CN104519828A - 使用性别选择的精细胞提高猪的品系或品种的遗传进展的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在人工授精技术中通过使用性别选择的精细胞提高猪的品系、品种或种群的遗传进展的方法。本发明还涵盖通过深子宫内导管或腹腔镜手术对猪人工授精的方法,这使得性别选择的精细胞的使用量降低。
Description
本申请要求2013年3月15日提交的美国申请号13/840,598和2012年6月6日提交的美国申请号61/656,446的权益。
发明领域
本发明涉及在人工授精技术中通过使用性别选择的精细胞提高猪的品系、品种或种群的遗传进展的方法。本发明还涵盖通过深子宫内导管或腹腔镜手术(laparoscopicprocedure)对猪人工授精的方法,这使得性别选择的精细胞的使用剂量降低。
背景
在养猪业中有必要提高品系和品种中的需要的遗传变化的速率以及降低育种和商业化养猪场中的经营成本。本文中公开的本发明通过以下方式来实现这些目标:允许育种或商业农场的经营者使用性别选择的精细胞样品选择后代猪的性别和/或允许使用少得多的遗传优良的公猪,后者是通过借助于深子宫内导管或腹腔镜使用减少的用于人工授精操作的精细胞剂量实现的。
发明概述
本发明的一个实施方案包括一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法,所述方法包括从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品;将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中,其中第一亚群的至少80%具有X染色体或Y染色体;用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精;由所述母猪生产一个或多个后代;对一个或多个所述后代计算选择指数;和选择一个或多个具有与所述品系或品种的平均选择指数相比更高的选择指数的所述后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种的遗传进展。
本发明的另一个实施方案包括一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法,所述方法包括从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品;将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中,其中第一亚群的至少80%具有X染色体或Y染色体;用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精;由所述母猪生产一个或多个后代;在一个或多个所述后代中获得性状的数值;和选择一个或多个所述后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种的遗传进展,所述后代具有的所述性状的数值比所述品系或品种中的所述性状的平均值更大或更小。
在本发明的一些实施方案中,要与本发明一起使用的精液样品被分选到至少两个精细胞亚群中,其中至少60%、60-65%、65%、65-70%、70%、70-75%、75%、75-80%、80%、80-85%、85%、85-90%、90%、90-95%、95%、95-99%或约99%的第一亚群具有X染色体和/或Y染色体。
另一种用于提高猪的品系或品种的遗传进展的方法包括使用从所述品系或品种的公猪获得的性别选择的精细胞样品制备一个或多个胚胎或受精卵(在体内或体外),并且随后通过本领域已知的任何方法将所述一个或多个胚胎或受精卵转移到母猪中妊娠。在本发明的某些方面中,卵供体是来自某种品系或品种的母猪。在本发明的一些具体实施方案中,使用深子宫内导管或腹腔镜将所述胚胎或受精卵转移到母猪中或转移出母猪。这种方法还可以进一步包括以下步骤:计算由所述胚胎或受精卵产生的一个或多个后代的选择指数;根据与所述品系或品种的平均选择指数相比具有更高的选择指数的所述一个或多个后代选择一个或多个所述后代;使用与所述品系或品种的平均选择指数相比具有更高的选择指数的所述一个或多个后代与来自相同品系或品种的猪育种以便提高那种品系或品种的选择强度。本发明的另一个实施方案包括使用这些胚胎或受精卵重组(repopulate)品系、品种和/或种群。
本发明的另一个方面包括根据在所述胚胎或受精卵中存在或不存在遗传标记选择用于本发明的胚胎或受精卵。在某些实施方案中,这种遗传标记可以通过从所述胚胎或受精卵中移除一个或多个卵裂球并且检测所述一个或多个卵裂球存在或不存在所述遗传标记来筛选。所述遗传标记可以是,例如,本文中公开的任何猪性状的标记或与本文中公开的任何猪性状有关的标记。在某些实施方案中,在4-16细胞期、4-10细胞期或4-8细胞期从所述胚胎或受精卵移除一个或多个卵裂球。可以使用本领域已知的任何技术从胚胎或受精卵移除卵裂球,包括但不限于在美国专利号7,893,315中公开的那些,所述专利的公开内容在此以引用方式全部并入本文。简单地说,其中描述的一种方法包括固定胚胎并且轻敲所述固定的胚胎直到卵裂球被分离(所述胚胎可以使用微量吸管固定并且轻敲所述微量吸管的支架以分离所述卵裂球)。在某些实施方案中,筛选所述胚胎或受精卵的遗传标记包括将从所述胚胎或受精卵获得的卵裂球或细胞基因分型。筛选胚胎或受精卵的遗传标记的技术在美国专利号8,338,098中公开,所述专利的公开内容在此以引用方式全部并入本文。简单地说,可以使用汇集DNA测序手段确定单核苷酸多态性(SNP),并且随后可以通过基于PCR-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)的方法实现确定的SNP的基因分型。
与本发明一起使用的分选的精细胞构成“性别选择的”精细胞样品。性别选择的精细胞样品可以通过本领域已知的任何技术获得。在本发明的一个实施方案中,所述性别选择的精细胞样品可以使用流式细胞仪制备。在本发明的任何实施方案中使用的性别选择的精细胞可以使用任何已知的方法低温保存并且随后在使用之前解冻,或者此外可以使用新鲜的(即,从未冷冻)性别选择的精细胞。
术语“品系”和“品种”表示具有共同来源和相似的识别特性的一组动物。本发明还适用于猪的“纯品系”和“纯品种”,正如本领域中使用的那些术语。
术语“选择指数”是指根据育种者选择的某些性状的猪的表达对于个别猪品种产生的数值评分。通常育种者将会对每个猪的品系或品种指定给定数目的性状(常称为选择对象),并且可以进一步区别地衡量每个性状在产生选择指数中的重要性。对于猪来说更高的选择指数表示猪表达或携带那些性状的程度更高。
在本发明的某些实施方案中,可以使用任何想要的基因型或表现型性状为猪的品系或品种构建选择指数。可以在选择指数中使用的表现型性状包括但不限于饲料转化率、平均日增重、胴体瘦肉、胴体品质、生育力、每窝产仔数和产奶量。
在本发明的一些实施方案中,可以使用仅仅从那个特定的猪获得的数据(即,个体数据)来计算特定的猪的选择指数,或者此外,可以使用来源于包括那个特定的猪或是那个特定的猪的代表的数据(即,群体数据)来计算特定的猪的选择指数。例如,可以在个体的公猪中测量饲料转化率—因此,在这个实例中的公猪的选择指数将会基于个体数据。此外,可以测量与所讨论的公猪一起饲养的公猪群体的饲料转化率—在这个实例中的公猪的选择指数基于群体数据。
本发明的其它方面涵盖使用深子宫内导管或插入所述母猪的膜的针头用性别选择的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精。这些实施方案中的一些涵盖可用于将精细胞放入母猪的生殖道中的已知的手术和非手术技术,包括剖腹手术(涉及穿过腹壁的大切口以进入腹腔的手术操作)。这种实施方案涵盖使用1x109或更少个总精细胞对母猪授精。
在其它实施方案中,可以使用深子宫内导管将精细胞样品施用到母猪的生殖道的远端部分中,如一个或多个子宫角或一个或多个子宫-输卵管接合处。在本发明的另一个方面中,所述深子宫内导管由外管或外鞘和内柔性探针组成。在本发明的又一个方面中,所述柔性的内探针包括液体或细胞可以通过的柔性内管道。在本发明的某些实施方案中,所述外管和内柔性探针可以由塑料制成,在其它实施方案中,它们可以由被构造成诸如盘管或弹簧构造等的柔性金属制成。在又一个实施方案中,所述深子宫内导管包括用于观察母猪的生殖道内的深子宫内导管远端部分的位置的摄像机或显示器。在替代实施方案中,可以使用放射显影或荧光透视法观察所述所述母猪的生殖道内的深子宫内导管。在本发明的另一个实施方案中,可以使用深子宫内导管从诸如来自一个或多个子宫角或来自一个或多个子宫-输卵管接合处的母猪的生殖道远端部分插入或取出胚胎或受精卵等。
