CN112011623A - 与母猪产活仔数和有效活仔数性状相关的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子标记筛选技术领域，具体涉及与母猪产活仔数和有效活仔数性状相关的分子标记。所述的分子标记从ALCAM基因中筛选得到，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。在所述SEQ ID NO：1所示序列的第101位有一个C或T的碱基替换。本发明为猪的标记辅助选择提供了新的分子标记资源。
Description
技术领域
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及与母猪产活仔数和有效活仔数性状相关的分子标记及应用。
背景技术
中国是全球第一大猪肉生产国和消费国，在养猪生产中，猪产仔数是最重要的繁殖性状之一，它的高低直接影响养猪效率。产活仔数是出生时存活的仔猪数，有效活仔数是出生时除了弱仔和畸形以外的其它活仔猪总数。在育种实践中，对这两个繁殖性状进行选育可以有效改善猪产仔数性状，进而提高养猪效率。
产仔数性状是由微效多基因控制的低遗传力繁殖性状。目前，考虑多基因效应的基因组辅助最佳线性无偏预测(GBLUP，genomic best linear unbiased prediction)方法已经开始应用于猪的育种实践中，这种方式将加快对低遗传力繁殖性状的育种进程。单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)是一种在育种中运用较多的DNA分子标记，文献报道目前已经发现88个与猪产活仔数相关的SNP位点(Bakoev et al.2020)。但继续寻找新的与猪产仔数性状相关的SNP位点对提高猪产仔数仍具有重要的意义，目前寻找与特定性状相关联SNP的一种思路是在与性状相关的候选基因中筛选SNP位点，随后群体中对SNP位点进行分型，最后通过关联分析确定与性状显著关联的SNP位点。
白细胞激活黏附因子(ALCAM，activated leukocyte cell adhesion molecule)是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，它可以参与相邻细胞之间ALCAM-ALCAM或ALCAM-CD6的粘附作用(Singh et al.2009)。文献报道ALCAM在人胚胎和子宫内膜上皮细胞表达，并且在胚胎中具有时期特异表达模式(Fujiwara et al.2003)。在猪妊娠早期子宫中，ALCAM在子宫腔上皮细胞、腺体上皮细胞和孕体滋养外胚层细胞表达，并且在妊娠12天子宫内膜中表达量达到峰值(Kim et al.2011)。在我们的转录组测序数据中，ALCAM在妊娠12天子宫系膜侧子宫内膜相对于妊娠15天子宫系膜侧子宫内膜高表达，这些研究都说明ALCAM可能在胚胎附植和妊娠维持的过程中发挥了重要作用，并最终影响猪产仔数。所以本发明选择ALCAM为候选基因，通过筛选ALCAM中的SNP位点并对该位点进行基因型分型，并与猪繁殖性状进行关联分析，从而筛选出与母猪产活仔数和有效活仔数性状相关的分子标记。
本发明对ALCAM基因的SNP位点进行分型并与繁殖性状进行了关联分析，发现该位点与猪产活仔数和有效活仔数性状显著关联，这在育种实践中对提高猪产活仔数和有效活仔数性状具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于筛选一种与猪产活仔数和有效活仔数性状相关的分子标记及其应用，提供猪ALCAM基因中单核苷酸多态性(SNP)分子标记在猪产活仔数和有效活仔数性状筛选检测中的应用。
本发明的技术方案如下所述：
申请人从本实验室RNA-seq测序数据中发现ALCAM在猪妊娠12天和15天子宫系膜侧子宫内膜中差异表达，结合文献中对ALCAM的报道，申请人推测ALCAM基因中的SNP位点可能与猪繁殖性状相关。随后申请人在猪SNP数据库中查询到猪ALCAM基因的SNP位点，该位点位于Ensembl网站猪11.1版本基因组13号染色体153797527bp处，该分子标记上下游100bp的核苷酸序列如下所示：
TAAAAATTCTCAACAACTCAGAAAAATTCTTTGTGGAAGAGCTGCAGCGATACCTGAGATTACAGCTGGGTTCAGGGACAATGGAATTTTATAAAAAGCTYTTATGAAATATCACTTTTAGTATAAAGCATATGTTTATTGTGAAATTATCACTATGGTAACTTATCTGAATTAAGTTTTTCTCATCATTTCAGAGAAAAA，
上述序列的第101位中的Y是是一个等位碱基替换，即，由C替换为T。
随后申请人使用竞争性等位基因特异性PCR技术对ALCAM基因中的SNP位点进行分型，使用引物的DNA序列如下所示：
正向引物-C：
5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(FAM接头序列)
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGGACAATGGAATTTTATAAAAAGCTC-3'，
正向引物-T：
5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(HEX接头序列)
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGGACAATGGAATTTTATAAAAAGCTT-3'，
反向引物：5'-TGATAATTTCACAATAAACATATGCTTTATACTAAAAG-3'。
通过检测PCR产物的荧光信号得到SNP分型结果，将基因型与猪繁殖性状进行关联分析，发现该SNP与母猪的产活仔数和有效活仔数性状显著关联(P<0.05)，这为猪繁殖性状的标记辅助选择提供新的分子标记。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
图1：是本发明主要技术流程示意图。
图2：是ALCAM基因在猪妊娠12天和15天子宫系膜侧子宫内膜样品中的表达量柱状图。附图标记说明：D12-M代表猪妊娠12天子宫内膜，D15-M代表猪妊娠15天子宫内膜，**代表P-value<0.01。
图3：ALCAM基因竞争性等位基因特异性PCR荧光信号分型结果图。附图标记说明：红色圆点为基因型TT型个体，绿色圆点为TC型个体，蓝色圆点为CC型个体。
图4：是本发明制备的分子标记的核苷酸序列图。其中序列表中的“Y”为等位基因突变，即SNP位点：第101位的碱基Y由碱基C替换为碱基T。
具体实施方式
