CN113699250B - 与肉鸡饲料转化效率性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域,具体公开了与肉鸡饲料转化效率性状相关的分子标记及其应用。本发明中,所述分子标记包括rs14219226,其含有肉鸡2号染色体上第90,963,291bp处多态性为C/T的核苷酸序列;rs14342189,其含有肉鸡3号染色体上第38,794,074bp处多态性为C/T的核苷酸序列;rs318129041,其含有肉鸡4号染色体上第35,414,875bp处多态性为T/C的核苷酸序列;rs315853113,其含有肉鸡15号染色体上第4,012,956bp处多态性为T/A的核苷酸序列;rs733815383,其含有肉鸡18号染色体上第3,276,056bp处多态性为C/T的核苷酸序列。本发明预测准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域,具体地说,涉及与肉鸡饲料转化效率性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
肉鸡产业是畜牧业的重要组成部分,肉鸡产业包括白羽肉鸡和黄羽肉鸡两部分。而无论是白羽肉鸡还是黄羽肉鸡,都面临着腹脂沉积过多的问题,腹脂过度沉积对肉鸡的生产和消费都带来了巨大的影响,如降低胴体中瘦肉比例、降低饲料转化效率等。饲料成本占肉鸡生产成本的70%,尤其是市场行情变动易导致饲料原料的价格飞涨,因此降低腹脂沉积,提高饲料利用效率,减少饲养成本是肉鸡育种中的重要目标。
在2001年Meuwissen等提出利用覆盖全基因组范围内的高密度分子标记进行个体育种值估计的方法。在2006年,Schaeffer等在奶牛的研究当中,使用基因组选择与后裔测定方案进行比较,发现基因组选择提高了近2倍的遗传进展,减少了92%的饲养成本。选择合适的计算模型对肉鸡的育种工作是至关重要的,基因组选择有不同模型,其预测的准确性也各有优劣。为减少基因分型的成本,有学者提出了结合系谱信息的一步法。而现在,结合先验信息的基因组选择被证实有利于提高预测准确性。整合生物学先验GS研究的一个关键问题就是选择合适的先验信息。理论上,任何能够影响表型的各组学数据都可以成为GS的生物学先验信息,因而先验信息可包括基因组、表观组、转录组、蛋白组、代谢组以及功能注释等信息。袁泽湖的研究发现,添加前期基于高密度分子标记的GWAS结果,可以提高GBLUP、BayesR等方法的预测准确性。
脂类为生物体供应能量,但脂肪沉积过多会对黄羽肉鸡的生产性能产生负面影响,如诱发健康问题、降低饲料利用效率等。从大量的研究报道及选择的实际效果来看,对鸡体内脂肪沉积控制的常规选择是从直接选择和间接选择两个方面进行:直接选择,即对腹部脂肪重或腹脂率进行选择;间接选择,即寻求活体度量体脂或腹脂量的间接选择指标对其选择,以最终实现对鸡体内脂肪沉积的控制。在肉鸡的实际生产当中,还是以直接法选择全同胞个体屠宰测定腹脂重和腹脂率为主。有必要对更快速、有效的选择方法进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种与肉鸡饲料转化效率性状显著相关的SNP分子标记及高效肉鸡选育方法。
高效肉鸡指饲料利用效率高、腹脂率低的优质肉鸡。
剩余采食量(Residual Feed Intake,RFI)定义为实际采食量与预期采食量之差,将能量分为维持能和代谢能,在个体中的表现的主要是个体代谢效率上的差异,与体重等生产指标不存在相关性,可以作为一个很好的指标衡量饲料效率。腹脂率为高遗传力性状,剩余采食量为低遗传力性状,二者之间呈强的正相关。
针对育种和生产实践需求,本发明使用双性状模型进行选择选育,以快大型黄羽肉鸡种为素材,通过腹脂和剩余采食量的表型和全基因组SNP测定,筛选并获得显著影响黄羽肉鸡腹脂和剩余采食量的SNP标记。通过在GBLUP方法估计中增加显著SNP权重的方法,提高育种值估计的准确性。为实现腹脂和剩余采食量的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和,加快遗传选择进展提供技术支撑。
具体地,本发明的技术方案如下:
与肉鸡饲料转化效率性状相关的分子标记,所述肉鸡饲料转化效率性状指腹脂率和/或剩余采食量,所述分子标记包括rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383;
其中,分子标记rs14219226含有肉鸡2号染色体(GGA2)上第90,963,291bp处多态性为C/T的核苷酸序列;
分子标记rs14342189含有肉鸡3号染色体(GGA3)上第38,794,074bp处多态性为C/T的核苷酸序列;
分子标记rs318129041含有肉鸡4号染色体(GGA4)上第35,414,875bp处多态性为T/C的核苷酸序列;
分子标记rs315853113含有肉鸡15号染色体(GGA15)上第4,012,956bp处多态性为T/A的核苷酸序列;
分子标记rs733815383含有肉鸡18号染色体(GGA18)上第3,276,056bp处多态性为C/T的核苷酸序列。
以上分子标记的物理位置参考基因组GRCg6a版本。
