha (hochsiedendem Benzin), bis schließende Kristallisation läßt sich die Substanz dieses farblos abläuft, und trocknet ihn dann im weiter reinigen. Vorsicht ist jedoch geboten, da das Vakuum. Das so erhaltene amorphe Tuoromycin von Antibiotikum in diesem Lösungsmittel gegen Licht rubinroter Farbe (vgl. A Dictionary of Color, M a e r ζ so und Luft empfindlich ist.

and Paul) zeigt eine Wirksamkeit von 0,04 bis Die Substanz ergibt bei der Elementaranalyse fol-

0,06 y/ml gegen B. subtilis 9 und S. aureus W. gende Werte: C = 57,17%, 57,33%; H = 3,63%,

Das UV-Spektrum weist Maxima bei λ = 239 ηιμ 3,68%; O (berechnet) = 39,20%, 38,99%. F. 216

(Eil = 630), 315 πιμ (E& = 310), 346 πιμ (Effi, = bis 220°.

180) und 360 ηιμ (E}*_m = 160) auf. 55 IR-Spektrum im Kaliumbromid: Wie im Beispiel 1

Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter angegeben.

anderem Banden bei 2,91, 3,39, 5,73, 5,89, 6,14, 6,87, UV-Spektrum: Maxima bei 240 πιμ (EU = 700),

7,21, 7,43, 7,89, 8,10, 8,76, 9,70, 10,13, 10,54, 10,85, 313 ηψ (E& = 343), 347 ηιμ, (EU = 205) und 360 ηιμ

11,70, 12,50, 12,73, 13,08, 13,35, 13,73 und 14,00 μ (Ei«, = 185) (vgl. F i g. 1).

(vgl. Fig. 2). 60 Dünnschichtchromatogramm an Silicagel: Im System

Beispiel 2 Chloroform—Methanol (8:2) Rf = 0,85, im System

Äthylacetat-Methyläthylketon-Ameisensäure—Was-

1 g der im Beispiel 1 erhaltenen amorphen Substanz ser (50: 30:10:10) Rf = 0,75.

wird einer Gegenstromverteilung (Craig-Maschine) in Papierchromatogramm: Im System Benzol—Chloro-

einem System, bestehend aus 36 Volumteilen Methanol 65 form (2:1), Papier imprägniert mit 20% Formamid in

und 9 Volumteilen Wasser als oberer Phase und je Aceton, Rf = 0,7.

22,5 Volumteilen Chloroform und Tetrachlorkohlen- Löslichkeit: Praktisch unlöslich in Wasser, verdünn-

stoff als unterer Phase unterworfen. Die Substanz wird ter Mineralsäure, Diäthyläther, Hexan; schwachlös-

Claims (1)

1. 7 8

   lieh in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Tetrachlor- Ansätze erhält man 7501 Kulturlösung, die mit 15 kg

   kohlenstoff, verdünnter Sodalösung; mäßig löslich in Hyflo-Supercel versetzt und durch eine Filterpresse

   Aceton, Äthylacetat, Propylenglykol, Polyäthylen- nitriert werden. Es resultieren 184 kg feuchter Filter-

   glykol, Methylcellosolve; gut löslich in Benzol, Dioxan, kuchen. Das Kulturfiltrat wird verworfen. Man rührt

   Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylsulfoxyd, ver- 5 den Filterkuchen viermal mit je 1201 90%igem _Wäß-

   dünntem Alkali. rigem Aceton je 2 Stunden lang aus und trennt die

   Beispiel 4 Lösung jeweils durch Zentrifugation ab. Das Mycel

   wird zuletzt verworfen. Die vereinigten Acetonextrakte

   10 g der im Beispiel 1 erhaltenen amorphen Substanz und Waschflüssigkeiten ergeben ein Volumen von

   werden in 175 ml eines Gemisches aus 9 Volumteilen ίο 5401. Diese Lösung wird bei maximal 30° in einem

   Chloroform und 1 Volumteil Methanol unter leich- Vakuum-Zirkulationsverdampfer auf 1001 eingeengt,

   tem Erwärmen gelöst. Dann wird mit den aus Bei- Dann stellt man das pH des Konzentrates mittels

   spiel 2 gewonnenen Kristallen angeimpft und 36 Stun- 2 η-Schwefelsäure auf 3,7 ein und extrahiert dasselbe

   den im Dunkeln bei 2° stehengelassen. Das dabei zweimal mit je 501 Chloroform und einmal mit 251

   gebildete Kristallisat nutscht man ab. 15 Chloroform durch Ausrühren. Die wasserhaltige

   Wird dieser kristalline Rückstand mit 100 ml des (obere) Phase wird abgetrennt und verworfen. Die

   gleichen Lösungsmittelgemisches fein verrieben und Chloroformphase wird bei 25° im Vakuum auf 201

   noch V₂ Stunde im Dunkeln und unter Stickstoff eingeengt. Aus diesem Chloroformkonzentrat wird

   geschüttelt, so erhält man ein Kristallisat, das die in das Antibiotikum durch Eingießen in 601 Petroläther

   den Beispielen 2 und 3 angegebenen Eigenschaften so (Siedepunkt 40 bis 60°) ausgefällt. Das Präcipitat wird

   aufweist. abgenutscht, mit Petroläther gewaschen und bei 30°

   Beispiel 5 ™ Vakuum getrocknet. Man erhält 159 g rubinrotes

   amorphes Pulver, das die Eigenschaften des im Bei-

   Der Stamm S. tuirus A 31554 wird unter aeroben spiel 1 beschriebenen Produktes besitzt und sich gemäß

   Bedingungen in einer Nährlösung gezüchtet, die pro 25 den Beispielen 2 bis 4 kristallisieren läßt.
   Liter Leitungswasser 40 g Sojamehl, 20 g Saccharose,

   20 g Weizenstärke, 1 g Natriumchlorid und 1 g CaI- Patentanspruch:
   ciumcarbonat enthält und mittels verdünnter Natronlauge oder Salzsäure auf ein pH von 6,5 eingestellt Die Verwendung von Streptomyces tuirus NRRL worden ist. Man führt die Fermentation in zwei 30 3120zurHerstellungdesAntibiotiJcumsTuoromycin 500-1-Fermentern unter 96stündigem Rühren bei auf üblichem biologischem Wege und Gewinnung 375 U/Min, durch. Durch Vereinigung der beiden des Antibiotikums aus dem Mycel.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   509 780/399 1.66 © Bundesdruckerei Berlin