CN116200472A - 一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用 - Google Patents
一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116200472A CN116200472A CN202310357348.5A CN202310357348A CN116200472A CN 116200472 A CN116200472 A CN 116200472A CN 202310357348 A CN202310357348 A CN 202310357348A CN 116200472 A CN116200472 A CN 116200472A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- scn9a gene
- deletion
- cattle
- bovine
- scn9a
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 70
- 101150080511 Scn9a gene Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 title abstract description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 48
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 17
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 42
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- -1 Tris saturated phenol Chemical class 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000852 deltoid muscle Anatomy 0.000 description 3
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 3
- 210000000876 intercostal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用。以牛全基因组DNA为模板，通过PCR及琼脂糖凝胶电泳，准确鉴定SCN9A基因11‑bp缺失突变位点的基因型，关联分析结果揭示SCN9A基因11‑bp缺失突变位点的不同基因型与牛肉质性状显著相关，并存在作为筛选肉牛肉质性状的DNA标记。本发明通过快速、精准的检测与牛肉质性状密切相关的InDel标记，可快速建立牛优势遗传资源群体，从而加快牛肉质性状的标记辅助选择育种进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与家畜育种技术领域，涉及基因插入/缺失多态性(InDel)的检测，特别涉及快速、精准的检测与肉质性状相关的SCN9A基因InDel标记。
背景技术
动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术以及以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)育种技术根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择，通过在DNA水平上分析个体的遗传组成，实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性，在早期选择、无损害性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。寻找重要功能基因、筛查基因遗传变异位点，并分析基因遗传变异位点与性状的相关性，是标记辅助选择技术应用的前提和关键。
插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是指DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起的DNA序列的改变，插入或缺失片段的长度在1-50bp之间。随着比较基因组学的不断发展，InDel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其突变频率较低，约为10-8，相对比较稳定；在结构上属于二等位基因多态性，等位基因固定且已知，能通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增被高度降解DNA的成功率。
作为一种重要的遗传标记来源，InDel遍布于整个基因组，频率仅次于SNP，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行InDel检测，利用InDel分析个体基因组，可以更好地解释个体的表型差异，在动物分子育种中具有重要意义。InDel的研究目前多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，对反刍家畜的功能性基因的InDel标记的挖掘与应用亟待深入。
为不断改良肉质性状、多方提升肉质来源及品质，在DNA水平上筛查和检测与肉质性状密切相关的DNA标记意义重大。根据Meijer Inge Anita等人的研究，SCN9A基因专门负责与疼痛相关的蛋白质的表达，同时介导钠离子进入细胞以及神经元间的交流。当SCN9A基因发生突变后会阻碍神经元之间的联系。2018年，Warnier Marine等还发现SCN9A基因也与细胞衰老有关。目前尚未见到牛SCN9A基因上用于肉质性状标记辅助选择的DNA标记的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用，通过对牛SCN9A基因InDel标记的检测及肉质性状早期选择，从而加快肉牛良种选育速度。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：
以待测牛(如肉牛)个体全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增包含SCN9A基因插入/缺失多态性位点的片段，将PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定个体在所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点的基因型；所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点为定位于牛参考序列NC_037329.1:g.30046095-30046105位的11-bp缺失突变位点。
优选的，所述引物对P1为：
上游引物F：5’-ACATAGCATTCACATTGTAT-3’
下游引物R：5’-AGATTTAGTGTCCACTTCAT-3’。
优选的，所述PCR采用的反应体系包括20～50ng/μL的基因组DNA 0.8μL以及10pmol/μL的上、下游引物各0.5μL。
优选的，所述PCR采用的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸18s，30个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。
优选的，根据琼脂糖凝胶电泳结果，所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为257bp的一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为257bp和246bp的两条带纹，未发现缺失/缺失基因型(DD)。
上述牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)可以作为筛选肉牛肉质性状的DNA标记(具体为InDel标记)。
优选的，所述肉质性状为隔肌重、肋间肌重、侧翼牛排膜重、三角肌重、背肩心重、肋眼重、牛上股肉重中的一种或多种。
