CN102409065A - 一种提高动物繁育力的新型shRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高动物繁育力的新型shRNA及其应用，其特征是包含基因序列Sequnence NO.15和Sequnence NO.16。本发明针对绵羊干扰素INHA基因α亚基的核苷酸序列设计合成多对shRNA单链寡核苷酸，构建了INHA shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA，通过RT-PCR法进行干扰效果筛选，得到了抑制效果良好的pGFP-V-RS-shRNA3载体，该载体包含基因序列Sequnence NO.15和Sequnence NO.16，进一步将基因序列Sequnence NO.15和Sequnence NO.16构建到shRNA慢病毒干扰载体pLenti6-shRNA3。本发明还公开了上述新型载体的应用。

Description

一种提高动物繁育力的新型shRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型载体的构建。具体而言，本发明针对绵羊干扰素INHA基因的α亚基的核苷酸序列设计合成shRNA单链寡核苷酸，构建了shRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型载体。

背景技术

抑制素(Inhibin，INH)是一种能够通过垂体负反馈调节卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)分泌的肽类性腺激素。它属于转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员，主要由雌性动物的卵巢颗粒细胞和雄性动物的睾丸支持细胞及睾丸间质细胞[Hayes FJ，Hall JE，Boepple PA，Crowley WF，Jr.Clinicalreview 96：Differential control of gonadotropin secretion in the human：endocrinerole of inhibin.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(6)：1835-41.]分泌并广泛分布于动物体的多个器官中。根据抑制素的分子组成可将其分为抑制素A、抑制素B等多种类型。抑制素最早是由McCullough[McCullagh DR.Dual Endocrine Activityof the Testes.Science，1932，76(1957)：19-20.]在牛睾丸水溶液提取物中发现的，因其具有强烈抑制卵泡刺激素(FSH)、轻微抑制促黄体素(LH)的作用而得名。

抑制素是一种异二聚体糖蛋白(姜庆林等，2005)，它由一个α亚基(～20kDa)和四种β亚基(～14kDa)——βA、βB、βC和βE之一所构成，α亚基与β亚基之间以二硫键相连形成抑制素A(α，βA)、抑制素B(α，βB)等多种抑制素亚型，只有当α亚基与β亚基相结合时抑制素才具有生物活性。此外，抑制素的β亚基还存在于另一种与抑制素具有截然相反生物学作用的二聚体分子——激活素(Activins，ACN)中。这一事实表明α亚基对于抑制素具有特异性。抑制素α亚基上有糖基化位点，是抑制素的生物活性中心，也是抑制素发挥生物活性所必需的位点。

使用放射免疫分析法对灵长动物的卵巢进行检测，发现在晚期卵泡期阳性抑制素适度增加，并在月经周期与LH潮一起达到峰值[McLachlan RI，RobertsonDM，Healy DL，Burger HG，de Kretser DM.Circulating immunoreactive inhibinlevels during the normal human menstrual cycle.J Clin Endocrinol Metab，1987，65(5)：954-61.]。在黄体期观察到的抑制素最高水平与灵长类月经周期中较高的孕酮水平呈正相关。抑制素对卵泡形成发挥刺激效应，并可能调控卵泡生长、发育、闭锁、卵母细胞成熟及精子产生[Woodruff TK，Lyon RJ，Hansen SE，Rice GC，Mather JP.Inhibin and activin locally regulate rat ovarian folliculogenesis.Endocrinology，1990，127(6)：3196-205.]。在生理状况下抑制素能选择性地抑制垂体合成和分泌促卵泡素，从而影响卵巢上卵泡的发育和成熟，是调节家畜繁殖力的重要生殖激素之一。

利用荧光原位杂交方法和遗传连锁分析方法，INHA已在人、小鼠、猪、牛和羊等动物中得到精细定位。抑制素与多种动物的生殖机能相关，INHA基因变异会导致动物生殖机能改变或异常[XUE Yu，CHU Ming-Xing，ZHOUZhong-Xiao.Advances on inhibin genes.Hereditas(Beijing)，2004，26(5)：749-755.]。在人类疾病研究中，抑制素基因多作为卵巢早衰的候选基因，Shelling等扫描了整个基因组INHA基因序列，发现INHA第2外显子内769G→A变异可能与卵巢早衰有关，Marozzi等[Marozzi A，Porta C，Vegetti W，Crosignani PG，Tibiletti MG，Dalpra L，Ginelli E.Mutation analysis of the inhibin αgene in a cohortof Italian women affected by ovarian failure.Hum Reprod，2002，17(7)：1741-1745.]的研究证明INHA基因与卵巢早衰显著相关，陈绚丽等的研究也证明该突变对人卵巢功能有严重影响。

近来研究表明抑制素α亚基与动物繁殖性能之间存在密切的关系。对高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间抑制素α亚基基因多态性的研究发现，高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间基因型分布差异都极显著(P＜0.01)。田秀娥等[田秀娥，孙红霞，王永军.3个绵羊群体INHA基因的遗传多态性及对产羔数的影响.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(1)：23-29.]用PCR-SSCP方法检测和分析3个绵羊品种(滩羊、蒙古羊和小尾寒羊)INHA基因的多态性，研究不同基因型对产羔数的影响，发现滩羊、蒙古羊和小尾寒羊P1(5′调控区282核苷酸处发生的1处A→G突变)位点C、D基因频率分别为0.840和0.160，0.852和0.148及0.162和0.838，均处于中度多态；P2位点E、F基因频率分别为0.784和0.216，0.787和0.213及1.000和0.000，滩羊和蒙古羊在该位点均处于中度多态；引物P3扩增片段中，滩羊和蒙古羊表现为A、B和C三种单倍体基因型，而小尾寒羊仅表现出A和B2种基因型。