相对于用深子宫内导管授精,涵盖对母猪施用1x109个精细胞或更少的剂量。这些精细胞可以是性别选择的精细胞。在本发明的一个实施方案中,通过深子宫内导管将一定剂量的性别选择的精细胞(例如600x106个,但是可以更多,或在发情期最佳时机放入最佳位置就低至10x106个)施用到母猪的一个或两个子宫角(例如,每个子宫角中300x106个精细胞)中。在其它实施方案中,剂量可以在约300x106、约150x106、约140x106、约100x106、约70x106、约50x106或约5x106个性别选择的精细胞或更少的范围内变化或在这个范围之间的任何剂量,并且可以施用到母猪的一个或两个子宫角中。
上述剂量可以在多种体积中施用,包括但不限于每150x106个精细胞5ml,或相同数目的细胞在以下范围的体积中施用:5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml或100ml,或5-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、80-90ml或90-100ml之间的某个体积。
在本发明的任何实施方案中使用的性别选择的精细胞可以低温保存并且随后解冻,或此外可以使用新鲜(即,从未冷冻)性别选择的精细胞。上述剂量也可以施用到母猪的一个或多个子宫-输卵管接合处中。
本发明的这种实施方案也涵盖使用腹腔镜观察用于施用性别选择的精细胞样品的插入母猪的膜的针头。用于注射精细胞样品的针头和腹腔镜(以及诸如镊子等操纵仪器)都可以通过腹腔镜手术典型的小切口插入母猪的腹部。本发明还涵盖在雌性生殖道内的一个或多个位置中注射精细胞样品。仅通过举例的方式,可以将精细胞样品注射到母猪子宫内的一个或多个位置中,包括一个或多个子宫角、输卵管、壶腹、峡部或子宫-输卵管接合处。在本发明的另一个实施方案中,可以借助于腹腔镜从母猪的生殖道插入或取出胚胎或受精卵。
相对于借助于腹腔镜授精,涵盖对母猪施用1x109个精细胞或更少的剂量。这些精细胞可以是性别选择的精细胞。在本发明的一个实施方案中,可以通过腹腔镜将约500x106个性别选择的精细胞或更少的剂量注射到一个或两个输卵管中(例如,每个输卵管中250x106个精细胞);在其它实施方案中,可以将在约10x106、约5x106、约3x106、约2.0x106、约1.2x106、约1x106或0.6x106个性别选择的精细胞或更少范围内的剂量或在这个范围之间的任何剂量注射到母猪的一个或两个输卵管中。
在又一个实施方案中,可以将性别选择的精细胞注射到输卵管的特定区域中,包括但不限于峡部、壶腹和/或子宫-输卵管接合处。在某些实施方案中,可以将在约5x106、约2x106、约1x106、约600x103、约500x103、约300x103或约150x103个性别选择的精细胞或更少范围内的剂量或在这个范围之间的任何剂量注射到输卵管的一个或多个区域,无论是单侧或双侧。
在又一个实施方案中,就借助于腹腔镜授精而论,可以使用在每个壶腹中注射约500x103个性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注射约1x106个性别选择的精细胞范围内的剂量;或每个壶腹注射约1x106个性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注射约2x106个性别选择的精细胞的剂量;或每个壶腹注射约5x105个性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注射约2x106个性别选择的精细胞的剂量;或每个壶腹注射约5x105个性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注射约1x106个性别选择的精细胞的剂量或在这些范围之间的任何剂量在输卵管中的多个部位多次注射。上述剂量可以包含在多种体积中,举例来说,每1x1012个精细胞100μl,或相同数目的精细胞在以下体积之一中或在以下任何体积之间的体积中:50μl、100μl、200μl、300μl、400μl或500μl。
本发明的另一个方面包括通过对母猪施用一种或多种激素或激素类似物使要使用本文中公开的实施方案授精的母猪发情期同步和/或诱导定时排卵。在一个实施方案中,所述一种或多种激素或激素类似物包括PG600(包含怀孕母马血清促性腺激素、“PMSG”和人绒毛膜促性腺激素、“hCG”;Intervet)、OvuGel(借助于阴道内输送系统的醋酸曲普瑞林缓释配方;Gel Med Sciences,Inc.)、马绒毛膜促性腺激素、“eCG”、hCG或孕激素。
在本发明的又一个实施方案中,所述一种或多种激素或激素类似物是通过放入所述母猪的生殖道的可编程装置施用的。本文中涵盖的可编程装置能够以定时释放的方式释放所述一种或多种激素或激素类似物,所述方式不需要育种者必须监测所述装置或提供除了编制释放所述一种或多种激素或激素类似物的初始参数的程序之外的任何输入。在本发明的另一个实施方案中,可以通过施用1250至1500IU的eCG以及随后施用750IU的hCG 72至80小时后诱导母猪的同步发情/定时排卵。在另一个实施方案中,可以通过施用400至2000IU的PMSG以及随后施用500至1000IU的hCG72至83小时后诱导母猪发情。
其它实施方案进一步涵盖通过研究所述母猪的卵泡检测母猪的排卵。在本发明的一个特定实施方案中,使用超声研究所述母猪的卵泡。在又一个实施方案中,是在hCG注射之后25-35小时开始通过每3-5小时经直肠超声来研究所述母猪的卵巢是否存在预排卵卵泡的。在本发明的又一个实施方案中,选择超声2-3小时之后显示有多个预排卵卵泡的母猪进行授精。
本发明此外涵盖一种提高猪种群或养猪场中的遗传优良的公猪后代数目的方法,它包括从种群或养殖场中的公猪群体建立一个或多个遗传优良的公猪的亚群;从所述一个或多个遗传优良的公猪中获得精细胞样品;从每个所述精细胞样品中制备多个精细胞剂量;对所述种群或所述养殖场中的多个母猪施用一种或多种激素或激素类似物以便确定每只母猪的已知排卵时间;和使用深子宫内导管或腹腔镜手术用一个或多个精细胞剂量对所述母猪授精,其中对每个母猪一起施用的一个或多个精细胞剂量包含总共小于1x109个的精细胞。这些步骤还可以用于减少猪种群或养猪场中育种所需的公猪数目。在某些实施方案中,遗传优良的公猪包括相对于所述种群或所述养殖场内的其它公猪具有更高的选择指数的公猪。
本发明还涵盖一种提高猪种群或养殖场的利益率的新方法,它包括根据所述种群或养殖场从属的市场条件计算雄猪和雌猪的单猪净收入;确定是雄猪还是雌猪产生更高的单猪净收入;从公猪中采集精液样品;将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中,其中(i)如果雌猪产生更高的单猪净收入那么第一亚群中的至少80%具有X染色体,或(ii)如果雄猪产生更高的单猪净收入那么第一亚群中的至少80%具有Y染色体;用来自所述第一亚群的精细胞对母猪授精;和由所述母猪生产后代。
本文中使用的术语“母猪”涵盖小母猪(还没有产仔的幼年雌猪)以及任何生殖成熟的雌猪。
本发明的任何实施方案都可以使用是遗传核心或繁殖种群成员的母猪。类似地,本发明的任何实施方案都可以使用是遗传核心或繁殖种群成员的公猪。
附图简述
图1示意性地说明可以用于将精细胞样品分选到具有X或Y染色体的一个或多个亚群中的流式细胞仪。
发明详述
本发明的实施方案针对通过使用性别选择的精液样品授精提高猪种群或品系中的想要的遗传变化或进展的速率的方法。使用性别选择的精细胞产生具有全部是雄性或全部是雌性的高概率的后代,这取决于使用的单独的亚群。如下面所示,这种能力为猪育种业提供显著的优势,因为该产业非常重视每年的遗传进展。使用性别选择的精细胞的额外的好处是降低与维持两种性别的基础设施和物资有关的经营成本—例如,对雄猪和雌猪分开饲养的需求消失或大大降低,对雄性和雌性维持两种不同饲料提供链的需求也是这样(雄性通常饲喂蛋白更高的饲料)。只销售公猪或小母猪的养殖场基本上可以使用性别选择的精细胞授精使其生产力加倍。此外,他们可以使其成年种群库存降低50%并且因此降低需要的流动资本投资。如果所述性状在一个性别中相比其它性别中表达或表达更强,实现在猪中使用性别选择的精细胞还允许育种者提高或降低给定猪同窝仔畜(litter)或种群中的性状。例如,为了降低肉的“公猪气味(boartaint)”在商业农场中往往将雄性阉割—因此,只产生雌性的能力会消除对阉割的需求并且完全消除“公猪气味”的问题。