一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括牛SCN9A基因NC_037329.1第30046095-30046105位插入/缺失多态性位点的检测试剂，所述试剂包括上述引物对P1。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以对牛SCN9A基因InDel位点(NC_037329.1第30046095-30046105位)进行基因分型鉴定，检测方法简单、快速、成本低。本发明根据对牛SCN9A基因InDel位点(NC_037329.1第30046095-30046105位)与牛肉质性状进行关联分析的结果，首次发现牛SCN9A基因上的遗传变异位点与肉质性状显著相关，并具有可供筛选肉牛肉质性状参考的相应DNA标记。据此本发明的检测方法可用于精准建立肉质性状优良的肉牛种群，从而加快肉牛肉质性状的标记辅助选择育种进程。
附图说明
图1为山东黑牛遗传资源群体SCN9A基因PCR(引物对P1)扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱；其中：M为Marker I泳道。
图2为山东黑牛遗传资源群体SCN9A基因PCR(引物对P1)扩增产物测序图；其中：上半部分表示基因型为II，下半部分表示基因型为ID，方框标出的部分表示牛SCN9A基因11-bp缺失序列，即NC_037329.1:g.30046095-30046105del TGATTATCTCA。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
利用PCR及琼脂糖凝胶电泳的方法，对山东黑牛遗传资源群体SCN9A基因30046095-30046105位点(参考序列：NC_037329.1)产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其基因型与肉质性状进行关联性分析，确定其存在可以作为牛分子育种中辅助选择的候选分子标记。具体说明如下。
1.实验药品与试剂
1.1生化试剂与生物学试剂
①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。
1.2普通试剂
普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
1.3溶液与缓冲液
所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。
1)提取组织样DNA所用溶液：
①2mol/L NaCl：11.688g NaCl溶于水，定容至100mL，高压灭菌。
②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，以及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。
③基因组DNA提取时的公用溶液
2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液
①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。
②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。2.牛SCN9A基因InDel位点扩增引物
在NCBI上检索牛SCN9A基因的序列，并利用Primer 5.0设计能够扩增牛SCN9A基因内含子第-095到-105位区域InDel位点的PCR引物对P1。具体引物序列如下：
上游引物F：5’-ACATAGCATTCACATTGTAT-3’(20nt)；
下游引物R：5’-AGATTTAGTGTCCACTTCAT-3’(20nt)。
上述引物对P1对牛基因组扩增，能够扩增包含牛SCN9A基因内含子区11-bp InDel位点，又称为SCN9A基因11-bp缺失突变位点(NC_037329.1:g.30046095-30046105位)的片段。理论上，当牛SCN9A基因内含子-095到-105位之间的序列TGATTATCTCA缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是246bp大小的一条带纹；当-095到-105位之间的序列TGATTATCTCA存在(插入)时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是257bp大小的一条带纹；当-095到-105位之间的序列TGATTATCTCA在一个等位基因上出现插入，在另一个等位基因上出现缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是大小分别为257bp和246bp的两条带纹。
3.PCR扩增牛SCN9A基因目的片段
3.1山东黑牛遗传资源群体肌肉组织样本和肉质性状数据采集
从山东黑牛遗传资源群体(渤海黑牛和日本和牛杂交群体，后简述为“山东黑牛”)中随机采集个体肌肉组织样本500份(参见表1)；
表1.山东黑牛遗传资源群体(n＝500)采样信息
肉牛(山东黑牛)出栏屠宰后，由农场技术人员按照同一标准，随机选择并检测记录雄性和雌性个体的肉质性状数据，包括：用无菌电子秤称量隔肌重、肋间肌重、侧翼牛排膜重、三角肌重、背肩心重、肋眼重、牛上股肉重等。同时收集肌肉组织样本，样本用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。
3.2组织样品基因组DNA的提取与分离
1)取部分肌肉组织样本，放于2mL的离心管中，用剪刀尽量剪碎。
2)加入600μL组织DNA提取液，加入10％SDS至终浓度为1％，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，保证肌肉组织样均匀地分布在组织DNA提取液中。
3)将消化后溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。
4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。
5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。
6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，并出现白色絮状DNA。
7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇。
8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将离心管倒置于吸水纸上。
9)待DNA干燥后，加入60μL灭菌超纯水，4℃保存过夜，使DNA完全溶解，待测。
3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA
1)将电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。
2)称取2.45g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入0.5×TBE 40mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾3次后取出，冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB，轻微摇动，防止出现气泡。
3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液倒入电泳槽内，如出现气泡，立即用移液器移出。
4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸。
5)向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。
6)取DNA溶液2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，上样，并将DNA Marker加在一边。
7)80V电压电泳2h。
8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，则需重新提取相应样品的DNA。
3.4DNA的纯化
1)500μL的DNA溶液中加入10％ SDS，使SDS终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。
2)55℃保温10h左右。
3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。