由于INHA基因在绵羊繁殖力上发挥重要作用，近年来，许多利用抑制素免疫的方法提高山羊、绵羊、奶牛和小鼠等繁殖力的研究取得了显著成果。Li Han等[Li Han，D.G.Mao，D.K.Zhang，A.X.Liang，M.Fang，MuhammadMoaeen-ud-Din，L.G.Yang.Development and evaluation of a novel DNA vaccineexpressing inhibin α(1-32)fragment for improving the fertility in rats andsheep.Animal Reproduction Science，2007，109(2008)：251-265.]将抑制素α亚基(1-32)片段插入到HBsAg-S的羧基端，构建出一种抑制素DNA疫苗。用这种疫苗免疫40只绵羊，结果发现经过绵羊的实验组绵羊的双胎率(39.2％)显著高于对照组绵羊的双胎率(10％)(P＜0.05)。结果表明用针对抑制素构建的DNA疫苗进行免疫可诱导产生更多的卵泡，从而增加产仔数。

RNA干扰(RNAi)最初被提出是在对秀丽线虫的研究中。1998年，Fire等在研究隐杆线虫(Celeg ans)基因功能时发现纯化的双链RNA比反义RNA更能高效、特异性阻断特定基因的表达，并导致整个线虫的同源基因沉默，而且还能阻断其子代第一代同源基因的表达，这一现象被称为RNAi。RNA干扰技术是一种新兴且日益成熟的的基因沉默技术，目前已被认为是基因工程学领域的一种非常高效的研究工具。它是一种封闭基因表达的有效方法，它通过将双链RNA(dsRNA)导人细胞后，在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(siRNA)，使与该段RNA同源的目的mRNA产生特异性降解，从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象。用此技术可以高效、稳定、特异地阻止目的基因的表达，从而达到较为理想的沉默效果。

在哺乳动物的RNA干扰(RNA interference，RNAi)研究中，两类小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)被广泛用于抑制外源基因和内源基因的表达；人工合成的siRNA和载体表达的siRNA(即生物体内转录的siRNA)，而这种载体表达的siRNA一般由小片段发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)产生[Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of shortinterfering RNAs in mammalian cells.Science，2002，296(5567)：550-553.]。近年的研究表明，具有茎环结构的shRNA分子比在细胞中同时表达的siRNA分子的正义链与反义链对靶基因的抑制效率要高，shRNAs通过稳定转染的质粒载体或整合的反转录病毒载体、慢病毒载体进行表达，能够长效的抑制基因表达[Sontheimer EJ，Carthew RW.Silence from within：endogenous siRNAs andmiRNAs.Cell，2005，122(1)：9-12]。所以，在哺乳动物RNAi试验研究中，如需要持久抑制基因表达，最恰当的方法是利用质粒或反转录病毒载体表达shRNA。

Gustavo Tiscornia，et al.(2003)报道了一种由鼠U6启动子控制shRNA表达的慢病毒载体(pLL3.7)，在其U6启动子下游紧接多克隆位点(MCS)，为RNAi茎环结构序列的插入提供了方便；并可表达报告基因EGFP[Tiscornia G，Singer O，Ikawa M，et al.A general method for gene knock down in mice by using lentiviralvectors expressing small interfering RNA Proc Natl Acad Sci，2003，100(18)：1844-1848]。载体pLL3.7能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

抑制素主动免疫这种方法只对亲代动物起作用，并不能将亲代高繁育性状传递给子代动物。为了解决这一问题，本发明从shRNA入手，构建了针对绵羊抑制素α亚基的shRNA慢病毒干扰载体，通过性腺转基因法获得了转基因阳性高繁育力的小尾寒羊，为高繁殖力绵羊新品种培育奠定基础。

发明内容

本发明公布了一种提高动物繁育力的新型干扰载体pLenti6-shRNA3，所述shRNA慢病毒干扰载体包含基因序列Sequnence NO.15、Sequnence NO.16。

本发明根据INHA基因序列设计合成了4个shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA。

本发明通过重叠PCR的方法克隆了INHA全长基因，并构建了INHA高表达的载体pIRES2-eGFP-INHA。

本发明将shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA和INHA高表达的载体pIRES2-eGFP-INHA共转染293T细胞，通过RT-PCR法进行干扰效果筛选。

本发明将干扰效果最好的shRNA片段shRNA3构建成pENTR/U6-shRNA3，并与慢病毒载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST重组，构建慢病毒载体pLenti6-shRNA3。

本发明将获得的慢病毒干扰载体pLenti6-shRNA3用293T细胞进行慢病毒包装，获得了可供细胞转染滴度为2.05¹⁰VP/ml的慢病毒。

本发明将获得的慢病毒液稀释，用于母羊卵泡注射和公羊性腺注射，对16只小尾寒羊母羊进行性腺转基因操作，其余30只母羊输以处理公羊的精液，共产生仔羊41只，取其中4～5月龄的9只仔羊进行检测，经检测4只为转基因阳性小尾寒羊。