然而,产生性别选择的精细胞样品的过程是既费时又费钱的,通常需要使用专业化流式细胞术设备、训练有素的技术人员和复杂的过程。遗憾的是,使用诸如子宫颈内授精等传统的人工授精技术成功授精需要的公猪精细胞的一般剂量是1x109个精细胞至3x109个精细胞,而一般的公猪精液包含大约6x1010个精细胞。因此,一般的公猪精液包含大约20至60个人工授精剂量,大大限制性别选择的精细胞样品在育种猪中的商业应用。此外,每个发情周期对雌猪最少授精两次。因此,如果可以降低成功授精需要的精细胞的总量,给定的公猪就可以在一定的时间内产生更高数目的人工授精剂量,使性别选择的精细胞样品的使用在商业观点上更合乎需要。为了优化性别选择的精细胞样品在猪中的商业应用,本发明还涵盖降低有效的人工授精剂量需要的样品中的精细胞总数的方法,它包括借助于深子宫内导管和腹腔镜授精。成功授精需要的精细胞数量降低产生了减少育种需要的公猪数目以及其相关成本的额外好处。
A.提高遗传变化速率
通过使用本发明来选择某种品系中的后代的性别,可以提高种群或品系的想要的遗传变化的速率。在这里,遗传变化或遗传进展表示对于给定的性状,连续世代中的个体会使所述想要的性状比上代表达更强。就不想要的性状而论,遗传进展表示连续世代中的个体会使所述性状比上代表达更弱。
从一代到下一代的遗传进展(ΔG)可以根据选择的亲代的平均遗传水平与选择的候选者(可用于选择的动物)的平均遗传水平之间的差异来衡量。在理想条件下,这取决于所述性状的遗传率(h2)和选择的亲代的平均表现(P)和选择的候选者的平均表现(A)之间的差异。选择的亲代的平均表现(P)和所有选择的候选者的平均表现(A)之间的差异(其中选择的亲代是子集)也称为选择差(SD)。
ΔG=h2(P-A)
选择差前面的符号表明选择的方向-正值表示较大表现型数值的选择,而负的选择差表示较小表现型数值的选择。因此,如果目标是选择较大的表现型数值,就将所述品系、品种和/或种群内的相对于其它个体具有大的正选择差的个体视为优良个体并且可以在那个基础上被选为亲代。类似地,如果目标是选择较小表现型数值,就将所述品系、品种和/或种群内的相对于其它个体具有大的负选择差的个体视为优良个体并且可以在那个基础上被选为亲代。
在消除非遗传影响时(例如通过比较每个表现记录与同群的平均值)以及在除了所述动物本身的信息之外还使用来自亲属的信息时,选择是更有效的。这是通过计算估计的育种值(EBV)实现的。在选择基于EBV时,预期的遗传进展等于选择的动物的平均EBV和选择的候选者的平均EBV之间的差异。
ΔG=PEBV-AEBV
那么遗传进展的年率就是:ΔG/t=(PEBV-AEBV)/t,其中t是代间隔。换句话说,遗传进展的年率取决于代间隔以及亲代EBV相对于选择候选者的优越性。在本发明的某些实施方案中,可以使用诸如最优线性无偏预测(BLUP)等统计模型来确定EBV,不过本领域已知的任何统计模型都可以与本发明一起使用。
通常,在对猪育种时,选择一种以上的性状。然而,在有多种性状要选择时,选择必须根据其经济价值、它们对选择的响应如何(遗传率)和它们怎样影响彼此(遗传相关)来权衡每个性状。实现这种平衡的一种方式是建立选择指数,这取决于以上数值和每个动物的每个性状的EBV。对于选择指数的遗传进展的预测与个体EBV的相同,即,所述指数中的改变的年率是代间隔和选择的亲代的指数和选择的候选者的指数之间的差异的函数。
在大的群体中,选择差取决于检测多少动物以及选择多少动物-选择的比例越低,选择差越高。因此,为了使遗传进展最大化,人们应该根据选择指数为所有测试动物分级并且随后选择维持所述品系、品种和/或种群规模需要的顶端公猪和母猪的最小数量。这保证选择的动物的平均指数基本上高于检测的所有动物的平均指数。
如上所示,遗传进展取决于识别作为下一代的亲代的优良个体。有两种方法用于衡量选择的个体的表现型优越性:选择差(如上讨论的)和选择强度。这两种尺度对于性状来说密切相关,数值分布正如预期的的那样是正态分布。选择差等于选择强度和表型标准偏差的乘积。因为选择强度与标准偏差的单位相同,所以比较不同性状的选择压力而不考虑用于衡量表现的单位类型是可能的。
此外,人们可以把选择作为亲代的候选者的比例转化成选择强度,因为在群体的比例和正态分布中的平均值之间的标准偏差的数目之间有直接的关系。因此,选择的群体的比例越小,选择强度越大并且遗传进展越大,其它一切相等。
此外,为了实现更高的遗传进展速率,人们也想保持代间隔较小—代间隔是其子代出生时种群中的亲代的平均年龄并且可以通过加快所述品系、品种和/或种群中的公猪和母猪的替换来降低。为了使猪的代间隔保持较低,应该在公猪达到一岁大之前淘汰,母猪在一次或两次产仔之后淘汰。最后,为了提高遗传进展,选择的一个或多个性状应该具有高水平的遗传率。性状的遗传率是与环境相比,由于遗传差异,在群体内的个体之间的性状的看得见的差异的比例。
养猪业中的重要性状的实例是饲料转化率,即,衡量动物将饲料质量转化成身体质量增加的效率的尺度(也称为饲料转化率或饲料增重比),和平均日增重,即,动物每天的平均增重。性状是用不同单位衡量的(例如,猪的数量、每日的磅数、英寸等),性状在所有全球市场中的经济重要性不相等,并且遗传影响的程度不相同(即,不同遗传率)。一般来讲,诸如饲料转化率和平均日增重等产量性状具有高遗传率。相比之下,诸如生育力和每窝产仔数等繁殖性状一般来讲具有低遗传率。
在本发明的某些实施方案中,能够将公猪精细胞分离成具有X和具有Y的亚群的效率是可以在品系、品种或种群中选择的性状。提高这种性状的表现允许以较高速率分选具有X和具有Y的亚群和/或与所述品系、品种和/或种群中的个体平均值相比具有更高的纯度水平,其它一切相等。可以测定公猪精液样品的某些性状来评价能够分选其精液的效率,包括未处理精液中的死亡精子数量,以及精细胞摄取DNA选择性染料(如Hoechst 33342)的好坏,从而建立在用流式细胞仪分选时使用的染色方法的饱和。举例来说,精液样品中的死亡精细胞的数量或百分比可以使用优先结合损坏或死细胞的有色或荧光染料来评价。优良的染料饱和与在流式细胞仪上观察到的具有X和具有Y染色体的优良的分离和/或由流式细胞仪为具有X和具有Y染色体的亚群产生的直方图的优良的“峰谷”比有关。
猪产量可以由多水平金字塔表示,在下一个更低的水平中使用处于每个水平的某些后代进行育种。金字塔的顶部水平就是核心种群。自上而下的下一个水平分别是子代核心种群,繁殖种群,最后是商业养殖场。
核心种群通常由12至15个品系组成,不过可以提供任何数目的品系,每个品系都包括若干需要的性状。
每个品系也可以根据育种者为那个品系选择的性状选定其自己的选择指数,针对每个品系内的后代进行评价—具有更高选择指数评分的后代是更想要的。如上所述,特定的猪的选择指数可以使用个体数据或群体数据来计算。选择指数的目的是为各种性状的每一个选定适当的重点以提供在比较不同动物中使用的单个值。只有具有最高的测定的选择指数的后代才可保留在核心种群中。每个品系内的母猪是公猪品系母猪,即,用于繁殖雄性,或小母猪品系母猪,即,用于繁殖雌性。公猪品系母猪的雌性后代被舍弃。同样地,小母猪品系母猪的雄性后代也被舍弃。
因此,使用本发明的性别选择的精细胞授精,与使用传统的、未分选的精液相比,公猪品系母猪的后代是雄性的可能性更高,而小母猪品系母猪的后代是雌性的可能性更高,从而显著地提高相应的品系的选择强度,因为有正确性别的更大后代群体要测定并且随后从其中选择亲代。例如,可以使用本文中公开的技术分离取自公猪品系公猪的精细胞样品,从而建立其中至少80%的精细胞具有Y染色体的亚群(在小母猪品系上使用本发明时,可以使用其中至少80%的精细胞具有X染色体的亚群)。随后可以使用那个亚群或那个亚群的一部分对公猪品系母猪授精。因为来自那个母猪的后代至少有80%的可能性是雄性,所以所述公猪品系的选择强度将被提高,因为将会有更多可供选择的雄性。
在子代核心水平或“品系繁殖”水平,用来源于所述核心种群的公猪精液对来自某一品系的母猪授精。在繁殖场种群水平,得到的母猪通常与不同品系的公猪杂交。繁殖场种群通常是小母猪繁殖场或公猪繁殖场。小母猪繁殖场产生亲代小母猪而公猪繁殖场产生亲代公猪。亲代小母猪被送到商业化养殖场以替换年长或死亡的小母猪和母猪,而亲代公猪被送到公猪场以产生在人工授精中使用的精细胞。
B.改变跨窝或种群性状的表现
如上所述,在猪育种中使用性别选择的精液允许人们提高(或降低)给定同窝或种群中的某些性状的表现,如果那些性状在一种性别中比另一种性别中表达或表达更强烈。