本发明中,分子标记rs14219226所含多态性位点的基因型为CC,对应于低腹脂率水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于高腹脂率水平;
分子标记rs14342189所含多态性位点的基因型为CC,对应于低腹脂率水平和低剩余采食量水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平和剩余采食量水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于高腹脂率水平和高剩余采食量水平;
分子标记rs318129041所含多态性位点的基因型为CC,对应于高腹脂率水平和高剩余采食量水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平和剩余采食量水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于低腹脂率水平和低剩余采食量水平;
分子标记rs315853113所含多态性位点的基因型为AA,对应于高腹脂率水平,所含多态性位点的基因型为TA,对应于腹脂率水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于低腹脂率水平;
分子标记rs733815383所含多态性位点的基因型为CC,对应于低腹脂率水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于高腹脂率水平。
腹脂率水平和剩余采食量水平居中指腹脂率和剩余采食量的数值低于高腹脂率和剩余采食量性状表型所对应的腹脂率和剩余采食量数值,并高于低腹脂率和剩余采食量性状表型所对应的腹脂率和剩余采食量数值。
本发明还提供一种用于扩增上述分子标记的引物。
本发明中,扩增分子标记rs14219226的引物如SEQ ID NO.1-2所示;
扩增分子标记rs14342189的引物如SEQ ID NO.3-4所示;
扩增分子标记rs318129041的引物如SEQ ID NO.5-6所示;
扩增分子标记rs315853113的引物如SEQ ID NO.7-8所示;
扩增分子标记rs733815383的引物如SEQ ID NO.9-10所示。
本发明另提供一种含有上述引物的试剂或试剂盒。
本发明再提供一种上述分子标记或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用:
(1)在鉴定肉鸡饲料转化效率相关性状表型中的应用;
(2)在肉鸡饲料转化效率相关性状早期预测中的应用;
(3)在肉鸡资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用;
其中,所述肉鸡饲料转化效率相关性状指腹脂率和/或剩余采食量。
本发明还提供一种高效肉鸡的分子育种方法,其包括:
(1)提取待测肉鸡总DNA;
(2)以DNA为模板,利用上述引物进行PCR扩增;
(3)分析PCR扩增产物,判断肉鸡遗传潜质,留种、繁种。
本发明中,步骤(3)包括:对扩增产物进行等位基因检测,根据基因分型结果判定如下:
若分子标记rs14219226对应的多态性位点的基因型为CC,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平;
若分子标记rs14342189对应的多态性位点的基因型为CC,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平和低剩余采食量水平;
若分子标记rs318129041对应的多态性位点的基因型为TT,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平和低剩余采食量水平;
若分子标记rs315853113对应的多态性位点的基因型为TT,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平;
若分子标记rs733815383对应的多态性位点的基因型为CC,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平。
本发明另提供一种利用整合分子标记进行高饲料利用效率肉鸡的基因组选择的育种方法,其特征在于,包括:
(1)构建参考群体,测定腹脂率和剩余采食量的相关性状并提取DNA,利用鸡全基因组SNP芯片对所有参考样本进行全基因组SNP分型,并对基因分型后的数据进行处理和质量控制;
(2)建立待测群体、提取DNA,利用鸡全基因组SNP芯片对所有待测样本进行全基因组SNP分型,并对基因分型后的数据进行处理和质量控制;
步骤(1)-(2)中,所述鸡全基因组SNP芯片中包括分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383,分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383如上所述;
(3)利用步骤(1)中获得的参考群体每个个体的AFP和RFI表型值、参考群体每个个体全基因组所有位点的基因型、步骤(2)中获得的待测群体每一个个体的全基因组基因型,和参考群体和所有待留种个体的系谱记录,进行基因组估计育种值估计;