本发明将获得的雌性F1代转基因小尾寒羊进行繁育实验，与非转基因小尾寒羊相比其产仔数到了显著的提高。

附图说明

图1shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA3与INHA高效表达载体pIRES2-EGFP-INHA共转染293T细胞(100×)(A：荧光视野；B：可见光视野)。

图2shRNA干扰载体阴性对照pGFP-V-RS-NC与INHA高效表达载体pIRES2-EGFP-INHA共转染293T细胞的荧光结果(100×)(A：荧光视野；B：可见光视野)。

图3各样品中内参(β-actin)的扩增曲线。通过扩增曲线可以得到内参的循环阈值(Ct值)。

图4各样品中内参(β-actin)的熔解曲线。溶解曲线未见杂峰，说明扩增产物单一特异，没有非特异性扩增。

图5各样品中目的基因的扩增曲线。通过扩增曲线可以得到各样品目的基因的Ct值。

图6各样品中目的基因的熔解曲线。溶解曲线未见杂峰，说明扩增产物单一特异，没有非特异性扩增。

图7各干扰质粒对INHA基因的沉默效率。NC为阴性对照，shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4分别为pGFP-V-RS-shRNA1、pGFP-V-RS-shRNA2、pGFP-V-RS-shRNA3、pGFP-V-RS-shRNA4分别和INHA高表达载体共转染293T细胞的INHA基因的mRNA含量。

图8Western Blot方法检测各组细胞INHA蛋白的表达。A图的箭头所指为内参GAPDH，B图的箭头所指为抑制素条带约32KD。泳道1：阴性对照；泳道2、3、4、5分别为pGFP-V-RS-shRNA1、pGFP-V-RS-shRNA2、pGFP-V-RS-shRNA3、pGFP-V-RS-shRNA4分别和INHA高表达载体共转染293T细胞的INHA蛋白的表达量。A为各样品内参，B为与A相同样品的INHA蛋白含量。

图9shRNA干扰载体pENTR/U6-shRNA3测序结果(有效干扰位点：59-87)。

图10慢病毒干扰载体pLenti6-shRNA3测序结果(干扰序列位点：40-68)。

图11实验组绵羊的9只F1代和普通绵羊的3只F1代INHA基因的Q-PCR检测。

图12实验组绵羊的9只F1代血清中INHA蛋白的Western Blot检测。

实施例1绵羊抑制素shRNA慢病毒干扰载体的构建与鉴定

一.研究方法

1.构建shRNA干扰载体

利用Invitrogen公司shRNA在线设计工具http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/针对绵羊INHA基因(L28815.1)的cDNA序列筛选4个shRNA作用靶点。其靶点的DNA序列见序列表SequnenceNO.1、Sequnence NO.2、Sequnence NO.3、Sequnence NO.4。以每条靶序列为5’端，其反向互补序列为3’端，5’端和3’端之间以茎环结构序列相连，再分别于5’端和3’端引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，这就构成了shRNA的编码(模板)序列。然后，再设计出与绵羊体内所有已知的基因编码序列不具有显著相似性(同源性)的1条序列作为阴性对照序列，并为其设计发夹结构。设计的5对序列详情如下：

shRNA1的序列为Sequnence NO.5、Sequnence NO.6，shRNA2的序列为Sequnence NO.7、Sequnence NO.8，shRNA3的序列为Sequnence NO.9、SequnenceNO.10，shRNA4的序列为Sequnence NO.11、Sequnence NO.12，阴性对照序列为Sequnence NO.13、Sequnence NO.14。

将4对合成好的shRNA模板链和阴性对照(neg)寡核苷酸链用双蒸水溶解成100μM，互补单链各取5μl，并将其两两混合，接着按照表1给出的退火反应体系进行退火。再将5对互补的shRNA及neg寡核苷酸单链在95℃条件下加热5分钟，然后放于室温自然冷却20分钟，最终形成双链shRNA表达序列和阴性对照表达序列。

表1 shRNA模板链退火体系

将退火的双链shRNA表达序列和阴性对照序列继续稀释成10nM浓度，加入BamHⅠ和SalⅠ双酶切后，按表2给出体系在室温连接30分钟。

表2 shRNA表达序列连接到表达载体的反应体系

每个转化平板分别挑取3个克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段shRNA序列是否与所设计的shRNA表达序列一致。

2.INHA高表达载体构建

通对INHA基因的编码区进行全序列分析，设计单链oligo引物，并在序列的两端制造粘性末端。利用重叠PCR技术将合成的oligo拼接成完整的基因；将合成好的序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α；挑取单克隆扩大培养，利用质粒提取试剂盒，提取质粒进行酶切定，将阳性克隆质粒用XhoI和EcoRI酶切后连接至目的载体pIRES2-eGFP，并转化到感受态细胞DH5α中；测序验证重组克隆中目的基因片段的序列信息，获得正确的INHA高效表达载体。