例如,小母猪具有比阉公猪更高的饲料转化率(在性成熟之前已经被阉割的雄猪)。因为饲料费占猪生产成本的相当大的比例,同窝仔全部或基本上全部由雌性组成可以为育种者或养殖场提高利益率,这取决于当地市场条件。此外,与阉公猪(年幼的阉割雄性)相比,小母猪(年幼的雌性)通常具有更低的体重、更低的平均日增重、更低的平均每日采食量并且瘦肉更多(更小的背脂厚度、更大的腰肌厚度、更高的无脂瘦肉指数)。因此,虽然小母猪可能长得比阉公猪慢,但是它们将是更瘦并且更有效率的,因此在正确的市场条件下对于养殖场来说可能是更有利可图的。
因此,在市场条件下,在猪中使用性别选择的精液可以通过选择具有最想要的性状的性别允许人们提高养殖场的利益率。
实施例1-性别选择的公猪精细胞样品的制备
用于制备性别选择的公猪精细胞样品的以下过程只是通过非限制性实施例的方式提供的。制备性别选择的公猪精细胞样品的第一步是从合适的公猪获得精液。一旦采集到精液,就可以将它在可能包含抗氧化剂的合适的稀释剂中稀释。随后可以稀释所述精液的富含精液组分。如果所述样品需要在性别选择之前运输,那么在从采集点运输到性别分选处理的流式细胞仪的同时可以将所述样品保持在0-39℃(通常16-17℃)的温度下约12小时至约18小时。
一旦所述精细胞样品在实验室中,就可以对所述精细胞样品进行各种质量检查,包括检查运动力(motility)(例如,借助于CASA系统)、生存力(例如,借助于流式细胞仪)、形态(例如,借助于显微镜)和浓度(例如,借助于NucleoCounter)。将通过这些质量检查的精细胞样品准备用于分选。
在使所述样品通过流式细胞仪之前,用DNA选择性染料将样品染色,暴露于淬灭染料以形成染色的精细胞样品,随后将其放入流式细胞仪的精细胞源。具体地讲,在一些实施方案中,所述精细胞样品首先可以用诸如BTS等缓冲液或稀释剂(参见表1)稀释至最终浓度,在一些情况下可以是100x106个细胞/ml,随后添加DNA选择性染料Hoechst 33342(可以是在MiliQ水中5mg/ml;Ref:B-2261),良好的工作浓度可以是约5μl/1亿个细胞/ml,但是DNA染料可以在在0.5至20ul/1亿个细胞/ml范围内的更低和更高浓度使用。随后通常将所述样品放入30和42℃(通常接近35℃)之间的覆盖的浴水中10分钟到12小时,特别好的染色为约50分钟,随后在分选之前将其放在室温(21-22℃)的黑暗区域。在分选样品之前,将样品过滤以除去大碎片和细胞(例如用0.30μm的CellTricks)并且在过滤之后可以添加红色食用染料(添加时,通常是在MiliQ水中的0.5-5μl或1μl的25mg/ml储备溶液),或可以向所述样品中添加另一种淬灭染料。随后可以流式细胞仪分选所述样品,所述流式细胞仪使用在一些情况下可以包含表2中列出的成分的鞘液,但是也可以使用其它鞘液。
图1以示意图的形式说明用于分选精细胞样品以形成一个或多个亚群的流式细胞仪的一部分,所述流式细胞仪通常引用为10。在这种特定的实施方案中,进行性别分选以便所述亚群是具有X染色体的精细胞和具有Y染色体的精细胞。图1提供用于分选精液的单一技术,但是本领域已知的分选细胞的任何已知技术都可以与本发明的某些实施方案一起使用。
图1的流式细胞仪10可以由操作者编程以产生两个带电液滴流,一个包含具有X染色体的精细胞,带正电,12,一个包含具有Y染色体的精细胞,带负电,13,而不带电的未偏转死细胞流14直接进入废液。
操作者还可以选择用这样的方式对所述流式细胞仪编程,即使用“高纯度分选”同时收集具有X和Y染色体的精液(换句话说只收集活的具有X和Y染色体的精液),或对所述流式细胞仪编程以使用“富集分选”同时收集具有X和Y染色体的精液(换句话说,这将采集包含活的先前未分选的并且通过使用控制所述流式细胞仪的计算机可用的布尔逻辑门再次排除所有最初死亡的液滴)。所述布尔逻辑门也可以用于只收集具有X或Y染色体的精液中的任一种。
开始,以精细胞流能够被在鞘液源16的压力下提供给喷嘴15的鞘液共轴环绕的方式将在压力下的精细胞流从精细胞源11注到管口15中。可以存在的振荡器17能够借助于振荡器控制机构18被非常精确地控制,在喷嘴15内产生压力波并且在精细胞流离开喷嘴口19时将压力波传输到共轴环绕的精细胞流。结果,流出的共轴环绕的精细胞流20能够最终并且有规则地形成液滴21。
相应的液滴流带电是通过细胞传感系统22实现的,细胞传感系统22包括照射喷嘴排出流20的激光23,并且通过传感器24检测荧光流的光发射。传感器24接收的信息被传送到分选机识别系统25,分选机识别系统25非常迅速地决定是否为形成的液滴充电并且如果充电为形成的滴剂提供什么电,于是随后为液滴21充电。
具有X染色体的精液的特性是它们比具有Y染色体的精液吸收更多的荧光染料,因为它们存在更多的DNA,因此,具有X染色体的精液中的激光激发的吸收的染料发射的光的量与具有Y染色体的精液的不同,而这种差异向分选机识别系统25传达适用于理论上只包含一个具有X或Y染色体的精细胞的单个液滴的电荷类型。死细胞(或将要死亡的细胞)通常吸收向分选机识别系统25传达不对包含这些细胞的液滴施加电荷的淬灭染料。
所述带电或不带电的液滴流随后在一对静电带电板26之间通过,静电带电板26使它们偏离一种路线或另一种路线或根本不偏离,这取决于其电荷,进入相应的收集容器28和29,分别形成具有X染色体的性别富集的群体和具有与其DNA有关的DNA选择性染料的性别富集的具有Y染色体的精液细胞。包含死细胞(或将要死亡的细胞)的不带电非偏离亚群流进入废液容器30。
性别选择的精细胞样品是在具有2.5ml捕获液体(catch fluid)的50ml管子中收集的,对于每2千万细胞来说,所述捕获液体在某些实施方案中可以是具有2%蛋黄的TesTris葡萄糖(TTG)(参见表3)。在这个实施方案中,所述性别选择的精细胞样品通常具有大约24ml的最终体积,每ml约1x106个细胞。随后将这个管子在室温下在暗室中储存约2小时。
表1-BTS稀释剂
化合物 | SYGMA编码 | g/升 |
葡萄糖 | G6152 | 36,941 |
柠檬酸钠 | S4641 | 5,999 |
碳酸氢钠 | S5761 | 1,261 |
EDTA | ED2SS | 1,250 |
氯化钾 | P3911 | 0,7456 |
硫酸卡那霉素 | K4000 | 0,05 |
表2-鞘液(PBS)
化合物 | SYGMA编码 | g/升 |
氯化钠 | S9888 | 8 |
氯化钾 | P3911 | 0.2 |
磷酸二氢钠一水合物 | S9638 | 0.12 |
磷酸氢二钠七水合物 | S9390 | 1.717 |
EDTA酸 | E6758 | 1 |
青霉素G钾盐 | PENK | 0.058 |
硫酸链霉素 | S6501 | 0.05 |
表3-TesTris葡萄糖(TTG)
化合物 | SYGMA编码 | g/100ml |
TES | T1375 | 5 |
TRIS | T1503 | 0.68 |
葡萄糖 | G6152 | 0.6 |
KANAMICYN | K4000 | 0.005 |
一旦获得性别选择的精细胞样品,就可以将它与传统的人工授精操作一起使用,如内子宫颈授精、体外授精或用深子宫内导管或腹腔镜人工授精。此外,可以将性别选择的精细胞样品低温保存以便储存并且随后解冻以便后面使用。
实施例2-性别选择的公猪精细胞样品的低温保存
一旦制备好性别选择的公猪精细胞样品,就可以任选低温保存所述精细胞样品以便运输或储存用于后面使用。以下冷冻方法可以用于本发明,但是仅是通过举例的方式提供的,本领域已知的任何低温保存方法都可以使用。
分选之后,可以将包含性别选择的精细胞(具有2千万细胞)的50ml管子分成15ml的管子,每个管子中大约12ml性别选择的精细胞样品精液,每个包含大约1千万性别选择的精细胞。可以在21℃下将这些管子以3076g离心4分钟。轻轻倒出上清液,可以用大约50μl的一些上清液保持所述细胞团。
随后可以在室温下向每个细胞团中添加第一冷冻介质,它可以包含20%卵黄和80%β-乳糖的溶液。随后可以检查精细胞的运动力。如果可以接受,可以将管子拿到可编程的温度控制机器(PolyScience-MiniTube)中或可以人工处理从而使温度从约21℃降至约5℃维持约2小时。在定时的温度变化之后,可以将样品放在约5℃的低温室中,并且在其中向样品中添加第二冷冻介质,第二冷冻介质可以包含卵黄、β-乳糖、甘油和Equex Stem,或可以仅仅包含诸如甘油等冷冻保护剂,或者预先冷却到5℃的具有渗透稳定剂的冷冻保护剂。10分钟之后,可以将性别选择的精细胞样品放在人工授精吸管中,并且随后将所述吸管暴露于液氮蒸气(距离液氮大约4cm)较短时间(例如10分钟),随后直接放到液氮中长期保存。
