CN108796093A - 与母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记及应用 - Google Patents

与母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及与母猪产活仔数和5日龄活仔数关联的分子标记及应用。所述的分子标记克隆自EXOC6B基因片段，该基因片段位于在母猪3号染色体上(rs328171313)，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在该序列的113位碱基处有一个T/C的等位基因突变，该突变导致PCR‑MboI‑RFLP多态性。本发明还公开了该标记在母猪产活仔数(NBA)和5日龄活仔数(LS5)关联分析中的应用。

Description

与母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记及应用
技术领域
本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及与母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记及应用。所述的分子标记克隆自EXOC6B基因片段，该基因片段基因位于母猪3号染色体上。该标记可在母猪繁殖性状相关的检测中和标记辅助选育中应用。
背景技术
母猪繁殖性状的巨大潜在经济价值，直接决定了其在遗传育种改良中的重要地位。近十几年，随着分子生物学技术的快速发展，对母猪繁殖性能的改良也逐见成效。现阶段主要通过标记辅助选择和基因组选择方法对母猪繁殖性状进行选育，实现对母猪繁殖性能的改良，但目前与猪繁殖性状相关的分子标记依然十分有限。Hidalgo等(Hidalgo etal，2016)在大白和长白母猪中对妊娠期长进行GWAS分析，发现在大白猪5号染色体上有4个SNP显著关联，在长白猪2号染色体上有3个显著关联的SNP，并找到长白猪妊娠期的候选基因。Schneider等(Schneider et al，2015)对母猪产仔间隔进行分析，找到24个与产仔间隔显著关联的SNP，并发现3个候选基因。与母猪5日龄活仔数关联的分子标记的报道更少，而5日龄活仔数作为一个重要的育种指标，具有相当高的研究潜力。十几年前，丹麦育种中心将5日龄的活仔数作为母猪的主要选育目标，经过丹麦育种中心10年的持续选择，母猪繁殖性能获得了显著提高。在2006年到2011年期间，丹麦育种中心大白猪和长白猪的5日龄活仔数提高了1.8头左右，如果母猪的年产胎次按2.4胎算，每年丹麦育种中心每头母猪将可增加断奶仔猪4.32头(赵志伟，2013)。并且在2007年，Su等(Su et al，2007)对1万头母猪(大白猪和长白猪)的繁殖数据进行分析发现，从仔猪出生第1日到21日龄期间，在5日龄的活仔数的遗传力最高，而且5日龄活仔数与断奶仔猪数的相关性高达0.995。由此可见，研究改良母猪5日龄活仔数，对母猪繁殖性状的改良具有十分重要的意义。
本发明涉及的突变位点在数据库中已存在，但其与母猪繁殖性状的关联分析数据尚未见报道。本发明检测了该位点在试验群体中的多态性，并检测了其在母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联分析中的应用。这些成果均没有报道。
发明内容
发明的目的在于克服现有技术的缺陷，筛选一种与母猪的产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记的应用。该分子标记所述的分子标记克隆自EXOC6B基因(基因登录号为rs328171313)，该基因片段位于母猪3号染色体上。通过对猪3号染色体上的SNP位点进行分型，对分型成功的SNP位点与母猪繁殖性状(主要是)进行了关联分析，寻找与母猪繁殖性状显著关联的分子标记。关联分析表明，该分子标记与猪产活仔数和5日龄活仔数性状相关。
本发明的技术方案如下：
申请人通过筛选得到一种与母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记，该分子标记核苷酸序列如下所示：
TTATTATCCAGTGTGTTATCCATTTTCTTTCCTCATATGTTAACATAGTGTCAGTTGGTCATTACTCCAGACACTTTGGGTGGACTTTATGGCCTGAAGTATTTTTGGTGATY(C/T)TCCAGTAGTTTGAGCAAAGACCTGGTAGCTTCTTCTCCTCTCTTTTCTTTCCCCCTCCCATTTCTCTTCTTCTTCCCTCTTCCCTTCTCTCTCTTGTCATATTCTGTATTCCTTCTATTTATCATTCTTATTATATAAAATGAAGCAAGATATAAAGTTGTTTGAAAGCCTCTAAGTAGACACTTTATTTTCAATCTCATGTACAGAAAATTAAATAAATTATATTAGTTTGTGAAATACTGTTCATCATTTCATACACAGTCCCCTATTTTATTTTATTTTATTTTTTTCCGTAAGCCCACTTGTCTCTTATCCCCAAGTACACTAACTCTAATATGTTTAATACGTAGTGATTGGTTATGCTTGTGTCCTTGAAAAATATATAGTGACTGTGTATGTATATGTTTTTAACTTGTTCTAATGGTATGTTCTTATGGACCTAGCTCTATTACTTATATCTTCTTTGGTACTATTTTTAATATTTATTCTCATTACAGTCTATATATCTAACTCATTGCCTCGCAG，
上述序列的第113位的Y是C或T，该突变导致PCR-MboI-RFLP多态性。
申请人提供了一种克隆EXOC6B基因片段和检测上述片段的分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：
正向引物：TTATTATCCAGTGTGTTATC，
反向引物：CTGCGAGGCAATGAGTTAGA。