(4)选择基因组估计育种值高的待测个体作为亲本,留种组建家系。
本发明中,基因组估计育种值估计包括:
(1)权重G矩阵构建:
矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平得到Gsnp代表基于5个分子标记构建的亲缘关系矩阵,G1代表基于鸡全基因组SNP芯片构建的基因组亲缘关系矩阵;所述5个分子标记如上所述;
设置G1和的相对权重公式为:
公式中,G2代表权重G矩阵,c=0.9,d=0.1;
(2)H矩阵构建
矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵A22的水平得到G*,设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw=0.95*G*+0.05*A22;获得合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵H-1;
(3)育种值估计。
本发明方法包括:基于芯片或一代测序检测以上5个位点的基因型。
该方法包括:获得来自鸡的基因组DNA和基于SNP芯片的全基因组SNP;检测以上5个位点的基因型;利用GBLUP方法估计基因组育种值,选择育种值较优个体留种。其中使用“京芯一号”SNP芯片已经包含了上述位点。
本发明中所述肉鸡,优选为黄羽肉鸡。
本发明的有益效果至少在于:
本发明采用鸡腹脂和剩余采食量双性状改良分子育种技术,涉及整合利用显著SNP分子标记的基因组选择方法,可平衡选育腹脂和剩余采食量肉鸡新品系。
利用本发明5个分子标记进行SNP整合的基因组选择法对腹脂和剩余采食量双性状进行选择,相比常规不对5个显著SNP设置权重的GEBV估计结果,能够显著提高预测准确性。对于AFP,显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比是0.9:0.1,GBLUP的方法预测准确性提高5.70%,SSGBLUP的方法预测准确性提高了5.56%;对于RFI,显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比是0.9:0.1,GBLUP的方法预测准确性提高21.81%,SSGBLUP的方法预测准确性提高了21.16%。
通过本发明选育的种系,可减少腹部脂肪沉积,节省生产中的饲养成本,对黄羽肉鸡的生产具有重大的指导意义。
附图说明
图1为本发明rs14219226的基因分型图。
图2为本发明rs14342189的基因分型图。
图3为本发明rs318129041的基因分型图。
图4为本发明rs315853113的基因分型图。
图5为本发明rs733815383的基因分型图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
本发明的分子标记详细信息见表1。
表1
Ensembl公共数据库中rs编号 | GGA | 位置(bp) | 等位基因 |
rs14219226 | 2 | 90,963,291 | C/T |
rs14342189 | 3 | 38,794,074 | C/T |
rs318129041 | 4 | 35,414,875 | T/C |
rs315853113 | 15 | 4,012,956 | T/A |
rs733815383 | 18 | 3,276,056 | C/T |
具体包括,鸡2号染色体(GGA2)90,963,291位置上的C/T突变、鸡3号染色体(GGA3)38,794,074位置上的C/T突变、鸡4号染色体(GGA4)35,414,875位置上的T/C突变、鸡15号染色体(GGA15)4,012,956位置上的T/A突变和鸡18号染色体(GGA18)3,276,056位置上的C/T突变。
上述分子标记位点基因型的检测,可以待测鸡的基因组为模板,利用表2中的引物(SEQ ID NO.1-10)进行PCR扩增后,采用直接测序法或其他有效方式对扩增产物进行等位基因检测测序。
表2
实施例1:筛选腹脂和剩余采食量相关的显著SNP标记
1、全基因组关联分析(GWAS)获得不同染色体上存在与剩余采食量(RFI)及腹脂重(AFW)和腹脂率(AFP)显著相关的SNP标记。
(1)试验动物和目标性状的测定
以金陵花鸡(属快大型黄羽肉鸡)为材料,分三个世代共2512只鸡进行饲养试验,试验期为42~56d,测定性状包括了42日龄体重、56日龄体重,42~56日龄生长期内总采食量;计算出剩余采食量(RFI)、饲料转化效率(FCR)、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG),测定结束后对试验鸡只进行屠宰,测定腹脂重(AFW)、全净膛重,计算腹脂率(AFP)。
AFP的计算方法为:腹脂率=腹脂重/全净膛重*100,其中全净膛是在肉鸡宰杀之后,放血、脱毛,并去除气管、食管、嗉囊、肠、脾脏、胰腺、心脏、肝脏、腺胃、肌胃、腹脂和生殖器官后剩下的腔子。为便于后期统计,将腹脂率的值扩大一百倍,单位为1。
RFI的计算方法为:预期采食量估计是根据平均日采食量与中期代谢体重和平均日增重的线性回归方程得到,方程如下:
