CN108660248B - 一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法 - Google Patents

一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法，包括如下步骤：1)群体构建；2)DNA提取；3)表型调查；4)作图标记基因型分析；5)与荚长紧密连锁的SNP标记的获得；6)SNP标记转化为CAPS标记；7)利用CAPS标记辅助筛选长荚后代。本发明准确性和效率高、简便易操作、成本低；所有携带2_49346位点长荚基因型的豇豆品种在用于育种时都可以运用本方法辅助选择长荚性状，满足大多数实验室田间育种工作。

Description

一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法
技术领域
本发明属于蔬菜育种生物技术领域，尤其属于一种运用分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法。
背景技术
豇豆(Vigna unguiculata L.Walp)(2n＝2x＝22)隶属豆科(Fabaceae)菜豆族(Trib.Phasoleae DC.)豇豆属(Vigna Savi)，从新石器时就作为人类的粮食作物，是人类最古老的食物来源之一(Summerfield et al.1974)。豇豆起源于非洲，西非是豇豆最重要的栽培中心(Steele 1976；Ng NQ Marechal 1985)。栽培豇豆主要分为普通豇豆(V.unguiculata ssp.unguiculata)和长豇豆(V.unguiculata ssp.sesquipedialis)两个亚种，当前广泛种植于全球热带/亚热带地区及部分温带地区(Agbicodo et al，2009)。我国是长豇豆主要生产和消费国之一，全国除高寒地区外均有种植，年栽培面积约占世界的1/5。长豇豆主要以嫩荚为食用器官，荚长是豇豆重要的农艺性状。不同豇豆品种的荚长差异巨大(10cm-120cm)，根据当前我国居民消费习惯商品荚长大约在60cm左右最为适宜。豇豆荚长性状通常表现为数量性状遗传特点，且不少情况下有效应强烈的主效QTL(Cruz-Izquierdo et al.,2012；Kongjaimun et al.,2012)，受环境影响较大，单单依靠传统系谱选择和性状考察的单纯育种方法来分析亲本遗传背景和亲缘关系，不仅选育的过程繁琐、耗时久而且选育的结果出现偏差的概率高，这就为研究数量性状遗传规律带来了困难。
分子标记技术作为一种新型的遗传标记技术，为上述难题的解决提供了技术支撑。近年来，单核甘酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分子标记技术得到越来越多国内外科研工作者的青睐。SNP分子标记是以PCR特异性扩增或DNA测序技术为基础的第3代分子标记技术，揭示的是基因组上由单个核苷酸的变异引起DNA序列多态性。SNP是基因组上分布最广泛、也最普遍的变异形式，平均每数百bp就存在1个SNP。目前SNP主要应用于大规模全基因组测序、遗传图谱的构建、QTL定位及重要基因克隆等方面(Wu etal.,2010)。
对SNP标记进行检测和分型的方法主要有：利用常规PCR技术结合限制酶酶切和电泳即可实现的酶切扩增多态性序列法(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)、直接测序分型法、基于高通量测序技术研发的SNP芯片分型法、竞争性等位基因特异性PCR分型法(Competitive allele-specific PCR，KASP)等。其中直接测序分型法和基于高通量测序技术研发的SNP芯片分型法的成本一般比较高，不适用于大多数育种实验室在田间育种中实际使用。LGC公司的KASP技术可以实现自动化和高通量的SNP分型，成本较测序法低。但是该技术对以单个性状定向改良为目的的育种来说成本仍然偏高，其技术难度对基层育种单位来说相对较高，推广应用有局限性。CAPS方法简单利用PCR技术和电泳技术实现SNP分型，具体来说就是当SNP位置能够引起酶切改变时，在SNP位置两侧设计引物可将SNP转化为CAPS，经相应限制性内切酶酶切后就可以检测原SNP位点的DNA多态性。这一技术操作简单、成本低、通用性比较好。
发明内容
本发明的目的是：针对难以早期选育和定向改良豇豆长荚性状的问题，提供一个与豇豆长荚基因紧密连锁且在育种实践中简便易行、成本低廉的分子标记，并建立利用该标记进行长荚豇豆辅助育种的方法，从而为豇豆荚长性状的遗传改良提供新的技术支撑。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种运用SNP标记辅助选育豇豆荚长品种的方法，包括如下步骤：