当性别选择的精液样品准备好使用时,就可以通过解冻/加热吸管(例如放在约37℃的水浴装置中约15秒中)将吸管解冻。解冻后,就可以在30、90和/或150分钟分析精细胞的运动力和生存力用于标准比较。
实施例3-发情同步化。
本发明涵盖为了方便起见在要授精的一个或多个母猪中同步发情和/或诱导定时排卵。此外,因为性别选择的精液往往是预先催熟的(pre-capacitated),所以在排卵的大约6小时内对母猪授精是重要的。同步发情或定时排卵有助于保证就是这样。一般来讲,这需要对要授精的母猪施用一种或多种激素或激素类似物。有几种方式来诱导小母猪的发情/定时排卵,如下所述。
为了确立同期化发情以及定时排卵,可以对母猪施用一种或多种激素或激素类似物。这些激素和激素类似物通常包括,例如,PG600、OvuGel、eCG、hCG和/或孕激素,并且可以用定时注射或在放入母猪生殖道的可编程装置的辅助下人工施用。本文中涵盖的可编程装置以定时释放的方式释放一种或多种激素或激素类似物,所述方式不需要育种者必须监测所述装置或提供除了编制释放所述一种或多种激素或激素类似物的初始参数的程序之外的任何输入。本领域已知的用于诱导和/或同步发情的任何以下方法一般来讲都可以与本发明一起使用,包括以下那些。
(a)运输和公猪诱导的发情。小母猪通常在大约180-210日龄达到初情期。然而,自然达到初情期受许多内部和外部因素的影响,如基因型、环境和公猪接触。许多育种者和牧场主指出通常在小母猪六个月龄时观察到第一次发情。发情的出现往往与动物从小母猪繁殖场到商业农场的转移或运输同时发生。毋庸置疑,在猪群中公认的紧张因素是运输。如果在运输时小母猪的年龄接近初情期的正常出现时间,那么大约25-35%的小母猪将会在运输之后一周内出现发情。这种运输诱导的发情可以用来同步一定比例的小母猪。
虽然运输可以诱导发情,很明显公猪接触是刺激初情期的一种有效的形式。控制公猪接触作为初情期刺激效率的主要因素是引进公猪时小母猪的年龄。当在小母猪4月龄开始公猪接触时,初情期反应极小。有人提出当小母猪太年幼而不能做出反应时,幼年小母猪可能在发育中的某个阶段对公猪刺激变得习以为常。相反地,当把公猪引进推迟到接近初情期前的时间时(6月龄和以上),所述反应由于不同的原因再次被限制。凭借引进时小母猪相对大的年龄(即6个月),这些小母猪的实际初情期年龄并不比未刺激动物的降低多少。当在小母猪年龄大约为160天引进公猪时,从第一次公猪接触到初情期和小母猪年龄处于初情期的时间间隔都最小,而发生初情期的同步最大。
(b)口服和定时释放孕激素。这种发情同步化的手段通过施用口服施用的黄体酮或合成孕激素来抑制卵巢的活动。可以获得的一些孕激素是定时释放的注射形式,如烯丙孕素(参见下文)。以15-30mg烯丙孕素/猪/天的速率单独或成群饲喂周期的小母猪连续14到18天,在持续饲喂孕激素之后在2和8天之间出现同步发情。
(c)促性腺激素。eCG/hCG(PG600R)目前,用于诱导非周期的雌性动物卵泡生长和排卵的最常见的外源性激素组合是eCG(原名怀孕母马血清促性腺激素(PMSG))和人绒毛膜促性腺激素(hCG)的组合。产品PG600R包含400IU PMSG和200IU hCG。这种激素可以作为组合药物购买并且对于诱导非周期的猪群发情和排卵是划算的。小母猪通常在治疗之后3-6天出现发情并且排卵时间是大约110-120小时。在开始治疗的时候,如果小母猪每天接触公猪,那么反应速度就会增强。PG600包括怀孕母马血清促性腺激素(或者称为马绒毛膜促性腺激素(“PMSG”或"eCG"))和人绒毛膜促性腺激素(“hCG”)(Intervet)。OvuGel是在缓释配方中的另一种市售促性腺激素(醋酸曲普瑞林),它可借助于阴道内输送系统施用(Gel Med Sciences,Inc.)。
(d)前列腺素。PGF2α对于诱导黄体溶解、流产和超过怀孕第二周的怀孕(和假孕)小母猪迅速回到发情是有效的。一种同步方法是将小母猪关入围栏(pen-mate)三周并且随后在两周以后用PGF2α处理。
(e)定时释放激素。另一种方法涉及在发情周期中的特定时间点直接注射市售制剂,如烯丙孕素或regumate。例如,在本发明的一个实施方案中,同步和定时排卵是通过在小母猪发情周期的第11-14天施用15-30mg烯丙孕素/天持续4到7天实现的。停止烯丙孕素24小时之后,可以施用400至2000IU的PMSG,随后72至83小时后,施用500至1000IU hCG。
实施例4-排卵检测。
在母猪中进行排卵检测可以通过研究母猪的卵泡完成。认识到在相对于排卵的适当时间在输卵管中建立足够的精子贮囊的重要性,这在猪人工授精的管理中是至关重要的。具体来讲,了解发情期间的母猪可能在什么时侯排卵对于实现成功授精是非常有益的。为此,在本发明的一个特定实施方案中,在诱导发情之后使用超声研究母猪的卵泡。在本发明的一个特定实施方案中,是在hCG注射之后30小时开始通过每4小时经直肠超声来研究所述母猪的卵巢是否存在预排卵卵泡的。选择显示有多个预排卵卵泡(窦直径>6mm)的母猪在超声之后2-3小时进行授精。
实施例5-使用腹腔镜或深子宫内导管授精
一旦准备好性别选择的公猪精液样品,就可以使用所述样品对母猪授精。可以使用本发明中的任何传统的人工授精技术,包括内子宫颈授精。然而,深子宫内导管和腹腔镜是在猪中特别适当的,因为它们允许使用低剂量的精细胞成功授精,部分是因为它们能够将精细胞放在母猪的生殖道的关键部位,包括但不限于子宫角、输卵管、壶腹、峡部和子宫-输卵管接合处。使用低精细胞剂量允许使用用于育种目的的少得多的遗传优良的公猪,这具有降低育种者的成本以及降低不得不供养大量公猪导致的环境危害的好处。
(a)使用深子宫内导管授精。使用深子宫内导管允许人们将精细胞放到母猪的子宫角中,理论上是放在子宫-输卵管接合处。这种深子宫内导管的使用和构造在美国专利号6,695,767中公开,所述专利的公开内容在此以引用方式全部并入本文。这种深子宫内导管可以任选包括摄像机或显示器以允许操作者看到导管的路径,从而可以在一个或两个子宫角放置精细胞之间做出选择。可选地,当与放射照相或荧光镜装置一起使用时可以观察母猪的生殖道内的深子宫内导管的位置。由于其长度,深子宫内导管允许操作者达到母猪的生殖道的远端区域,包括子宫角-这些区域是使用人工授精的标准导管不能达到的。在本发明的一个实施方案中,深子宫内导管的长度是1.8m、1-2m、1-2.5m或1-3m。
可以将深子宫内导管引入发情母猪的子宫颈管(cervical duct),所述发情可以是超排卵的、但是也可以是自然交替或以其他方式诱导的。可以在导管上涂覆无毒的润滑液以促进其通过阴道。所述导管可以包括外管或鞘和在所述外管或鞘内的柔性探针。在本发明的一个实施方案中,一旦导管已经前进到子宫颈管,柔性探针可以在导管的外管内进一步前进。柔性探针可以前进直到到达子宫角的前端部分。当柔性探针在子宫角内前进时,它可以弯曲并且因此继续沿子宫角的弯曲路径。虽然不是绝对必要的,但是通过导管的外管引进小体积的液体可以促进柔性探针在其通过子宫颈管的通道前进以及其通过子宫角的前进。一旦柔性探针已经被引入到其在子宫角内的最终位置,就将包含在注射器中的精细胞样品连接到柔性探针近端末端并且可以(通过柔性探针内的柔性管道)引入到子宫环境中。为了避免损失精细胞以及保证精细胞样品已经完全排出柔性管道,随后可以通过所述柔性管道引入小体积的液体。此后,可以抽出导管,包括外管和柔性探针。在本发明的另一个方面中,这种方法也可以用于将胚胎转移到子宫角中或从子宫角移除胚胎。
(b)使用腹腔镜授精。使用腹腔镜对母猪授精具有以下优势,即在母猪的生殖道内放置精细胞甚至可以比使用导管更加精确,从而进一步实现使用降低剂量的精细胞授精。可以对准子宫的特定部位,如输卵管、峡部、壶腹或子宫-输卵管接合处。作为非限制性实施例,以下操作可以与本发明一起使用来借助于腹腔镜对母猪授精。
例如,可以将包含24ml性别选择的精细胞样品每ml具有约1x106个精细胞的50ml管子分成2个15ml的管子,并且在约21℃的温度范围内以约3076g离心几分钟(2-5或4分钟)。如果需要可以在相同条件下将上清液再次离心。随后将所得的精液团混合并且检查浓度(借助于NucleoCounter)。随后将浓缩的性别选择的精细胞样品用BTS稀释至10x106个细胞/ml的最终浓度并且检查精细胞的运动力和生存力。(在整个过程期间精细胞样品都应该维持在室温下(21℃))。