4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。
5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。
6)倒掉液体，70％乙醇洗涤，待DNA晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃保存，待检测。
3.5分光光度法检测DNA
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
3.6PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA(组织样品基因组DNA)，再瞬时离心后进行PCR扩增。
PCR反应体系(13μL)：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL；上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，上下游引物浓度均为10pmol/μL；模板DNA(浓度为20ng/μL基因组DNA)0.8μL；去离子水4.7μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸18s，30个循环；72℃延伸10min。
4.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物
4.1琼脂糖凝胶电泳检测流程
1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.0μL，点样后120V电压电泳1.0～1.2h；
2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像后即可对琼脂糖凝胶电泳结果进行分析。
4.2分析InDel位点的多态性
参见图1以及图2，利用引物对P1对山东黑牛遗传资源群体中不同个体的基因组目标区域进行扩增，并对扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳及BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统进行分析，能够实现对山东黑牛遗传资源群体SCN9A基因内含子区11-bp InDel位点(NC_037329.1:g.30046095-30046105位)进行快速、准确的分型鉴定(基因型：II、ID)。图1中个别泳道出现的三条带纹表示存在非特异性扩增(相应的非特异性扩增带纹标记为A)，但并不影响对基因型的识别。
5.牛SCN9A基因InDel位点的频率统计分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。山东黑牛遗传资源群体SCN9A基因11-bp缺失突变位点的基因型频率、等位基因频率及遗传多态性指数如表2所示。
表2.山东黑牛SCN9A基因11-bp缺失突变位点的遗传参数分析
6.牛SCN9A基因InDel位点基因多态性与肉质性状的关联性分析
基因型数据：PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳识别的基因型(II、ID)；
肉质性状数据：隔肌重、肋间肌重、侧翼牛排膜重、三角肌重、背肩心重、肋眼重、牛上股肉重等。
利用SPSS(25.0)软件分析InDel位点与肉质性状的相关性。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应、基因之间的互作以及基因型的效应，利用SPSS软件的t-检验进行分析。分析结果具体参见表3。
表3.山东黑牛SCN9A基因11-bp缺失突变位点多态性与肉质性状的关联性分析
注：不同基因型间均值肩标上具有字母A和B表示差异极显著，均值肩标上具有字母a和b表示差异显著。
由表3可以看出，在山东黑牛遗传资源群体中，SCN9A基因11-bp缺失突变位点的不同基因型对肉质性状有显著影响(P<0.05)，II基因型个体的肉质性状明显优于ID基因型个体，具有统计学差异。因此，牛SCN9A基因内含子区11-bp InDel位点(NC_037329.1:g.30046095-30046105位)的II基因型可作为鉴定优质肉牛肉质性状的候选遗传标记。
Claims (10)
1.一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以牛基因组DNA为模板，通过PCR扩增包含SCN9A基因插入/缺失多态性位点的片段，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点的基因型；所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点为定位于牛参考序列NC_037329.1:g.30046095-30046105位的11-bp缺失突变位点。
2.根据权利要求1所述一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增引物为：
上游引物F：5’-ACATAGCATTCACATTGTAT-3’
下游引物R：5’-AGATTTAGTGTCCACTTCAT-3’。
3.根据权利要求1所述一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的反应体系包括20～50ng/μL基因组DNA 0.8μL以及10pmol/μL上、下游引物各0.5μL。
4.根据权利要求1所述一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸18s，30个循环；72℃延伸10min。
5.根据权利要求1所述一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.5％的琼脂糖凝胶。
6.根据权利要求1所述一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根据电泳结果，所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型表现为257bp的一条带纹，插入/缺失基因型表现为257bp和246bp的两条带纹。
7.如权利要求1所述的牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用。
8.牛SCN9A基因插入/缺失多态性位点在牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点为定位于牛参考序列NC_037329.1:g.30046095-30046105位的11-bp缺失突变位点。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型可以作为筛选肉牛肉质性状的DNA标记。
10.一种牛SCN9A基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增包含SCN9A基因插入/缺失多态性位点的片段的引物，所述SCN9A基因插入/缺失多态性位点为定位于牛参考序列NC_037329.1:g.30046095-30046105位的11-bp缺失突变位点。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310357348.5A CN116200472A (zh) | 2023-04-04 | 2023-04-04 | 一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310357348.5A CN116200472A (zh) | 2023-04-04 | 2023-04-04 | 一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116200472A true CN116200472A (zh) | 2023-06-02 |
Family
ID=86517527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310357348.5A Pending CN116200472A (zh) | 2023-04-04 | 2023-04-04 | 一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116200472A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018165504A1 (en) * | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| CN109182539A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-01-11 | 西北农林科技大学 | 一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法及其应用 |