3.shRNA干扰载体的筛选

1)shRNA干扰载体和INHA高表达载体的扩增

分别接种干扰质粒和高表达载体菌液至5ml LB培养液中，37℃摇床(220rpm)过夜，用HQ高纯度质粒抽提试剂盒提取相应质粒。

2)shRNA干扰载体和INHA高表达载体的细胞共转染

将生长状态良好的HEK293细胞消化计数后，按照每孔5×10⁵个细胞接种于六孔板中。待细胞生长状态稳定，融合率在80％左右时，进行转染实验；用无血清Opti-MEM轻洗孔底细胞一次，加入1.5ml Opti-MEM；分别用250μlOpti-MEM培养液稀释3μg干扰质粒pGFP-V-RS-shRNA1、pGFP-V-RS-shRNA2、pGFP-V-RS-shRNA3、pGFP-V-RS-shRNA4和pGFP-V-RS-NC以及1μg INHA高表达质粒，轻轻混匀。用250ul Opti-MEM稀释10ul Lipofectamine 2000试剂，轻轻混匀，室温孵育5min；轻轻混合已稀释质粒和Lipofectamine 2000稀释液，室温放置20分钟；将每管500ul脂质体质粒复合物慢慢加入到各细胞孔中，轻轻混匀；在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养5小时后，换上完全培养液(不含抗生素)，放置在37℃，5％的CO₂的培养箱中继续培养过夜；第二天观察是否有荧光表达。

3)Q-PCR方法检测干扰载体的干扰效果

Trizol法提取转染成功的293T细胞中的总RNA，反转录得到cDNA，然后用得到的cDNA进行q-PCR检测，分别加入0.5μl上游引物，0.5μl下游引物和1.2μl cDNA于50μl PCR反应体系中，反应体系见表3。反应条件为95℃，2分钟；95℃，10秒钟，60℃，30秒钟，72℃，45秒钟以上三步进行40个循环；72℃，10分钟；然后60℃开始，每升高0.5℃，保持温度30秒钟，70个循环后升至95℃。

表3 PCR体系中各组分的体积

用Q-PCR法检测细胞样品中目的基因(INHA)和内参基因(β-actin)的表达量，根据Q-PCR的反应曲线获得各样品目的基因INHA和内参β-actin的Ct值(threshold cycle number循环阈值)，采用ΔΔCt的方法进行INHA基因表达的相对定量。比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达，并计算干扰效果。计算方法：

ΔΔct＝(待测样品的目的基因的ct的平均-待测样本的看家基因的ct的平均)-(对照样品的目的基因的ct的平均-对照样本的看家基因的ct的平均)

基因的表达量F＝2^-ΔΔct，目标基因的沉默效率为1-2^-ΔΔct

4)Western Blot方法检测干扰载体的干扰效果

将干扰载体和INHA高表达载体共转染的细胞培养72小时后，收集细胞裂解，收集上清，对上清进行蛋白定量。各样品上样量为100μg/孔，同时检测内参GAPDH和INHA蛋白的含量，结果见图8。

4.慢病毒干扰载体构建

1)pENTR/U6-shRNA3的构建

根据干扰效果最好的shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA3中的有效siRNA干扰序列，设计并合成2条shRNA寡核苷酸单链DNA序列见序列表SequnenceNO.15、Sequnence NO.16。将2条合成好的寡核苷酸单链DNA用ddH₂O溶解成100μM，互补单链各取5μl两两混合，进行退火。然后将2份shRNA寡核苷酸混合物在95℃加热5分钟，然后放于室温下自然冷却25分钟，形成shRNA双链DNA分子。将退火的双链DNA继续稀释成10nM浓度，取4μl双链DNA与2μl pENTR^TM/U6在室温连接30分钟。然后用载体构建试剂盒BLOCK-iT U6RNAi Entry Vector Kit(invitrogen，Catalog nos.K4944-00)进行重组克隆，将双链的shRNA oligo插入到shRNA表达载体pENTR^TM/U6 vector中，构建shRNA表达质粒，并转化至感受态细胞DH5。每个转化平板分别挑取4个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡核苷酸单链DNA序列一致。

2)慢病毒干扰载体的构建

a使用Invitrogen公司的LR重组系统将pENTR/U6-shRNA3与慢病毒载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行重组。按下表(表4)配制LR重组反应体系：

表4 LR重组反应体系

b在25℃的条件下反应1小时。

c加入1μl蛋白酶K，37℃消化10分钟。

d用5μl重组反应液转化100μl Stbl3感受态细胞。

筛选阳性克隆并进行测序验证，保留那些测序验证正确的LR重组质粒。

5.慢病毒制备

1)选取生长状态优良，处于对数生长期的293T细胞，先进行细胞计数，然后按照每10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；

2)第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；

3)取9μg Packaging Mix(Invitrogen)和3μg慢病毒表达质粒加入到1.5mlOpti-MEM培养液(经37℃预热)中，轻轻混匀；

4)将36μl lipofectamine2000徐徐加入到1.5ml Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，室温下放置5min；

5)轻轻混合第3步中质粒溶液和第4步中lipofectamine 2000稀释液，室温放置20min；

6)将第5步中得到的3ml质粒脂质体混合物徐徐加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，在37℃，5％CO2培养箱内孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM+10％FBS，继续培养；

7)48h后收集细胞培养上清液，3000rpm离心15min，除去细胞碎片后，用0.45μm的滤器过滤；

8)将病毒原液浓缩后沉淀重悬至1ml，分装成200μl/管，放置于-80℃保存备用，并留少量慢病毒测定物理滴度和活性滴度。

6.病毒滴度的测定

根据慢病毒载体及慢病毒颗粒上共有的一段cDNA序列设计引物和探针，运用Q-PCR的方法测定包装而成的病毒液的滴度值。

1)第一天，将293T细胞用胰酶消化计数后，接种于24孔板中，在37℃下过夜培养，进行细胞转染之前要保证生长细胞达到30～50％的融合密度；

2)第二天，在进行转染时，先将冻存于-80℃冰箱中的慢病毒液放在冰上慢慢融解，然后用含有2％FBS的细胞培养液进行10倍等梯度浓度稀释，从10-1稀释到10-6(一般每个细胞浓度梯度可以进行2～3个重复)。