母猪可以成群或分开,例如可以将它们单独分配到机械换气的封闭设施中的畜栏中。母猪(2-6胎次)在约21天断乳。随后可以在断乳24小时之后用约1250IU马绒毛膜促性腺激素(eCG;Folligon,Intervet International B.V.,Boxmeer,The Netherlands或等价化合物)对每个雌性动物肌内注射来诱导发情;72小时后,将它们用约750IU人绒毛膜促性腺激素(hCG;Veterin Corion,Divasa,Farmavic S.A.,Barcelona,Spain)或等同化合物处理。注射eCG 2天之后,开始每天进行一次发情检查(例如在7:00a.m.)。检查发情的一种方式是允许雌性动物与成熟公猪面对面接触并且施加背压,以识别呈现立位热反射,这被认为是处于发情中;这时就可以扫描卵巢。为了寻找是否存在预排卵的卵泡,可以在注射hCG约30小时之后开始以周期性的时间间隔(例如每4个小时)使用5MHz多扫描角度变频器通过经直肠超声检查研究卵巢。只选择显示有多个预排卵的卵泡(窦直径>6mm)的母猪进行授精。授精在超声检查之后2-3h内进行。
随后这些母猪一旦安静下来,就可以进行腹腔镜授精(可能通过施用阿扎哌隆(azaperone);氮哌酮(Stresnil);2mg/kg体重,i.m.)。也可以用诸如硫喷妥钠(Abbot;7mg/kg体重,i.v.)等化合物诱导全身麻醉并且用氟烷(3.5-5%)或类似化合物维持。对于手术来说,可以将母猪背卧位放置,如果有得用,将其背部放在腹腔镜托架上。如果使用托架,就将其放在高于水平大约20°角度的特伦德伦伯格(Trendelenburg)体位(臀部向上,头部朝下)。
在一个实施方案中,在靠近肚脐处做切口(约1.5cm)。随后可以用反牵引将切口的边缘向上拉并且将具有插入的0°腹腔镜的12mm Optiview套针(EthiconEndo-surgery Cincinnati OH,USA)推进伤口中。在肚脐处,用轻微的切割和中度压力横切皮下脂肪组织、直肌的前筋膜、直肌、直肌的后筋膜、腹横筋膜和腹膜。所述过程借助于监测反馈控制。虽然将CO2管件与套针连接,但是直到腹膜刺穿才开始膨胀。在腹膜腔进入并且气腹开始之后,移除Optiview的机头并且用0°腹腔镜替换。用CO2将腹腔膨胀到14mmHg。在半腹部的左右部分放置两个辅助口,它分别提供腹腔镜Duval镊子用于操纵子宫角以及为授精针头夹紧输卵管。在峡部区域中用Duval镊子夹紧输卵管。随后插入剂量流(在0.1ml中包含30-50万个精子),并且将性别分选的精子注入到输卵管中。随后在另一个输卵管上重复所述操作。在两个输卵管都授精之后,移除套针并且缝合切口创伤。
实施例6-选择指数
环境差异使得难以比较在不同位置、在不同时间或在不同管理下检测的猪。然而,使用基于同群(contemporary group)比较的选择指数消除了这些环境因素的大部分影响。因此,遗传指标的更有效的比较是可能的。本领域已知的任何选择指数都可以用作本发明的组成部分。以下选择指数仅是通过举例的方式提供的。
母猪繁殖力指数(SPI)。这个指数提供母猪繁殖力的尺度并且在挑选母猪时是有用的。多产是通过一窝出生的活猪的修正数量来衡量的。产乳能力是通过21日龄一窝仔畜的修正重量衡量的。
早期断乳母猪繁殖力指数(EWSPI)。这个指数是设计用来在21日窝重不可用时挑选母猪使用的。当所述指数被建立时,在21天的窝重用作相关的性状,即使没有采集重量时,允许一些选择重点放在产乳能力。
母畜指数(MI)。母畜指数是用来强调母畜的特性并且可用于选择公猪以产生替换小母猪以及选择替换小母猪。因为阉公猪和不能接受用于替换的小母猪是这种类型的交配(mating)的剩余猪群,所以一些重点放在生长率、背脂和饲料转化率上。饲料转化率是作为相关的性状包括的,不过它不直接测定的。在某些实施方案中,有人建议不要在10日龄之前对潜在的替换猪断乳,以便可以使用窝重来选择产乳能力。
末端指数(TI)。末端指数强调生长、效率和背脂。末端指数可以用于选择在末端杂交中使用的动物。如果背脂是使用A型超声波测定的,就应该使用TI-A。如果背脂是用B型超声波或金属探针测定的,TI-B就是合适的指数。如果已经计算预测的瘦肉百分比,那么就使用TI-M。
以上指数对于每个检测组平均是100并且应该具有约25的标准偏差。
在本文中公开的以上选择指数的计算中使用的性状定义如下:
L=母畜出生活仔记录的修正数目减去它同群的出生活仔记录的修正数目的平均值;
W=母畜的修正21日窝重记录减去它同群的修正21日窝重记录的平均值;
D=在个体上测定的达到250磅的修正天数减去检测组达到250磅的修正天数的平均值;
B=在个体上测定的背脂(修正为250磅)减去检测组的修正背脂的平均值;和
M=对于个体计算的预测瘦肉百分比减去检测组的预测瘦肉百分比平均值。
应该根据雌猪的胎次向记录增加以下数值将出生活猪数目修正为成熟母猪等效值:
表4-出生活仔数目的胎次修正因子。
胎次 | 出生活仔数目(L) |
1 | 1.2 |
2 | 0.9 |
3 | 0.2 |
4-5 | 0.0 |
6 | 0.2 |
7 | 0.5 |
8 | 0.9 |
9 | 1.1 |
L=母畜出生活仔记录的修正数目减去它同群的出生活仔记录的修正数目的平均值;
个体育种者可以在任何时间断乳,但是应该在断乳之前记录窝重并且尽可能靠近21日龄,以便最精确的评价母猪产乳能力。应该在14和28天之间对猪称重并且修正为21天基础。产仔后窝重可以通过使用以下乘法因子修正为21天基础:
表5-将窝重修正为21天基础的因子。
称重年龄 | 因子 | 称重年龄 | 因子 |
10 | 1.50 | 20 | 1.03 |
11 | 1.46 | 21 | 1.00 |
12 | 1.40 | 22 | 0.97 |
13 | 1.35 | 23 | 0.94 |
14 | 1.30 | 24 | 0.91 |
15 | 1.25 | 25 | 0.88 |
16 | 1.20 | 26 | 0.86 |
17 | 1.15 | 27 | 0.84 |
18 | 1.11 | 28 | 0.82 |
19 | 1.07 |
以下公式用于计算表值并且可以用于直接将窝重修正为21天基础:
修正的21天窝重=重量*[2.218-0.0811(年龄)+0.0011(年龄2)]。
猪断乳应该不早于10日龄;使用表5中的因子将允许母猪在母猪繁殖力指数上分级。猪断乳年龄越靠近21天,修正就越精确。
如果可能,同窝猪仔应该在出生后24小时内(但是不迟于48小时)标准化为每窝在8和12只猪之间。选择转移的猪应该大小平均。如果可能,应该转移雄性而不是雌性。产仔后重量记录的标准化会避免对由于小于最佳每窝产仔数具有较少机会的优良产乳母猪或小母猪的区别。应该通过增加来自下表的合适数值将窝重(已经修正为21天基础)标准化为10只猪:
表6-对于转移后猪的数目修正21天窝重的因子(允许喂养的数目)。
根据雌猪的胎次,产仔后窝重还应该通过向记录增加以下数值修正为成熟母猪等效值:
表7-21天窝重的胎次修正因子。
从大数据集获得的表4-7中的修正因子是通用的。只要有可能,特定的修正因子应该来源于特定群体的数据集,特定地用于那些群体。必须通过两种操作之一测定所有正常公畜和/或所有小母猪的生长率。
W=母畜的修正21日窝重记录减去它同群的修正21日窝重记录的平均值;
(a)恒重年龄。如果在检测时没有对猪称重,而只获取最终重量,那么重量应该在250磅或接近250磅或一些其它类似的恒重称量。将天数修正为恒重的公式是:
修正天数=实际年龄+[(期望重量–实际重量)*((实际年龄-a)/实际重量)]
(其中a=对于公猪和阉公猪是50,对于小母猪是40)。
(b)检测增重。试验开始时应该在与运营的管理计划一致的平均猪重量对猪称重。推荐的平均猪重量是大约70磅。在个体猪当中的始重范围应该最小。试验结束时猪重量平均应该大于始重至少160磅。如果被检测的猪进行隔离的早期断乳,检测可以在40磅的平均始重开始并且试验结束时猪重量应该平均大于始重至少190磅。
D=在个体上测定的达到250磅的修正天数减去检测组达到250磅的修正天数的平均值;
(c)背脂。所有猪都应该在试验结束在250磅称重时在第十跟肋骨位置测量背脂厚度。如果使用金属探针或A型超声波机器,那么应该获得两种测量结果的平均值,在猪两侧距中线2英寸处测量。如果使用B型(实时)超声波机器,单次测量就足够了。背脂厚度应该在腰的中点测量,并且应该包括皮肤和所有脂肪层。如果获取了其它背脂测量结果,应该给出解释。所有测量结果都应该使用以下公式修正为恒量基础:
修正的背脂=实际背脂+[(期望重量–实际重量)*(实际背脂/(实际重量–b))]
(其中b=对于公猪是-20,对于阉公猪是+30,对于小母猪是+5)。
B=在个体上测定的背脂(修正为250磅)减去检测组的修正背脂的平均值;
(d)腰肌面积。腰肌面积(LMA)应该在试验结束称重时在猪上测量,在期望重量边界点(例如,250磅)的30磅范围内。腰肌面积应该在距中线2英寸的位置在第十根肋骨上测量。将LMA修正为恒重基础的公式是:
修正的LMA=实际LMA+[(期望重量–实际重量)*(实际LMA/(实际重量+155))]。
(e)预测的瘦肉百分比。这种性状可以在选择指数中代替背脂使用。如果试验结束在250磅对猪称重就使用以下公式计算预测的瘦肉百分比(PPL):
修正的PPL=[80.95–(16.44*修正的背脂+(4.693*修正的LMA)]*0.54。
M=对于个体计算的预测瘦肉百分比减去检测组的预测瘦肉百分比平均值。
给出以上修正因子,随后就可以如下计算上述选择指数:
SPI=100+6.5(L)+W
EWSPI=100+10(L)
MI=100+6(L)+0.4(W)-1.6(D)-81(B)
TI-A=100-1.7(D)-168(B)
TI-B=100-1.4(D)-106(B)
TI-M=100-1.4(D)+12(M)
A.选择指数-使用预期的子代差异
动物的实际遗传指标是其育种值,它是其所有基因的总影响。每个猪的个体表现型怎样表现育种值取决于喂养它的环境条件。育种值的概念涉及通过基因成对发生的事实的选择。选择的动物将其基因二分之一的样品(每对中的一个)或其育种值的二分之一传给后代。因此,个体的子代和原始群体之间的预期差异是那个个体的育种值的二分之一。许多遗传程序正如子代差异(EPD)那样表达遗传指标估计量,即所述动物EBV的二分之一。因此,EPD=1/2EBV。
EPD可以基于动物表现的直接测量,和/或相对于所讨论的动物的亲属(祖先、同胞、子代)的表现的测量。为了计算EPD,可以在BLUP统计程序中合并全部可用信息。EPD是预期个体的子代相对于种体或群体平均值(不考虑其它亲代)如何表现的预测。由特定的雄性与特定的雌性交配产生的子代的EPD是两个亲代的EPD的总和。
EPD和EBV是估计量。在估计中可以使用的信息来源越多,这些估计量就越精确。EPD的可靠性与每个EPD的准确度有关。准确度定义为个体EBV和其“真正”育种值之间的相关性。准确度数值接近1.0表明EPD的可靠性就更高。在大多数遗传评价程序中报告的准确度数值是那个特定的性状的可能变化或改变的函数。生产者可能希望限制具有低准确度的动物的使用,然而具有许多子代并且因此具有更高准确度的公猪可能被更广泛地使用。准确度数值作为风险管理工具是最有效的,因为不考虑准确度,EPD是目前遗传值的更好的估计量。
在选择诸如出生活猪数目或21天窝重等性状时的希望是正的EPD,因为大的正数转化为每窝更多的猪或每窝更大的磅数。然而,在选择背脂或达到出售体重天数时,希望是负的EPD,因为人们希望降低达到出售体重需要的时间和背脂的量。
如果报告EPD,那么就可以用类似于以上列出的那些选择指数评价动物。最简单的指数由加起来的全部EPD组成。例如,如果生产者对每窝产仔数、生长和背脂感兴趣,那么指数将是:
使用每个性状的经济价值可以衡量遗传信息每个性状的相对经济重要性。例如,使用L为$13.50、D为$0.12、B为$15.00的经济价值(经济价值以每1单位所述性状的变化的美元数给出),将得到以下选择指数:
B.计算选择指数的实例
以下是计算选择指数的实例,它们仅是通过举例的方式提供的。
计算母畜指数。要计算指数的小母猪生于第一胎次,这一窝有11仔,它以每窝10仔饲养,在23日龄时重178lb。它在160日龄重240lb,其在那个重量的B型超声波背脂示数是0.9英寸。为了计算这个小母猪的指数数值,必须将其记录修正为标准条件。这个小母猪生于第一胎次,因此其出生活仔数目的母畜记录必须增加1.2只猪(表4):11+1.2=12.2猪。因为在23日龄对同窝仔称重,所以重量应该乘以0.94(表5)。还应该增加6.2lb对于胎次修正窝重(表7)。因为同窝仔具有10只或更多猪,所以没有必要对每窝产仔数修正。最终的修正窝重是(178*0.94)+6.2=173.5lb。
使用以上提供的公式计算所述小母猪达到250lb的天数记录。期望重量是250lb,实际重量是240lb,实际年龄是160天,性别校正因子是40天,得到达到250lb的修正天数为165日。使用以上公式以类似方式计算修正的背脂。这个小母猪的修正的背脂是0.94英寸。
还必须对于同群牲畜中的全部小母猪计算所述性状的修正值,平均后得到L、W、D和B。如果这个小母猪的同群牲畜的平均修正值是L=9.4只猪,W=158lb,D=163天,B=1.04英寸,那么它的母畜指数是:
I=100+6*(12.2-9.4)+0.4(173.5-158)-1.6(165-163)-81(0.94-1.04)=128指数点
计算末端指数。假设人们希望确定需要150天达到250lb的公猪的指数,在同群牲畜中平均是165天。其修正的背脂(B型)是0.6英寸,群体平均值是0.75英寸。它出生并且饲养在9只同窝仔的第二胎次中,在22天时重200lb。每窝产仔数和重量的同群牲畜修正值分别是9.1和185。为了计算末端指数,人们使用已经在B型背脂扫描的选择指数中确定的修正值,如上面所提供的:
I=100-1.4(150-165)-106(0.6-0.75)=137指数点
注意人们可以忽略同窝仔信息,因为这个公猪只用于生殖供销售的猪。如果人们对使用它生殖替换小母猪感兴趣,就需要使用母畜指数。
可以从上文中容易地理解,本发明的基本概念可以用各种方式体现。本发明涉及使用性别选择的精细胞提高品系、品种或种群的遗传进展的众多以及不同的实施方案,包括但不限于本发明的最佳方式。
因此,不希望通过描述公开的或伴随本申请的图或表中展示的本发明的特定实施方案或要素是限制性的,而是一般由本发明或相对于其任何特定要素涵盖的等价物涵盖的众多和不同实施方案的示例。此外,本发明的单个实施方案或要素的具体描述可能没有明确地描述所有可能的实施方案或要素;许多替代方案是通过描述和附图含蓄地公开的。
应理解设备的每个要素或方法的每个步骤都可以通过设备术语或方法术语描述。希望时可以替换这些术语以明确本发明授权的不明确的广阔范围。仅通过举例来说,应理解一种方法的所有步骤都可以作为一个行动、采取那个行动的方式或引起那个行动的要素来公开。类似地,一个设备的每个要素都可以作为物理要素或那个物理要素促进的行动来公开。仅通过举例来说,“分选机”的公开应该理解为涵盖“分选”行动的公开--无论是否明确地讨论--并且,相反地,有效地公开了“分选”的行动,这种公开应该理解为涵盖“分选机”的公开,甚至是“分选方式”的公开。每个要素或步骤的这些替代术语应该理解为明确地包括在所述描述中。
此外,至于使用的每个术语,应理解除非它在本申请中的使用与这种解释不一致,否则应该理解常见的词典定义包括在Random House Webster’s UnabridgedDictionary(第二版)中包含的每个术语的描述中,每个定义在此以引用方式并入。
此外,为了本发明的目的,术语“一种”或“一个”实体是指一种(个)或多种(个)实体。因此,术语“一种”或“一个”、“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可以互换使用。
假定本文中的所有数值都由术语“约”修饰,不管是否明确指出。为了本发明的目的,范围可以表达为从“约”一特定数值到“约”另一个特定数值。当表示这样一个范围时,另一个实施方案包括从所述一个特定值到另一个特定特定值。通过边界点列举的数值范围包括包含在那个范围内的所有数值。一至五的数值范围包括例如数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等等。应进一步理解,所述范围的每个边界点相对于另一个边界点都是有区别的,并且独立于另一个端点。当数值通过使用先行词“约”表示为近似值时,应理解所述特定值形成另一个实施方案。
这个专利申请的背景部分提供本发明从属的致力领域的声明。这个部分也可以并入或包括在关于本发明所靠拢的技术状态的相关信息、问题或关注中有用的某些美国专利、专利申请、公布或主张的发明的标的物的解释。不希望本文中引用或并入的任何美国专利、专利申请、公布、声明或其它信息被解释为、理解为或视为相对于本发明是现有技术公认的。