1)群体构建：利用短荚豇豆品种ZN016和长荚豇豆品种ZJ282杂交构建含若干单株的F2群体，提取F2植株DNA；
2)DNA提取：利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，稀释DNA浓度到50ng/μL备用；
3)表型调查：在F2群体豇豆豆荚完全成熟荚长不再伸长时，每株选取10个成熟豆荚用直尺量取豆荚长度，取平均数作为荚长表型；
4)作图标记基因型分析：根据豇豆荚长QTL粗定位结果，在国际豇豆整合遗传图谱上选择多个SNP标记对F2群体进行SNP基因型分析；
5)与荚长紧密连锁的SNP标记的获得：对多个SNP标记进行连锁作图，构建区域性饱和遗传图谱，根据F2基因型和表型数据扫描QTL，检测到LOD值最高的主效QTL，该QTL即为与豇豆荚长基因紧密连锁SNP标记之一；
6)SNP标记转化为CAPS标记：根据步骤5)所得SNP标记的侧翼序列来比对豇豆基因组，得到了一段236bp的序列，并找到能够引起酶切多态性的限制性内切酶HpaII识别位点，根据上述236bp序列，设计跨越HpaII识别位点的侧翼引物F引物和R引物，利用上述引物对豇豆长荚和短荚亲本DNA分别进行PCR扩增，再用HpaII酶对PCR产物进行酶切揭示多态性，所述的F引物和R引物分别为，F引物：TAGCCACCACCATCTTCCTC，R引物：CTCGCAGTTTGGAGCATCTT；
7)利用CAPS标记辅助筛选长荚后代：利用上述引物对待测豇豆杂交或回交后代进行PCR扩增，利用HpaII酶对扩增产物进行酶切后电泳，若待测样品出现与短荚亲本相同的带型则该材料具有和短荚亲本一致的荚长QTL基因型，可推断该材料为短荚材料；若待测样品出现与长荚亲本相同的带型则该材料具有和父本一致的荚长基因型，可推断该材料为长荚材料。
作为优选，步骤1)中F2代群体获得方法是来自以ZN016为母本，以ZJ282为父本杂交获得F1后再自交，所述的F2代群体植株数量不少于2000个单株。
作为优选，步骤4)与步骤5)中所述的多个SNP标记数量为433个。
本方案用DNA试剂盒(TIANGEN BIOTECH,北京)提取植株DNA获得豇豆基因型；
根据文献发表的豇豆荚长QTL Qpl.zaas-3粗定位结果(Xu et al.,2017)，在已发表的国际豇豆整合遗传图谱(
Figure BDA0001673709620000031
-Amatriaín et al.,2017)上选择433个SNP标记对F2群体进行SNP基因型分析，方法采用英国LGC公司标准KASP技术；
利用Joinmap 4软件对433个SNP标记进行连锁作图，构建Qpl.zaas-3区域性饱和遗传图谱；
根据F2基因型和表型数据利用ICIMapping4.0扫描QTL，结果在LG3上检测到一个主效QTL，该QTL的LOD值高达210.626，位于2_49346与2_25214之间，该区间大小仅有0.132cM，能解释22.2373％的表型变异，2_49346即为与豇豆荚长基因紧密连锁SNP标记之一；
根据SNP标记2_49346的侧翼序列来比对豇豆基因组，得到了一段236bp的序列，利用dCAPS Finder 2.0软件寻找到能够引起酶切多态性的限制性内切酶HpaII识别位点，根据上述236bp序列，利用Primer3软件设计跨越HpaII识别位点的侧翼引物，利用上述引物对豇豆长荚和短荚亲本DNA分别进行PCR扩增，再用HpaII酶对PCR产物进行酶切揭示多态性；
利用上述引物对待测豇豆杂交或回交后代进行PCR扩增，利用HpaII酶对扩增产物进行酶切后电泳，比对荚长QTL基因型，可推断该材料为短荚材料或为长荚材料。
与现有的技术相比，本方案能够提高准确性：豇豆荚长性状属于数量遗传性状，表型数据易受环境因素的影响，这无疑会降低依据表型数据进行选择的传统育种方法的准确性，本方案开发的CAPS分子标记可以从DNA水平直接追踪控制荚长的主效QTL，不受环境和测量人、工具等因素影响，提高了选择准确性；本方案可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程：传统的育种方法需要在荚进入成熟期、荚长不再延伸才能进行表型选择会延伸到最大长度，而此时植株已进入生育后期，无法再进行杂交、回交等育种工作，应用本方案分子标记技术进行选育，在苗期即可确认目的基因的存在与否，从而提早进行选择，这可大大节省育种时间，加快育种进程。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)准确性和效率高、简便易操作、成本低；(2)所有携带2_49346位点长荚基因型的豇豆品种在用于育种时都可以运用本方法辅助选择长荚性状，满足大多数实验室田间育种工作。