3)去掉24孔板中的细胞培养液，轻轻地上下颠倒每管慢病毒稀释液，各取1ml加入每孔细胞中，加入聚酰胺使其终浓度达8μg/ml，然后轻摇使之混合均匀，37摄氏度培养过夜；

4)第三天，去除含慢病毒的培养液，加入2ml完全培养基；继续进行培养2天。

5)第四或五天，在荧光显微镜下观察各孔中GFP的表达量，按下列公式进行计算。

二.结果

1.shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA的构建

针对INHA构建的4种shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA经测序验证后，结果表明所构建干扰载体中的靶序列与设计的有效干扰序列完全匹配，shRNA干扰载体构建成功。

2.INHA高效表达载体pIRES2-eGFP-INHA的构建

构建的INHA高效表达载体pIRES2-eGFP-INHA经测序验证证明其中的靶序列与已报道的抑制素编码序列(Gene ID：L28815)完全匹配。表明pIRES2-eGFP-INHA构建成功。Q-PCR法检测INHA的表达情况，结果表明，转染高表达质粒pIRES2-EGFP-INHA的细胞中，目的基因INHA的表达量与细胞本底相比升高10¹⁰倍(表5)。

表5 高效表达载体pIRES2-eGFP-INHA Q-PCR检测结果

3.shRNA干扰载体与INHA高表达载体共转染293T细胞检测结果

1)shRNA干扰载体与INHA高表达载体共转染293T细胞荧光检测结果

将4种shRNA干扰载体和阴性对照载体分别与INHA高效表达载体共转染293T细胞24小时后，在荧光显微镜下观察，转入两种载体的293T细胞都能够表达GFP，显示较强的绿色荧光信号，转染效率达70％以上。其中shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA3与INHA高效表达载体pIRES2-EGFP-INHA共转染293T细胞的荧光结果见图1。shRNA干扰载体阴性对照pGFP-V-RS-NC与INHA高效表达载体pIRES2-EGFP-INHA共转染293T细胞的荧光结果见图2。

2)Q-PCR方法检测干扰载体对于靶基因的沉默效果

a.内参(β-actin)定量检测结果见表6。

表6 内参(β-actin)定量检测结果

b.内参扩增曲线见图3和熔解曲线图4。

c.目的基因定量结果见表7。

表7 以NC为对照对目的基因相对定量的结果

d.目的基因扩增曲线见图5和熔解曲线见图6。各干扰载体的干扰效率见图7。

通过Q-PCR法检测INHA的表达，熔解曲线分析未见杂峰，说明扩增产物单一特异，没有非特异性扩增，通过扩增曲线读取相应Ct值，经公式计算发现编号为shRNA3的序列对IHNA的表达有显著的抑制作用达到81.66％。

3)Western Blot方法检测干扰载体对于靶基因的沉默效果

通过Western Blot检测发现，shRNA1、shRNA3、shRNA4的干扰效果较佳，结果见图8。

4.根据干扰效果最佳的shRNA干扰载体构建慢病毒载体

1)shRNA干扰载体pENTR/U6-shRNA3的构建

根据干扰效果最佳的shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA3的有效靶序列，设计合成两条shRNA单链寡核苷酸片段，在适当条件下将其连接到shRNA表达载体pENTR/U6中，得到shRNA干扰载体pENTR/U6-shRNA3。对构建的pENTR/U6-shRNA3进行测序验证，测序结果见图9，结果表明插入片段序列与设计的寡核苷酸单链DNA序列一致，shRNA干扰载体构建成功。

2)慢病毒干扰载体的构建

将pENTR/U6-shRNA3与慢病毒载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行重组得到慢病毒干扰载体pLenti6-shRNA3，对得到的慢病毒干扰载体进行测序验证，测序结果见图10，结果证明慢病毒干扰载体pLenti6-shRNA3中的有效干扰序列设计的shRNA寡核苷酸序列匹配，慢病毒干扰载体构建成功。

5.慢病毒液物理滴度测定结果

取10μl的慢病毒原液用无菌水稀释至100μl，作为LV-1，取10μl Lv-1，用无菌水稀释至100μl，设为Lv-2，取10μl Lv-2，用无菌水稀释至100μl，设为Lv-3。将标准品和各稀释度的慢病毒样品，通过实时荧光定量PCR检测，并计算各稀释液中的病毒颗粒数。结果显示Lenti6-shRNA3的活性滴度为：2.05E+8TU/ml。(注：1TU通常约为100-1000VP)

实施例2性腺注射法制备转基因绵羊

一 材料与方法

1.材料：

1)实验动物

实验用小尾寒羊购自山东郓城小尾寒羊保种基地，其中试验用母羊(12-18月龄)46只，公羊(12-20月龄)10只。开始本试验之前，已经对公羊和母羊的繁殖力相关基因FecB基因进行了鉴定，获得的鉴定结果表明：46只母羊中有29只为FecB杂合型，11只不含FecB基因，其它羊的FecB基因型未测得；10只公羊中有4只为FecB隐性纯合型，6只为FecB杂合型。

2)主要试剂

3)主要器材

手术器械(手术刀、手术针、手术线，创巾、医用纱布、止血钳、持针钳、手术剪、眼科剪、大镊子、小镊子，2ml、5ml、10ml注射器等)购自中国农业大学实验供应科；羊人工授精器械(采精管、集精杯、固定架、绳等)、手术台、高压灭菌锅(北京维欣仪奥科技发展有限公司)、普通光学显微镜(日本Olympus公司)、智能恒温水浴锅(HW.SY2-P6)、酒精温度计、4℃普通冰箱(山东青岛海尔公司)等由青岛奥特种羊场提供；10ml真空离心管、一次性PE手套、乳胶手套、一次性手术服等耗材购自北京冬歌生物科技有限公司；加样枪(德国Eppendorf公司)、LD24-08型台式低速离心机、TGL-16G型台式高速离心机等为本实验室固定资产。

2实验方法

1)对母羊进行同期发情处理

母羊进行同期发情处理之前，先进行空载处理，方法是对所有母羊注射2ml氯前列烯醇，使已怀孕的母羊流产，成为空载母羊。

a.放置阴道栓

①将密封放置的海绵栓取出，放入无菌生理盐水中浸泡，同时在生理盐水中加入氨苄西林钠，使其浓度为5000单位/ml。

②将上述准备好的海绵栓，放38℃水浴中放置一段时间，以防止冷水对羊的刺激作用。

③用新洁尔灭消毒液或高锰酸钾消毒液对母羊外阴进行消毒，尤其要洗净母羊外阴部的秽物，以防止其随海绵栓进入母羊阴道，对其造成感染。

④温浴后的海绵栓取出后，用止血钳夹持，放入母羊的阴道中，在放置的过程中应注意力度，不可用力过猛，对母羊造成伤害；正确的方法是不断调整止血钳用力的方向，以便顺势将海绵栓放入。

⑤放栓时，一旦对母羊造成伤害，应在海绵栓放置完成后，对母羊注射4×80万单位氨苄西林钠/天，连续注射4～5天。

b.撤栓

①母羊放置海绵栓10天后，将其取出，在取出海绵栓后1-5天母羊处于发情期。

②两人将母羊固定好，另一人拽住海绵栓露在母羊阴道外面的绳子末端，用力将海绵栓从母羊阴道中取出，在取海绵栓的时候不宜用力过猛，以使其海绵部分留在母羊体内。

③一旦海绵栓的绳子在母羊阴道内被扯断，海绵栓无法用手取出，应在开膣器的辅助下用止血钳将残留在母羊阴道内的海绵栓取出。

④海绵栓取出后，如发现绵羊阴道部有炎症反应，应立即对母羊注射4×80万单位氨苄西林钠/天，连续注射4～5天。

⑤取出海绵栓的同时，对每只母羊注射促性素(PMSG)1000单位。

⑥母羊撤栓后每天上午对其进行试情，记录母羊发情情况，以便在适当时机进行配种。一般母羊撤栓后第3～5天发情比较集中。

2)母羊卵泡注射

①在母羊撤栓前4～5天对部分母羊进行卵泡注射手术。

②术前空腹：母羊在进行手术的前一天晚上不进食，以避免在手术时，由于食物蓄积对腹部造成过大的张力。

③INHA shRNA病毒液的稀释：将-80℃保存的INHA shRNA慢病毒液(200μl)取出，置于冰浴中使其完全融化。取一个经高压灭菌的10ml无菌离心管，将INHA shRNA病毒液用加样枪小心地沿着离心管的管壁缓缓加入到离心管中，然后将离心管放于37℃水浴中。在离心管中加入适当的PBS或Opti-mem(37℃)，将INHA shRNA慢病毒液稀释成不同的浓度。保留用于卵泡注射的部分，其余部分分装后4℃保存，尽量在三天内用完。

④母羊卵泡注射手术前的准备：将手术器械(手术刀、手术针、手术线，创巾、医用纱布、止血钳、持针钳、手术剪、眼科剪、大镊子、小镊子等)用手提式高压灭菌锅在103.4kPa的压力下高压蒸汽灭菌15～20分钟。

⑤母羊的麻醉处理：对每只将要进行卵泡注射手术的母羊肌肉注射5ml速眠新，待母羊站立不稳继而卧地不起后(此时母羊已经进入麻醉状态)，将其固定在手术架上。

⑥打开母羊的腹腔(开口约3cm左右)，将食指和中指伸入，把母羊的卵巢取出，此处操作需要有一定的经验，一般是先摸到母羊子宫角，然后顺藤摸瓜将卵巢取出。

⑦对母羊卵泡注射0.3ml左右的慢病毒液(稀释液2或3)，一般是两侧卵巢各要注射约0.15ml。

⑧注射完病毒液后，将母羊卵巢送回腹腔，并对腹腔开口进行缝合。在缝合之前向手术开口处撒2×80万单位氨苄西林钠粉末，缝合时应按腹膜、肌肉、皮肤的顺序依次缝合，其中腹膜和肌肉要连续缝合，而皮肤需结节缝合。

⑨缝合完毕后，为手术母羊依次注射2×80万单位氨苄西林钠注射液和3ml苏醒灵注射液。术后母羊应避免立即采食大量青草，及时补充水分，最好补充精料或鸡蛋。

⑩术后每天对母羊注射4×80万单位氨苄西林钠，连续注射4～5天。

3)公羊性腺注射

在母羊撤出海绵栓1天后，对公羊注射INHA shRNA慢病毒干扰载体包装成的病毒液。

①INHA shRNA病毒液的稀释：将-80℃保存的INHA shRNA慢病毒液(200μl)取出，置于冰浴中使其完全融化。

②取一个经高压灭菌的10ml无菌离心管，将INHA shRNA病毒液用加样枪小心地沿着离心管的管壁缓缓加入到离心管中，然后将离心管放于37℃水浴中。

③在离心管中加入适当的PBS或Opti-mem(37℃)，将INHA shRNA慢病毒液稀释成不同的浓度。保留用于性腺注射的部分，其余部分分装后4℃保存，尽量在三天内用完。

④公羊的选择，选择性欲比较旺盛的公羊，进行预采精实验，选择能顺利采出精液且精液品质良好的公羊进行性腺注射处理。对那些无法完成爬跨或精液品质太差的公羊进行训练，以使其能够用于采精配种。

⑤将公羊固定好以后，对其睾丸进行温水清洗和新洁尔灭消毒，再用碘酊棉球进行擦拭。

⑥用5ml注射器吸取病毒稀释液(37℃)，然后将其注射到公羊睾丸的曲细精管部位和附睾尾中，注射时最好多点注射，使慢病毒液均匀分布于睾丸的生精组织中，还要注意注射的深度，不能过深也不能过浅，实验中对公羊分为2组，每组5只，分别注射稀释液1和2。

⑦注射完毕后，再次对公羊的睾丸用碘酊擦拭，出血严重的部位进行按压止血。

4)性腺注射公羊与发情母羊进行人工授精

①根据对同期发情处理的母羊的试情结果，选择合适的时机进行人工授精，通常情况下，母羊撤栓后第3～5天发情比较集中，故选母羊撤栓后第3天、第4天、第5天的早晨和傍晚连续进行3次人工授精。

②采精工具的准备：查看羊用采精筒的内胎是否完好，如不完好，及时更换；用毛刷将采精管在自来水下刷洗干净后，用新洁尔灭消毒，然后用无菌生理盐水冲洗3～5次，将其清洗干净；集精杯用毛刷同样在自来水下刷洗干净后用新洁尔灭消毒，最后用无菌生理盐水冲洗干净，并用无菌生理盐水浸泡。

③输精工具的准备：将开膣器、输精管等放入新配制的新洁尔灭溶液中浸泡消毒，10min后将输精管取出，用无菌生理盐水冲洗4～5次，然后将其放入一瓶新开封的无菌生理盐水中，并放置到40℃的恒温水浴锅中温浴。

④精液稀释液的准备：取5ml左右的VB12液，放到一个经高压灭菌的10ml真空离心管中。再将其放至40℃的恒温水浴锅中温浴。

⑤采精用母畜的准备：牵一头试出其已经发情的母羊，将其固定到采精室的固定架上，以便引诱公羊爬跨射精。

⑥用经过性腺注射的公羊采精：采精前将集精杯安装在采精筒的下部，然后将40℃左右的温水部分充满采精筒的内胎，再用洗耳球样充气筒在采精筒内胎中充入空气，当达到一定压力后，停止充气。对公羊外阴部位进行擦洗，并用新洁尔灭溶液进行消毒。然后将公羊与发情母羊放置在一起，当公羊对母羊进行爬跨时快速将采精筒对准公羊的阴茎，公羊阴茎插入采精筒中，并迅速射精，如公羊无法完成射精，将其从母羊身上拉下来，重新让其爬跨，最终可采到足够量的精液。

⑦精液品质检查：把采到的公羊精液，迅速放入40℃水浴中保存，然后用移液器枪头吸取少许，放到载玻片上，在显微镜下观察精子的活动情况以评价精液的质量。如果精液的质量合格，则可以用来为母羊输精，这时将温浴的精液稀释液(VB12)以1∶1的比例加入的刚采出的新鲜精液中，用输精管抽吸，使之混合均匀，然后将稀释后的精液吸入输精管中用于输精。如果精液品质不符合要求，换一只公羊继续采精，直到精液合格为止。

⑧输精：将同期处理后已发情母羊固定在固定架上，用开膣器将母羊阴道撑开，然后在手电筒的帮助下找到母羊的子宫颈口部位，将输精管从阴道里面的子宫颈口伸入，推动输精管注射活塞，将稀释的精液输入母羊的子宫颈部位。

⑨预产期的计算，按照小尾寒羊妊娠期152天推算，作出小尾寒羊预产期预测表。

⑩转基因绵羊的生产及护理，对实验产生的转基因羊进行特殊护理，出生后立即饲喂初乳，将母羊与小羊单独圈养，经常看视，遇有问题，及时妥善处理。

5)出生小羊的采样检测

对出生后4～5月龄的小羊采血样进行检测，每只羊采5～10ml血样，每个血样中加入RNAlater，以防止RNA的降解。将采到的血样放-80℃保存，以备检测。

①Q-PCR法检测血样中目的基因的表达

分别加入0.5μl上游引物Sequnence NO.17、0.5μl下游引物Sequnence NO.18和1.2μl cDNA于20μl PCR反应体系(表8)中，用Q-PCR法检测血液样品中目的基因和内参基因(β-actin)的表达量，反应条件为反应条件为95℃，2分钟；95℃，10秒钟，60℃，30秒钟，72℃，45秒钟以上三步进行40个循环；72℃，10分钟；然后60℃开始，每升高0.5℃，保持温度30秒钟，70个循环后升至95℃。根据Q-PCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值(thresholdcycle number.域值循环数)，采用ΔΔCt的方法进行相对定量。

表8 PCR体系中各组分的体积

②对出生的小羊血样进行Western Blot检测

样品中蛋白的定量：

A.血样在4℃12000rpm离心10min，吸取上清。

B.完全溶解蛋白标准品，取20μl至180μl PBS中，使终浓度为0.5mg/ml。

C.将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板，加PBS补足到20μl。

D.加2μl样品到96孔板，加PBS补足到20μl。

E.各孔加200μlG250染色液，室温放置3min。

酶标仪测定A595，根据标准曲线计算样品中蛋白浓度。

Western Blot检测样品中的目的蛋白：

A.含20-90μg蛋白的溶液体积即为上样量。本实验上样量：90μg/孔。

B.取出上样样品至200μl的EP管中，加入4×LDS上样缓冲液至终浓度为1×。然后将样品于75℃中10min使蛋白变性。

C.加入足够的1×NuPAGE MES电泳液后，进行上样。

D.电泳：100V，90min，至溴酚兰刚跑出即终止电泳。

E.iBlot Dry Blotting System

F.封闭：将膜置于含5％脱脂奶粉/胎牛血清的TBST溶液中，室温孵育1h

G.一抗：抗Inhibin抗体，1∶200，孵育2小时或者4℃过夜。

H.二抗：BMP12：羊抗兔IgG-HRP 1∶5000稀释于含3％脱脂奶粉/胎牛血清的TBST溶液中，室温孵育1小时

I.X光片曝光时间0.5min。

J.0.5N的NaOH洗膜15min

K.GAPDH的检测：方法同6～8步。X光片曝光时间：5min。

二 实验结果

1.实验羊的出生情况

处理组6只母羊与3只公羊共产生7只后代，存活4只；非处理组7只母羊与处理组4只公羊共产生9只后代，存活5只。存活的9只绵羊后代皆为4～5月龄的仔羊，对其采血样进行Q-PCR和Western Blot检测。

2 Q-PCR检测结果

1)对内参(β-actin)的定量结果表9

表9 各样品中内参(β-actin)定量检测结果

样本编号	第一次ct值	第二次ct值	第三次ct值	Ct平均值
					0043-20	21.26077	21.30488	21.25649	21.27
0113-2	21.47084	21.24035	21.3259	21.3457
					0051-18	21.96099	21.78825	21.88763	21.87895
空白(blank1)	22.25876	22.35433	22.49357	22.36889
					空白(blank2)	22.20246	22.36528	22.39955	22.32243
空白(blank3)	22.36525	22.42382	22.38876	22.39261
					0058-16	20.94776	21.24872	21.08365	21.09337
0059-6	20.91902	20.93914	20.78307	20.88041
					0065-1	19.5948	19.6269	19.58095	19.60088
0070-1	21.18635	21.30467	21.20037	21.23047
					0070-4	20.31374	20.26283	20.16357	20.24671
0102-12	21.22581	20.97994	20.96013	21.05529

2)各样品中目的基因INHA的定量结果见表10

表10 各样品中目的基因INHA的定量检测结果

对目的基因INHA相对表达量的柱状分析图见图11。由以上结果可以看出：以β-actin为内参，各样本中INHA的相对表达量(2^-ΔΔCT)显著低于空白对照组(blank)中INHA的相对表达量(P(t0.01)＜0.0001)。

3 血液样品的Western Blot结果

血液样品的Western Blot结果见图12，由图可知，3、5、6、8号样品中的抑制素表达显著下降，为转基因阳性。

实施列3转基因绵羊的繁育实验

将实施例2得到的编号为0058-16和0113-2鉴定为阳性的雌性F1代进行繁育实验。实验分为两组，其中实验组为2只阳性的雌性F1代绵羊与非转基因的雄性绵羊交配，对照组为2只非转基因雌性绵羊与非转基因的雄性绵羊交配。比较两组年产仔数。初步实验结果显示实验组产仔数比对照组产仔数提高了50％。本发明的载体转基因动物实验证明，INHA慢病毒干扰载体可以明显提高动物的繁殖力。

Claims (5)

1.一种提高动物繁育力的新型干扰载体pLenti6-shRNA3，其特征在于，所述shRNA慢病毒干扰载体包含基因序列Sequnence NO.15和Sequnence NO.16。

2.一种shRNA表达载体pENTR/U6-shRNA3，其特征在于，所述pENTR/U6-shRNA3载体包含基因序列Sequnence NO.15和Sequnence NO.16。

3.根据权利要求1所述的提高动物繁育力的新型干扰载体，其特征在于，所述载体可以制备包含基因序列Sequnence NO.15和Sequnence NO.16的慢病毒。

4.根据权利要求1所述的提高动物繁育力的新型干扰载体，其特征在于，所述载体可以用于INHA低表达的转基因小尾寒羊的制备。

5.根据权利要求1所述的提高动物繁育力的新型干扰载体，其特征在于，所述载体可以应用于培养高繁殖力绵羊新品种。

Images