| CN112795667A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-14 | 西北农林科技大学 | 一种牛fras1基因插入/缺失突变的检测方法及其应用 |
| CN112941202A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-11 | 西北农林科技大学 | 一种牛sept7基因插入/缺失突变的检测方法及其应用 |
| CN113473850A (zh) * | 2019-02-22 | 2021-10-01 | 瑞泽恩制药公司 | 具有遗传修饰的钠通道的啮齿动物及其使用方法 |
| CN114703293A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-07-05 | 西北农林科技大学 | 一种牛CRY1基因的InDel标记在繁殖性状早期选择中的应用 |
-
2023
- 2023-04-04 CN CN202310357348.5A patent/CN116200472A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018165504A1 (en) * | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| CN109182539A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-01-11 | 西北农林科技大学 | 一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法及其应用 |
| CN113473850A (zh) * | 2019-02-22 | 2021-10-01 | 瑞泽恩制药公司 | 具有遗传修饰的钠通道的啮齿动物及其使用方法 |
| CN112795667A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-14 | 西北农林科技大学 | 一种牛fras1基因插入/缺失突变的检测方法及其应用 |
| CN112941202A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-11 | 西北农林科技大学 | 一种牛sept7基因插入/缺失突变的检测方法及其应用 |
| CN114703293A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-07-05 | 西北农林科技大学 | 一种牛CRY1基因的InDel标记在繁殖性状早期选择中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ENSEMBL: "rs730609078", ENSEMBL, 31 October 2022 (2022-10-31), pages 1 * |
| ZEZHAO WANG: "Genome-Wide Scan Identifies Selection Signatures in Chinese Wagyu Cattle Using a High-Density SNP Array", ANIMALS, vol. 9, no. 296, 30 May 2019 (2019-05-30), pages 1 - 12 * |
| 谭家祺;李学拥;: "兔坐骨神经电损伤后背根神经节离子通道SCN9A、KV1.5表达变化的研究", 科学技术与工程, no. 13, 1 July 2009 (2009-07-01), pages 3616 - 3620 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114959066A (zh) | 一种影响猪肌内脂肪含量性状的分子标记及应用 | |
| CN107828897B (zh) | 与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用 | |
| CN109182539B (zh) | 一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法及其应用 | |
| CN112813175B (zh) | 黄牛chrdl1基因cnv标记快速辅助检测生长性状的方法及其应用 | |
| CN107988385B (zh) | 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 | |
| CN111088369B (zh) | 一种绵羊rora基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用 | |
| CN114703293B (zh) | 一种牛CRY1基因的InDel标记在繁殖性状早期选择中的应用 | |
| CN112795668B (zh) | 一种山羊cfap43基因插入/缺失标记在性状早期选择中的应用 | |
| CN112941202B (zh) | 一种牛sept7基因插入/缺失突变的检测方法及其应用 | |
| CN107858441B (zh) | 与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用 | |
| CN113604583B (zh) | 一种山羊kcnj15基因cnv标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒 | |
| CN116200472A (zh) | 一种牛SCN9A基因InDel标记在肉质性状早期选择中的应用 | |
| CN111154891B (zh) | 绵羊igf2bp1基因插入/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用 | |
| CN112210607B (zh) | 与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用 | |
| CN112410441A (zh) | 利用snp标记kz288479.1_95621鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法 | |
| CN111850140B (zh) | 一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用 | |
| CN117363756A (zh) | 一种山羊C3H1orf226基因插入或缺失(InDel)标记的检测方法及其应用 | |
| CN106755370B (zh) | 利用pcr-rflp检测绵羊fth-1基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN111733261B (zh) | 一种山羊AKAP12基因InDel标记的检测方法及其应用 | |
| CN110904247A (zh) | 一种山羊Sox9基因InDel标记的检测方法及其应用 | |
| CN111154895B (zh) | 绵羊ghr基因插入/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用 | |
| CN113151490B (zh) | 基于黄牛loc107131166基因cnv标记的生长性状分子标记辅助选择方法 | |
| CN112980935B (zh) | 一种山羊prnt基因单核苷酸多态性标记在性状早期选择中的应用 | |
| CN112852974B (zh) | 一种绵羊ahr基因插入/缺失作为繁殖性状早期选择的应用方法 | |
| CN112695102B (zh) | 山羊prnt基因单核苷酸多态性在产羔性状早期选择中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |