CN106520943A - 一种与加系杜洛克背膘厚相关的snp位点及其应用 - Google Patents

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Dezhou Ao Xin Breeding Co Ltd
Guangxi Ke Yuan Original Pig Breeding Co Ltd
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Leshan Ao Nong Kang Rui Animal Husbandry Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种与加系杜洛克背膘厚相关的SNP位点及其应用，本发明是关于一个位于猪9号染色体上的CACNA1E基因内的SNP，所述CACNA1E基因的SNP位点为ALGA0055091(G/A)，该位点基因型为AA的个体比GG型的个体有更薄的背膘，在此基础上，ALGA0055091可以作为一个SNP标记，通过对基因型的选择，可以加快对加系杜洛克背膘厚的选择，同时加快提高加系杜洛克的瘦肉率的遗传进展。

Description

一种与加系杜洛克背膘厚相关的SNP位点及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及影响加系杜洛克背膘厚、瘦肉率性状的CACNA1E基因及其在种猪遗传改良中的应用。
背景技术
杜洛克原产于美国东部的新泽西州和纽约州等地，主要亲本用纽约州的杜洛克和新泽西州的泽西红杂交育成，原称杜洛克泽西，后统称杜洛克，分为美系和加系杜洛克；产于我国台湾的杜洛克经过培育自成风格，因而称台湾杜洛克或台系杜洛克。
由于杜洛克猪适应性好，无应激敏感现象，易饲养管理成功，具有增重快，饲料报酬高(料肉比为2.8～3.2∶1)，胴体品质好、瘦肉率高等优点，广泛适合于工厂化养猪和农户饲养。
猪的瘦肉率是一个重要的经济性状。瘦肉率高的猪有更快的生长速度、更好的料肉比、且有更好的出售价格。瘦肉率和背膘厚有很强的相关性(Newcometal.2004)，背膘厚越薄，瘦肉率越高。在常规选育中先是通过B超对猪活体进行测量，然后才能对背膘厚进行选择，但这个工作费时费力，因此开发一种快速，简单，高效的分子选育方法，在生产中有很大的必要，会加快背膘厚的遗传进展。
发明内容
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
一种与加系杜洛克背膘厚相关的SNP位点，其特征在于：所述SNP位点位于猪9号染色体上的CACNA1E基因内，所述CACNA1E基因的SNP位点为ALGA0055091(G/A)，该位点基因型为AA的个体比GG型的个体有更薄的背膘。
所述的SNP位点在杜洛克选择育种中的应用。
所述的SNP位点在鉴定杜洛克背膘中的应用。
本发明的另一目的在于提供用于检测前述的SNP位点的引物及探针，包括：
正向引物GCATTTTCTGCTCTGTTGAAAGC
反向引物AAACACCTTCCATCCCTTCCA
探针1TATGAGGCACGGAGAC
探针2TATGAGGCACGAAGAC。
本发明优点如下：
本发明发现了一个影响杜洛克背膘厚的SNP位点，本发明提供的SNP标记不受杜洛克年龄、性别的影响，可用于杜洛克的背膘厚早期育种选择，促进育种过程。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1：83头加系杜洛克背膘厚的表性质分布。
注：X轴代表表型值分布，Y轴代表密度分布，
BFTEBV：背膘厚估计育种值；Density:频率分布
图2：背膘厚全基因组关联分析。
注：X轴为染色体名称，Y轴为-logP值，Chromosome：染色体名称
图3：ALGA0055091基因型与表型的对应值。
注：X轴代表基因型，Y轴代表型值，Genotype：基因型Phenotype表型
具体实施方式
为了探究加系杜洛克背膘厚的遗传机理，并开发一种快速、高效的与背膘厚选育相关的额分子育种技术，本发明利用83头杜洛克群体，通过全基因组关联(GWAS)分析等方法，鉴别到了影响加系杜洛克的SNP位点，并确定CACNA1E基因为其候选基因。在此基础上，本发明还构建一种快速、高效的分子检测技术。通过深入研究了不同基因型对应的表型，确定了与背膘厚薄有关的基因型，通过对基因型的选择，可以加快背膘厚的遗传进展。
1、实验动物
83头加系杜洛克实验群体，83头杜洛克表型分布如图1所示。
2、实验方法
DNA的提取/猪全基因组60K SNP判型
每头猪均采集一小块耳样，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，其具体步骤如下：
1、将耳样剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ulRNaseA，混匀。
2、在热孵育器中，55℃过夜。(刚开始可每隔30min摇晃一次)
3、取出EP管，加入等体积Tris平衡苯酚，用力摇晃3min；12000g，离心10分钟。
4、轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中。
5、向上清中加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃2分钟；12000g，离心2分钟。