在本说明书中提出的权利要求(如果有),在此以引用方式作为本发明的这个描述的部分并入,并且申请人明确地保留使用这些权利要求的全部或一部分这些并入的内容作为支持任何或所有权利要求或其任何要素或组件的附加描述的权利,并且申请人进一步明确地保留从所述描述将这些权利要求或其任何要素或组件的并入内容的任何部分或全部根据需要移到所述权利要求中或相反的权利,以定义本申请或其任何后续申请或连续、分案或部分连续申请所寻求保护的标的,或者为了获得专利法、规则或任何国家或条约的益处、费用降低或符合它们,这些以引用方式并入的内容应该在本申请的整个待定期间都有效,包括其任何随后的连续、分案或部分连续申请或在此基础上的任何新版本或扩充。
Claims (31)
1.一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法,其包括以下步骤:
从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品;
将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中,其中第一亚群的至少80%具有X染色体或Y染色体;
用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精;
由所述母猪生产后代;
对一个或多个所述后代计算选择指数;和
选择一个或多个具有与所述品系或品种的平均选择指数相比更高的选择指数的所述后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种的遗传进展。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述品系或品种是小母猪品系并且所述第一亚群具有X染色体。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述品系或品种是公猪品系并且所述第一亚群具有Y染色体。
4.如权利要求1所述的方法,其中一个或多个所述后代的选择指数是根据来源于包括所述后代的群组的数据计算的。
5.如权利要求1所述的方法,其中一个或多个所述后代的所述选择指数包括测量生育力、每窝产仔数和产奶量的性状。
6.如权利要求1所述的方法,其中一个或多个所述后代的所述选择指数包括测量饲料转化率、平均日增重和胴体瘦肉的性状。
7.如权利要求1所述的方法,其中用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精的步骤包括使用深子宫内导管或插入所述母猪的膜的针头对所述母猪的生殖道施用所述精细胞。
8.如权利要求7所述的方法,其中使用深子宫内导管对所述母猪的生殖道施用所述精细胞包括将所述精细胞放在一个或多个子宫角中。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述深子宫内导管包括摄像机或显示器。
10.如权利要求8所述的方法,其进一步包括在插入所述母猪的生殖道时通过放射显影或荧光透视观察所述深子宫内导管的步骤。
11.如权利要求8所述的方法,其中施用的所述精细胞的总数是1x109或更少个精细胞。
12.如权利要求7所述的方法,其中使用通过所述母猪的膜插入的针头对所述母猪的生殖道施用所述精细胞包括将所述精细胞注射到所述母猪的子宫的一个或多个输卵管中。
13.如权利要求12所述的方法,其进一步包括通过腹腔镜或摄像机观察插入所述一个或多个输卵管中的所述针头的步骤。
14.如权利要求12所述的方法,其中施用的所述精细胞的总数是1x10或更少个精细胞。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其进一步包括通过对所述母猪施用一种或多种激素或激素类似物使发情期同步或诱导定时排卵的步骤。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述一种或多种激素或激素类似物包括PG600、OvuGel、eCG、孕激素或hCG。
17.如权利要求15所述的方法,其中所述一种或多种激素或激素类似物是通过放入所述母猪的生殖道的可编程装置施用的。
18.如权利要求15所述的方法,其进一步包括通过研究所述雌性的卵泡来检测所述母猪中的排卵的步骤。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述卵泡是使用超声波研究的。
20.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述母猪是遗传核心或繁殖场种群的成员。
21.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述公猪是遗传核心或繁殖场种群的成员。
22.一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法,其包括以下步骤:
从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品;
将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中,其中第一亚群的至少80%具有X染色体或Y染色体;
用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精;
由所述母猪生产后代;
在一个或多个所述后代中获得性状的数值;和
选择一个或多个所述后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种的遗传进展,所述后代具有的所述性状的数值比所述品系或品种中的所述性状的平均值更大或更小。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述品系或品种是小母猪品系并且所述第一亚群具有X染色体。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述品系或品种是公猪品系并且所述第一亚群具有Y染色体。
25.一种提高猪种群或养猪场中的遗传优良的公猪的后代数目的方法,其包括:
建立来自种群或养殖场中的公猪群体的一个或多个遗传优良的公猪的亚群;
从所述一个或多个遗传优良的公猪中获得精细胞样品;
从每个所述精细胞样品中制备多个精细胞剂量;
对所述种群或所述养殖场中的多个母猪施用一种或多种激素或激素类似物以便诱导每个母猪的定时排卵;和
使用深子宫内导管或腹腔镜手术用一个或多个精细胞剂量对所述母猪授精,其中对每个母猪一起施用的一个或多个精细胞剂量包含总共小于1x109个精细胞,
从而提高种群或养殖场中的遗传优良的公猪的后代数目。
26.一种降低猪种群或养猪场中的育种所需的公猪数目的方法,其包括:
建立来自种群或养殖场中的公猪群体的一个或多个遗传优良的公猪的亚群;
从所述一个或多个遗传优良的公猪中获得精细胞样品;
从每个所述精细胞样品中制备多个精细胞剂量;
对所述种群或所述养殖场中的多个母猪施用一种或多种激素或激素类似物以便诱导每个母猪的定时排卵;和
使用深子宫内导管或腹腔镜手术用一个或多个精细胞剂量对所述母猪授精,其中对每个母猪一起施用的一个或多个精细胞剂量包含总共小于1x109个精细胞,
从而降低所述种群或所述养殖场中的育种所需的公猪数目。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法,其中遗传优良的公猪包括具有相对于所述种群或所述养殖场中的其它公猪更高的选择指数的公猪。
28.一种提高猪种群或养殖场的利益率的方法,其包括:
根据所述种群或养殖场从属的市场条件确定是雄猪还是雌猪产生更高的单猪净收入;
从公猪中采集精液样品;
将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中,其中如果所述雌猪产生更高的单猪净收入,那么第一亚群中的至少80%具有X染色体,或者如果所述雄猪产生更高的单猪净收入,那么第一亚群中的至少80%具有Y染色体;
用来自所述第一亚群的精细胞对母猪授精;和
由所述母猪生产后代。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述雄猪是阉公猪。
30.如权利要求28所述的方法,其中所述雌猪是小母猪。
31.如权利要求28所述的方法,其中根据所述种群或养殖场从属的市场条件确定是雄猪还是雌猪产生更高的单猪净收入的步骤包括比较雄猪和雌猪之间的性状,其中所述性状选自以下任一种:饲料转化率、体重、平均日增重、胴体瘦肉、腰肌厚度、背膘厚度、腹膘厚度、无脂瘦肉指数、每日瘦肉增重、单猪饲料费和脸颊脂肪碘值。
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