申请人提供了一种与猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记的筛选和应用方法，其步骤如下所述：
(1)依据Ensmble 11.1版本数据库里3号染色体上的SNP位点信息，筛选得到到rs328171313位点，该位点对应的基因是EXOC6B基因(登录号为rs328171313)；
(2)提取猪基因组DNA，根据Ensmble 11.1版本公布的参考基因组设计引物(正向引物：5’-TTATTATCCAGTGTGTTATC-3’和反向引物：5’-CTGCGAGGCAATGAGTTAGA-3’)，用这些引物对进行PCR扩增，得到长度为638bp的片段，该片段序列信息如SEQ ID NO:1和图1所示，其电泳结果如图3所示，将PCR产物送至武汉擎科生物公司测序对该位点的多态性进行检测，结果如图2所示；本发明利用PCR-RFLP方法对该位点进行多态性检测，结果如图4所示；
(4)本发明对该位点的不同基因型与产活仔数和5日龄活仔数进行关联分析；
(5)SNP检测方法建立：申请人设计了扩增引物，扩增了包含该SNP目标DNA序列。扩增得到638bp的片段的核苷酸序列，在该序列的第113位碱基处存在一个等位基因的突变(C/T)，该突变导致PCR-MboI-RFLP多态性。关联分析表明：在本发明的基因分型中存在3种基因型，引发一个MboI的酶切位点，即：CC基因型(109bp、529bp)，CT基因型(109bp、529bp、638bp)，TT基因型(638bp)。酶切电泳结果证实了靶序列中存在该突变位点。
本发明的分子标记可在母猪产活仔数和5日龄活仔数性状辅助选择中应用。
本发明的引物对可在母猪产活仔数和5日龄活仔数性状标记辅助选择中应用。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是本发明扩增得到的核苷酸序列，该序列即是本发明筛选的分子标记，在该序列的第113位的碱基Y是C或T(序列表中该113位突变位点为了表述方便实例是T，C或T可以互换)，该突变导致PCR-MboI-RFLP多态性。其中第113位的碱基是突变后的碱基T。
图1：利用Ensmble11.1版本参考基因组中设计引物后扩增的部分核苷酸序列，序列长度为638bp，该序列即是本发明筛选的分子标记，在该序列的第113位的碱基Y是T或C，该突变导致PCR-MboI-RFLP多态性。附图标记说明：图1中的下划线部分是PCR扩增该位点的引物序列。
图2：是本发明筛选的分子标记包含突变位点的测序结果图。
图3：是本发明筛选的分子标记突变位点的PCR产物电泳图。附图标记说明：图3中：M泳道为DNA分子量标记(DL2000)；扩增产物为638bp。
图4：是本发明筛选的分子标记突变位点(rs32817131)的MboI-RFLP多态性的基因分型出现的三种基因型(即：CC CT TT)电泳结果。附图标记说明：M泳道为DNA分子量标记(DL2000)，Product为PCR产物。
具体实施方式
实施例1利用测序和PCR-RFLP方法鉴定多态性
(1)引物序列：
正向引物：5’-TTATTATCCAGTGTGTTATC-3’，
反向引物：5’-CTGCGAGGCAATGAGTTAGA-3’；
(2)PCR扩增条件
PCR反应总体积为10μl，其中猪基因组DNA约50ng，5μLPCR Mix，正向引物、反向引物各0.2μl。PCR扩增程序为：94℃5min，循环30次94℃30s，53℃30s，然后72℃40s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到638bp特异扩增片段，结果如图3所示。将PCR扩增所得序列送至武汉擎科生物公司测序，测序结果如图2所示。测序结果发现该638bp片段存在一个MboI酶切位点，其中第113bp处为多态性位点。
(3)PCR-RFLP检测条件
PCR产物酶切反应体积是15μl，其中1×buffer 1.5μL，PCR产物10μL，限制性内切酶MboI为1μL(5U)，用双蒸水补足至15μL，将样品混匀后离心，37℃水浴，过夜酶切，用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照，结果如图4所示。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第113bp位置是T时，则该MboI酶切位点不存在，MboI酶切后检测结果只有1个片段，长度是638bp(定为等位基因T)；但存在T113→C113替换时，其结果导致第109bp处一个MboI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为529bp和109bp(定为等位基因C)，三种基因型为TT、CT、CC。
实施例2本发明的分子标记在猪产活仔数性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国南方某猪场的大白猪，包括811头母猪，其中丹系大白547头，美系大白264头。繁殖性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料，记录母猪繁殖性状包括产活仔数(NBA)和5日龄活仔数等指标性状。
根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构，申请人运用混合线性模型来统计分析SNP位点rs328171313的基因型效应及其与产活仔数的关系。采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状分析，具体模型如下：
美系大白猪：Yijlm＝μ+genei+parityj+mate_seasonl+eijlm+TNB
其中：Y为性状值，μ为总体均数，其中固定效应包括：基因型效应genei，胎次效应parityj；随机效应包括：配种季节效应mate_seasonl；e为随机误差；TNB为协变量。