ADFI=μ+β1MBW+β2ADG+e1
公式中,ADFI代表平均日采食量,μ代表截距,MBW代表中期代谢体重(平均42、56日龄体重的0.75次方),ADG代表平均日增重,β1和β2代表偏回归系数,e1代表残差,即RFI,单位为g/d。其他性状均为领域内常用方法计算得出。
对2512只鸡饲料报酬相关的描述性统计分析结果如下表3。
表3肉鸡腹脂和剩余采食量性状的描述性统计量
(2)全基因组SNP与目标性状相关性分析
利用“京芯一号”鸡55K芯片(参见中国专利:201780023241.X),对所有样本进行全基因组SNP分型。采用PLINK(V1.90b)软件对芯片基因型数据进行质量控制,最后得到2512个个体和40421个SNPs。采用GEMMA(V0.98.1)软件(https://github.com/genetics-statistics/GEMMA/releases)中单性状及多性状混合线性模型(LMM)分别对RFI和AFW以及AFP性状进行GWAS分析。该模型包括SNP以及世代性别作为固定因子和加性多基因效应作为随机效应。全基因组显著线和参考线分别为2.30E-06(0.05/21726)和4.60E-05(1/21726)。
表4 GWAS获得与AFP和RFI相关达到5%基因组水平显著的SNP位点信息
a SNP解释的遗传方差。
表4中所指相关性状指在进行GWAS分析时所使用的性状。
SNP位点rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383的基因分型图分别参见图1至图5。
实施例2:进一步检验5个标记对腹脂率和剩余采食量等性状的影响
本实施例在实施例1的基础上,进一步统计表4中的5个显著SNP位点对于腹脂率和剩余采食量相关性状的影响数据(最小二乘均值±标准误差),结果见表5。
表5
注:不同肩标字母表示差异显著(P<0.05)。
从表5中可知,分子标记rs14219226与腹脂率的关联性佳,优势基因型为CC;分子标记rs14342189与腹脂率和剩余采食量的关联性佳,优势基因型为CC;分子标志rs318129041与腹脂率和剩余采食量的关联性佳,优势基因型为TT;分子标记rs315853113与腹脂率的关联性佳,优势基因型为TT;分子标记rs733815383与腹脂率的关联性佳,优势基因型为CC。
实施例3:利用整合显著SNP标记进行黄羽肉鸡腹脂率和剩余采食量的基因组选择的效果评估
使用实施例1中的2512只鸡进行效果评估。具体表型记录了42日龄体重、56日龄体重和42~56日龄生长期内总采食量以及腹脂重和腹脂率等数据,计算AFP方法如下:
腹脂率=腹脂重/全净膛重*100,为便于后期统计,将腹脂率的值扩大一百倍,单位为1。
计算RFI公式如下:
ADFI=μ+β1 MBW+β2 ADG+e1
公式中,ADFI代表平均日采食量,μ代表截距,MBW代表试验中期代谢体重,ADG代表平均日增重,β1和β2代表偏回归系数,e1代表残差,即RFI,单位为g/d。
本实施例中,基因组选择的目标性状为AFP和RFI。对每只鸡采血保存,提取DNA,采用55K SNP芯片(参见中国专利:201780023241.X)进行全基因组SNP分型和5个表1中最显著的SNP的分型,分别构建亲缘关系矩阵,两个矩阵给予不同的权重,与基于系谱亲缘关系矩阵合并为H矩阵。接着采用5倍交叉验证法对三个世代群体进行随机划分,即将2512只鸡随机分化为5个分组,每一组500只鸡左右。在5个分组中,选取其中1个分组掩盖AFP和RFI表型值作为候选群体,其余鸡只作为参考群体。具体如下:
(1)性状表型统计,结果如实施例1中的表3。
(2)采用55K SNP芯片进行全基因组分型及基因标记质控
采用常用标准进行全基因组SNP的质量控制:个体基因型检出率小于90%,单个SNP位点检出率小于90%和最小等位基因频率小于5%,使用Beagle 5.0软件(Browning,B.L.,Y.Zhou and S.R.Browning(2018).″A One-Penny Imputed Genome from Next-Generation Reference Panels.″Am J Hum Genet 103(3):338-348.)对缺失SNPs进行基因型填充,确保统计上准确率和有效性。
(3)权重G矩阵构建
根据VanRaden算法(VanRaden,P.M.(2008).″Efficient methods to computegenomic predictions.″J Dairy Sci 91(11):4414-4423.),对于芯片基因组数据和5个SNPs,分别利用sommer软件包中A.mat函数进行构建亲缘关系矩阵,即G1和Gsnp。矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平:
公式中,代表调整Gsnp矩阵,Gsnp代表基于显著SNPs构建亲缘关系矩阵。其中,a和b的计算公式为:
Avg(diag(Gsnp))*b+a=Avg(diag(G1))
Avg(offdiag(Gsnp)*b+a=Avg(offdiag(G1)
设置G1和的相对权重公式为:
公式中,G2代表权重G矩阵,G1和见上公式。分开设为c和d为权重系数,且满足c+d=1。