对序列表的说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的分子标记序列。该分子标记是猪ALCAM基因SNP位点上下游100bp的核苷酸序列。序列长度为201bp，在该序列的101位序列Y为等位基因突变后的序列(即碱基替换)，SNP位点，Y为等位碱基替换，由碱基C替换为碱基T，该序列101位的碱基是突变后的碱基T。
实施实例1
(一)猪ALCAM基因在猪妊娠12天和15天子宫系膜侧子宫内膜间的差异分析
采集母猪(品种为丹系大白猪，来自中国广西自治区某猪场)妊娠12天和15天子宫系膜侧子宫内膜样品进行转录组测序，对测序得到的clean data文件通过HISAT2软件比对到Ensembl数据库猪11.1基因组生成sam文件。通过samtools软件将sam文件转化成bam文件，最后通过HTseq软件对bam文件进行基因计数生成readcounts文件。将全部子宫内膜样品的readcounts文件合并成表达矩阵后使用DEseq2软件进行差异表达基因分析。在得到的差异表达基因中，申请人发现ALCAM在妊娠12天系膜侧子宫内膜的表达量显著高于妊娠15天系膜侧子宫内膜。ALCAM基因在猪妊娠12天和15天子宫系膜侧子宫内膜样品中的表达量如图2所示。
(二)竞争性等位基因特异性PCR对SNP分型
从Ensembl上筛选猪ALCAM基因中的SNP位点并下载SNP上下游100bp的序列(猪11.1版本基因组13:153797427-153797627，ALCAM位于负链，需要将下载的基因组序列反向互补)，设计引物，所述引物的DNA序列如下：
正向引物-C：
5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(FAM接头序列)
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGGACAATGGAATTTTATAAAAAGCTC-3'，
正向引物-T：
5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(HEX接头序列)
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGGACAATGGAATTTTATAAAAAGCTT-3'，
反向引物：5'-TGATAATTTCACAATAAACATATGCTTTATACTAAAAG-3'。
将引物稀释成100μmol，并按照体积比12:12:30:46(正向引物-C:正向引物-T:反向引物:ddH2O)混匀成100μl引物预混液。
PCR反应体系如下：
PCR反应程序：94℃预变性15min，94℃20s(变性)—61-55℃1min(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每个循环降低0.6℃)，94℃20s(变性)—55℃60s继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。三种基因型TT、TC、CC如图3所述。
(三)本发明的分子标记在猪繁殖性状(产活仔数和有效活仔数)标记性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国广西自治区某猪场的丹系大白猪，包括389头母猪，并对全部母猪的SNP位点进行基因型检测，确定其基因型。繁殖性状取自上述猪场的第一胎繁殖记录资料，记录母猪繁殖性状包括产活仔数(NBA)和有效活仔数(ENBA)。
基因型与繁殖性状间的关联分析使用SAS自编程序语言，采用固定线性模型进行计算。具体模型如下：
y＝μ+g+m+e
其中，y表示性状观测值(表型值)，包括产活仔数和有效活仔数；μ表示表型的群体均值；g表示基因型效应，为固定效应；m表示配种季节效应，为固定效应，配种季节根据当地四季划分为4个水平；e表示随机残差效应，假定服从N～(0，σ2)分布(结果见表1)。
表1猪ALCAM基因SNP位点与1胎母猪产活仔数和有效活仔数的关联分析结果
注：表中不同大写字母表示差异显著
对大白猪ALCAM基因多态性位点进行性状关联分析，该突变位点分型猪样本数为389头母猪，包括15头CC基因型的母猪，122头TC基因型的母猪，252头TT基因型的母猪。运用关联分析方法，发现此SNP与母猪的产活仔数和有效活仔数有显著关联(P<0.05)，其中TT基因型母猪的产活仔数和有效活仔数均显著低于TC基因型母猪。
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<211> 201
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(201)
<220>
<221> mutation
<222> (101)..(101)
<400> 1
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gtataaagca tatgtttatt gtgaaattat cactatggta acttatctga attaagtttt 180
tctcatcatt tcagagaaaa a 201
Claims (2)
1.与母猪产活仔数和有效活仔数性状检测相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：
TAAAAATTCTCAACAACTCAGAAAAATTCTTTGTGGAAGAGCTGCAGCGATACCTGAGATTACAGCTGGGTTCAGGGACAATGGAATTTTATAAAAAGCTYTTATGAAATATCACTTTTAGTATAAAGCATATGTTTATTGTGAAATTATCACTATGGTAACTTATCTGAATTAAGTTTTTCTCATCATTTCAGAGAAAAA，
上述序列的第101位中的Y是一个等位碱基替换，由C替换为T。
2.权利要求1所述的分子标记在猪产活仔数和有效活仔数性状检测中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637768A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-12 | 华南农业大学 | 一种猪13号染色体上与母猪产畸形仔猪数相关的snp分子标记及其用途 |
| CN113637768B (zh) * | 2021-08-06 | 2023-07-14 | 华南农业大学 | 一种猪13号染色体上与母猪产畸形仔猪数相关的snp分子标记及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112011623B (zh) | 2022-05-10 |
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