对大白猪位点rs328171313的多态性在美系大白猪群体中进行性状关联分析，该突变位点在美系大白猪成功分型264头母猪，包括42个TT基因型的母猪，产仔185窝；142个TC基因型的母猪，产仔624窝；80个CC基因型的母猪，产仔373窝。运用关联分析方法，发现此SNP与美系大白猪第2胎的活仔数有显著关联(P<0.05)，其中CC基因型母猪的活仔数显著高于CT基因型母猪。结果见表1。
表1位点rs328171313与美系大白母猪第2胎产活仔数的关联分析结果
注：表1中的基因型差值是各基因型的表型均值差，P<0.05代表有显著性差异，P<0.01代表有极显著差异。
实施例3本发明的分子标记在猪5日龄活仔数标记性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国南方某猪场的大白猪，包括811头母猪，其中丹系大白547头，美系大白264头。繁殖性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料，记录母猪繁殖性状包括产活仔数(NBA)和5日龄活仔数等性状指标。
根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构，申请人运用混合线性模型来统计分析SNP位点rs328171313的基因型效应及其与5日龄活仔数的关系。采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状分析，具体模型如下：
美系大白猪：Yijlm＝μ+genei+parityj+mate_seasonl+eijlm+TNB
其中：Y为性状值，μ为总体均数，其中固定效应包括：基因型效应genei，胎次效应parityj；随机效应包括：配种季节效应mate_seasonl；e为随机误差；TNB为协变量。
对大白猪位点rs328171313的多态性在美系大白猪群体中进行性状关联分析(结果见表2)，该突变位点在美系大白猪成功分型264头母猪，包括42个TT基因型的母猪，产仔185窝；142个TC基因型的母猪，产仔624窝；80个CC基因型的母猪，产仔373窝。
表2位点rs328171313与美系大白母猪(3胎及以上)5日龄活仔数的关联分析结果
注：表2中的基因型差值是各基因型的表型均值差，P<0.05代表有显著性差异，P<0.01代表有极显著差异。
运用关联分析方法，发现此SNP与美系大白猪(3胎及以上)的5日龄活仔数有显著关联(P<0.05)，其中TT基因型母猪的5日龄活仔数显著高于CC基因型母猪。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 与母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联的分子标记
<141> 2018-06-25
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 638
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(638)
<220>
<221> mutation
<222> (113)..(113)
<400> 1
ttattatcca gtgtgttatc cattttcttt cctcatatgt taacatagtg tcagttggtc 60
attactccag acactttggg tggactttat ggcctgaagt atttttggtg atttccagta 120
gtttgagcaa agacctggta gcttcttctc ctctcttttc tttccccctc ccatttctct 180
tcttcttccc tcttcccttc tctctcttgt catattctgt attccttcta tttatcattc 240
ttattatata aaatgaagca agatataaag ttgtttgaaa gcctctaagt agacacttta 300
ttttcaatct catgtacaga aaattaaata aattatatta gtttgtgaaa tactgttcat 360
catttcatac acagtcccct attttatttt attttatttt tttccgtaag cccacttgtc 420
tcttatcccc aagtacacta actctaatat gtttaatacg tagtgattgg ttatgcttgt 480
gtccttgaaa aatatatagt gactgtgtat gtatatgttt ttaacttgtt ctaatggtat 540
gttcttatgg acctagctct attacttata tcttctttgg tactattttt aatatttatt 600
ctcattacag tctatatatc taactcattg cctcgcag 638
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 2
ttattatcca gtgtgttatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 3
ctgcgaggca atgagttaga 20

Claims (3)

1.EXOC6B基因片段的分子标记PCR-MboI-RFLP在母猪产活仔数和5日龄活仔数性状关联分析中的应用，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ IDNO:1所示的第113位有一个的C或T的等位基因突变，该突变导致PCR-MboI-RFLP多态性。
2.一种检测EXOC6B基因片段PCR-MboI-RFLP的分子标记的引物对，其特征在于，所述的分子标记引物对的DNA序列如下所示：
正向引物：TTATTATCCAGTGTGTTATC，
反向引物：CTGCGAGGCAATGAGTTAGA。
3.权利要求2所述引物对在母猪产活仔数和5日龄活仔数性状标记关联分析中的应用。
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