6、吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀。
7、12000g，离心1分钟，尽可能吸除上层乙醇。
8、加入1ml，70％乙醇漂洗DNA，用力摇匀，以去除残留的SDS和苯酚。
9、12000g，离心1分钟，去除乙醇。
10、将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。(9、10可重复一次)。.
11、用65℃预热的无菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。
经Nanodrop-NDIOOO分光光度计检测质量后统一将浓度稀释至50ng/μl,送北京怡美通德有限公司在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60KSNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用plink_1.09软件对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于95％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到约4万个SNP的有效基因型数据。
全基因组关联(GWAS)分析
本实验的采用的83头杜洛克母猪均为加系杜洛克且来自一个厂，因此不存在群体层化效应，用PLINK进行GWAS分析，基因组水平的显著区域采用保守的Bonferrini校正方法确定，即基因组显著水平阈值为＝0.05/40000(有效SNP数量)。
实验结果
GWAS分析结果见图2。从图2可知，在83头杜洛克群体中，在猪4,9,11,12和14号染色体存在31个显著影响背膘厚的SNP位点。如表1所示。最强SNP位点ALGA0055091位于SSC9上的CACNA1E基因内。该SNP位点与背膘厚显著相关，AA基因型个体比GG基因型个体有更薄的背膘，AG基因型的个体背膘厚介于基因型AA与GG之间。详见图3表明位于CACNA1E基因中的SNP位点：ALGA0055091可以作为分子标记对加系杜洛克背膘厚进行选择。
本发明还提供了了一种可用于检测ALGA0055091基因型的Taqman引物及探针引物/探针如下：
正向引物 GCATTTTCTGCTCTGTTGAAAGC 162 184 59
反向引物 AAACACCTTCCATCCCTTCCA 227 207 59
探针1 TATGAGGCACGGAGAC 190 205 67
探针2 TATGAGGCACGAAGAC 190 205 67
引物和探针进行检测SNP的实验过程
实时定量Taqman PCR基因分型扩增体系：10μl反应体系含3.4μl水，5μl 2×Taqman Genotyping Master Mix，0.2μl 10mM正向引物，0.2μl 10mM反向引物，0.1μl 10mM探针1(5′-FAM,3′-TAMRA)，0.1μl 10mM探针2(5′-VIC,3′-TAMRA)，1μl DNA。
实时定量Taqman PCR反应程序：1、AD-pre read读取初始背景(本底)荧光信号。2、AQ-PCR扩增：50℃，2min；95℃，10min；(95℃，15sec，各引物退火及延伸温度60℃，1min)，40个循环。3、AD-post read读取PCR反应结束后荧光信号(终点读法)，除去本底信号，分析后自动分簇得到判型结果。
表1:与背膘厚相关的31个SNP位点信息
**:5％基因组显著水平,*:建议显著水平。
<110>1/漳州傲农现代农业开发有限公司，
2/广西柯新源原种猪有限责任公司，
3/福建傲农生物科技集团股份有限公司，
4/井冈山傲新华富育种有限公司，
5/乐山傲农康瑞牧业有限公司，
6/湖北三匹畜牧科技有限公司，
7/德州傲新育种有限公司
<120>一种与加系杜洛克背膘厚相关的SNP位点及其应用
<160>4
210>1
<211>13
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>1
GCATTTTCTG CTCTGTTGAA AGC 13
<210>2
<211>11
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>2
AAACACCTTC CATCCCTTCC A 11
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>3
TATGAGGCAC GGAGAC 16
210>4
<211>16
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>4
TATGAGGCAC GAAGAC 16

Claims (4)

1.一种与加系杜洛克背膘厚相关的SNP位点，其特征在于：所述SNP位点位于猪9号染色体上的CACNA1E基因内，所述CACNA1E基因的SNP位点为ALGA0055091(G/A)，该位点基因型为AA的个体比GG型的个体有更薄的背膘。
2.权利要求1所述的SNP位点在杜洛克选择育种中的应用。
3.权利要求1所述的SNP位点在鉴定杜洛克背膘中的应用。
4.用于检测权利要求1所述的SNP位点的引物及探针，包括：
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