(4)H矩阵构建
H矩阵构建为常用方法。矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵(A22)的水平:
G*=e+f*G2
公式中,G*代表调整G2矩阵。其中,e和f的计算公式为:
A vg(diag(G2))*f+e=Avg(diag(A22))
Avg(offdiag(G2)*f+e=Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw=0.95*G*+0.05*A22。H矩阵的公式为:
公式中,H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵,A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵,代表相对权重G*逆矩阵和/>代表的是分型个体系谱亲缘关系逆矩阵。
(5)估计育种值
采用ASReml v4.1软件,利用约束最大似然法(REML)算法的相关动物模型对AFP&RFI进行遗传参数和育种值估计。遗传力估计的动物模型如下:
y=Xb+Za+e,
公式中,y代表观测值向量,b代表固定效应向量,包括批次和性别,a代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量。X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵。
随机向量的(协)方差矩阵如下:
公式中,和/>分别代表加性遗传方差和剩余环境方差;H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵;I代表单位矩阵。
(6)准确性交叉验证结果
利用R(V3.6.0)软件中caret包产生随机数进行5倍交叉验证。结果如表6-表7。
表6利用整合显著SNP标记的GBLUP双性状方法使用效果检验结果
表7利用整合显著SNP标记的SSGBLUP双性状方法使用效果检验结果
相比常规不对5个显著SNP设置权重的GEBV估计结果,本发明方法使用能够显著提高预测准确性。对于AFP,显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比是0.9:0.1,GBLUP的方法预测准确性提高5.70%,SSGBLUP的方法预测准确性提高了5.56%;对于RFI,显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比是0.9:0.1,GBLUP的方法预测准确性提高21.81%,SSGBLUP的方法预测准确性提高了21.16%。
实施例4:利用整合显著SNP标记进行黄羽肉鸡腹脂率和剩余采食量的基因组选择的育种方法
本实施例记载一个本发明方法完整的实施过程。具体如下:
(1)参考群体的建立,表型性状测定和基因型测定
每个品系建立独立的参考群,参考群的来源要求覆盖到品系已有的全部家系。
当参考群鸡饲养接近其商品鸡56日龄上市日龄时,组建1500~2000只鸡的群体作为参考群体。参考群有明确的表型记录(方法见实施例3)、系谱记录,采集血液样本,提取DNA,送测鸡全基因组SNP芯片。确定3-5万个全基因组平均分布的SNP位点的基因型(含有本发明的5个SNP位点)。具体流程可参考专利“一种鸡全基因组SNP芯片及其应用”(中国专利申请:201780023241.X)内容。本实施例中确定参考群每只鸡全基因组约5万个位点的结果,用于下一步GEBV的估计。
(2)待测群体的建立与全基因组基因型采集
待测群是指,没有表型性状记录,且准备用于繁育下一代的候选种鸡群。待测群要求与参考群具有5个世代以内的亲缘关系。待测群在不影响鸡成活率和生长发育的前提下,尽早采集血液样本送测鸡全基因组SNP芯片。之后以上述实施例3中方法进行全基因组SNP位点基因型检测和质控。
(3)参考群体和候选群体的个体基因组估计育种值(GEBV)分析
利用①参考群体每个个体的表型值(AFP&RFI)、②参考群每个个体全基因组5万个位点的基因型、③待测群体每一个个体的全基因组基因型、④参考群和所有待留种个体的系谱记录(包括参考群在内),共4类文件准备利用本发明方法进行基因组估计育种值(GEBV)估计。具体参见实施例3。
(4)鸡低腹脂和RFI品系的选择方法
根据全基因组选择计算得出的待测群体及其存栏同胞的GEBV的大小,在表型缺失的情况下,对候选留种群体的RFI GEBV进行评估和排序,选择GEBV高的候选群体个体作为亲本,一般公鸡选择100~500,母鸡选择1000~2000,留种组建家系;或是加权后与其他性状进行指数选择。
实施例5利用SNP标记等位基因状态辅助进行黄羽肉鸡腹脂率和剩余采食量的分子育种方法
上述与AFP和RFI显著相关的5个SNP标记,也可以利用常用方法进行选留,具体过程如下:
1、待选择群体
选择待检测鸡。于35日龄后翅静脉采血,ACD抗凝,-20℃保存备用。
2、DNA提取
采用常规酚仿法提取基因组DNA,溶于TE中,用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释至浓度50ng/μl。
3、PCR反应及序列测定
用于扩增SNP的引物序列见表2,利用PCR扩增在ABI Life ProFlex PCR仪热循环仪中进行。PCR反应程序为:95℃3min,95℃30s,60℃30s,72℃1min,共30个循环;72℃5min。PCR反应体系以25μl计为:模板DNA 3μl,10pmol/μl上游引物1μl,10pmol/μl下游引物1μl,2×Master mix 12.5μl,ddH2O 7.5μl。
采用直接测序法或其他有效方式对扩增产物进行等位基因检测。根据基因分型结果选留:标记rs14219226所含多态性位点的基因型为CC或TC、标记rs14342189所含多态性位点的基因型为CC或TC、标记rs318129041所含多态性位点的基因型为TT或TC、标记rs315853113所含多态性位点的基因型为TT或TA,和标记rs733815383所含多态性位点的基因型为CC或TC的健康公、母鸡。按照不低于80只公鸡,公母比例不低于1:10的数量留种,产蛋高峰期组建新的家系繁种。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 与肉鸡饲料转化效率性状相关的分子标记及其应用
<130> KHP211117607.6
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggatgtggt cagccattga 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaacctca cagaaaaccc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcacagaag taaggccctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctccagct tccaatctct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcacataa aatcccacag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatctgtctt cccaagcaat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctgcagctg ttgcatttga 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtggtaact gacagaacat ccat 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agatgggcac agaccagagt 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaagtaaggg gatttgggc 19
Claims (3)
1.分子标记组合或用于扩增所述分子标记组合的引物组合或包含所述引物组合的试剂或试剂盒的以下任一应用:
(1)在鉴定肉鸡饲料转化效率相关性状表型中的应用;
(2)在肉鸡饲料转化效率相关性状早期预测中的应用;
其中,所述肉鸡饲料转化效率相关性状指腹脂率和/或剩余采食量;
所述分子标记组合包括分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383;
其中,分子标记rs14219226含有肉鸡2号染色体上第90,963,291bp处多态性为C/T的核苷酸序列;
分子标记rs14342189含有肉鸡3号染色体上第38,794,074bp处多态性为C/T的核苷酸序列;
分子标记rs318129041含有肉鸡4号染色体上第35,414,875bp处多态性为T/C的核苷酸序列;
分子标记rs315853113含有肉鸡15号染色体上第4,012,956bp处多态性为T/A的核苷酸序列;
分子标记rs733815383含有肉鸡18号染色体上第3,276,056bp处多态性为C/T的核苷酸序列;
分子标记rs14219226所含多态性位点的基因型为CC,对应于低腹脂率水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于高腹脂率水平;
分子标记rs14342189所含多态性位点的基因型为CC,对应于低腹脂率水平和低剩余采食量水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平和剩余采食量水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于高腹脂率水平和高剩余采食量水平;
分子标记rs318129041所含多态性位点的基因型为CC,对应于高腹脂率水平和高剩余采食量水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平和剩余采食量水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于低腹脂率水平和低剩余采食量水平;
分子标记rs315853113所含多态性位点的基因型为AA,对应于高腹脂率水平,所含多态性位点的基因型为TA,对应于腹脂率水平居中,所含多态性位点的基 因型为TT,对应于低腹脂率水平;
分子标记rs733815383所含多态性位点的基因型为CC,对应于低腹脂率水平,所含多态性位点的基因型为TC,对应于腹脂率水平居中,所含多态性位点的基因型为TT,对应于高腹脂率水平;
所述引物组合包括用于扩增分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383的引物;
用于扩增分子标记rs14219226的引物如SEQ ID NO.1-2所示;
用于扩增分子标记rs14342189的引物如SEQ ID NO.3-4所示;
用于扩增分子标记rs318129041的引物如SEQ ID NO.5-6所示;
用于扩增分子标记rs315853113的引物如SEQ ID NO.7-8所示;
用于扩增分子标记rs733815383的引物如SEQ ID NO.9-10所示。
2.高效肉鸡的分子育种方法,其特征在于,包括:
(1)提取待测肉鸡总DNA;
(2)以DNA为模板,利用引物组合进行PCR扩增;
所述引物组合包括用于扩增分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383的引物;所述分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383如权利要求1所述;
用于扩增分子标记rs14219226的引物如SEQ ID NO.1-2所示;
用于扩增分子标记rs14342189的引物如SEQ ID NO.3-4所示;
用于扩增分子标记rs318129041的引物如SEQ ID NO.5-6所示;
用于扩增分子标记rs315853113的引物如SEQ ID NO.7-8所示;
用于扩增分子标记rs733815383的引物如SEQ ID NO.9-10所示;
(3)分析PCR扩增产物,判断肉鸡遗传潜质,留种、繁种;
步骤(3)包括:对扩增产物进行等位基因检测,根据基因分型结果判定如下:
若分子标记rs14219226对应的多态性位点的基因型为CC,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平;
若分子标记rs14342189对应的多态性位点的基因型为CC,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平和低剩余采食量水平;
若分子标记rs318129041对应的多态性位点的基因型为TT,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平和低剩余采食量水平;
若分子标记rs315853113对应的多态性位点的基因型为TT,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平;
若分子标记rs733815383对应的多态性位点的基因型为CC,判断待测肉鸡具有低腹脂率水平。
3.利用整合分子标记进行高饲料转化效率肉鸡的基因组选择的育种方法,其特征在于,包括:
(1)构建参考群体,测定腹脂率和剩余采食量的相关性状并提取DNA,利用鸡全基因组SNP芯片对所有参考样本进行全基因组SNP分型,并对基因分型后的数据进行处理和质量控制;
(2)建立待测群体、提取DNA,利用鸡全基因组SNP芯片对所有待测样本进行全基因组SNP分型,并对基因分型后的数据进行处理和质量控制;
步骤(1)-(2)中,所述鸡全基因组SNP芯片中包括分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383,分子标记rs14219226、rs14342189、rs318129041、rs315853113和rs733815383如权利要求1中所述;
(3)利用步骤(1)中获得的参考群体每个个体的AFP和RFI表型值、参考群体每个个体全基因组所有位点的基因型、步骤(2)中获得的待测群体每一个个体的全基因组基因型,和参考群体和所有待留种个体的系谱记录,进行基因组估计育种值估计;
(4)选择基因组估计育种值高的待测个体作为亲本,留种组建家系;
基因组估计育种值估计包括:
(a)权重G矩阵构建:
矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平得到,Gsnp代表基于5个分子标记构建的亲缘关系矩阵,G1代表基于鸡全基因组SNP芯片构建的基因组亲缘关系矩阵;所述5个分子标记为权利要求1中所述的分子标记组合;
设置G1和的相对权重公式为:/>公式中,G2代表权重G矩阵,c=0.9,d=0.1;
(b)H矩阵构建
矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵A22的水平得到G*,设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw=0.95*G*+0.05*A22;获得合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵H-1;
(c)育种值估计。
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