附图说明
图1是本发明SNP标记2_49346所在区段DNA序列和HpaII识别位示意图。
图2是本发明的LG3上荚长主效QTL区域局部连锁图。
图3是本发明的CAPS2_49346扩增部分后代材料，酶切后的电泳条带图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的描述，如图1-图3所示，
实施例一，CAPS2_4936标记的获得：
植株材料采用‘ZN016’和‘ZJ282’材料，均是经过高代纯合的品系，‘ZN016’为短荚材料，平均荚长为32cm,‘ZJ282’为长荚材料，平均荚长为47cm，含2153株单株的F2代大群体来自‘ZN016’(母本，P1)和‘ZJ282’(父本，P2)杂交获得F1后再自交；
用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH,北京)提取上述F2群体DNA，利用433个SNP标记对F2群体DNA进行分型；
在豇豆成熟期每株量取10个荚长数值取均值；
利用Jionmap 4软件对433个SNP标记进行连锁作图，构建区域性(Qpl.zaas-3)饱和遗传连锁图谱，如图2所示；
利用IcIMapping 4.0软件运用复合区间作图法(ICIM-ADD)对荚长性状扫描QTL。作图的具体参数如下：步长(step size)为1cM，显著水平(PIN)为0.001，以LOD阈值(LODthreshold)为3.0；最终将豇豆荚长主效QTL定位在LG3连锁群上，该QTL的侧翼标记为2_49346和2_25214，LOD值高达210.626，可解释22.2373％的表型变异，如表1所示；这说明CAPS2_4936标记与豇豆荚长基因紧密连锁，能够成为在实际生产上辅助筛选豇豆荚长性状基因的标记；
表1 LG3上QTLs扫描结果(LOD阈值＝3.0)
Figure BDA0001673709620000041
实施例二，利用CAPS2_4936标记在杂交后代中辅助筛选长荚材料：
根据实施例一所得SNP标记2_49346的侧翼序列来比对豇豆基因组，可得到一段236bp的序列，利用dCAPS Finder 2.0软件寻找到能够引起酶切多态性的限制性内切酶HpaII识别位点，根据上述236bp序列，如图1所示，下划线代表CAPS2_49346引物序列，F引物：TAGCCACCACCATCTTCCTC，R引物：CTCGCAGTTTGGAGCATCTT，方框代表HpaII酶切识别位点(CCGG)，在长荚亲本中序列为：CCGG(可被酶切)，在短荚亲本中序列为：CAGG(不可被酶切)；利用Primer3软件设计跨越HpaII识别位点的侧翼引物F引物和R引物，利用上述引物对豇豆长荚和短荚亲本DNA分别进行PCR扩增，再用HpaII酶对PCR产物进行酶切揭示多态性；
利用实施例一中方法提取上述材料DNA，利用CAPS2_4936引物扩增这些材料，PCR反应体系及扩增程序如下：。
PCR反应体系(20μL)：
Figure BDA0001673709620000051
PCR扩增程序：
Figure BDA0001673709620000052
对PCR扩增产物按如下步骤进行酶切：
Figure BDA0001673709620000053
酶切温度为37℃，酶切时间为16h，取2μL酶切产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电压为200V，电泳时间为1h 40min，用银染法染色显带，照相后用Photoshop软件处理图片；酶切后结果显示有5份材料携带ZN016的带型，有5份材料携带ZJ282的带型，见图3所示，P1代表短荚母本ZN016，MP1表示酶切后母本ZN016，P2代表长荚父本ZJ282，MP2表示酶切后父本ZJ282，1～10表示酶切后不同F2单株的条带，其中1～5为长荚后代，6～10为短荚后代；植株生长后期荚成熟后进行田间鉴定也表明携带ZN016带型的表现为短荚，携带ZJ282带型的表现为长荚，这表明CAPS2_4936标记能够准确用于田间辅助选育荚长性状。

Claims (3)

1.一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)群体构建：利用短荚豇豆品种ZN016和长荚豇豆品种ZJ282杂交构建含若干单株的F2群体，提取F2植株DNA；
2)DNA提取：利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，稀释DNA浓度到50ng/μL备用；
3)表型调查：在F2群体豇豆豆荚完全成熟荚长不再伸长时，每株选取10个成熟豆荚用直尺量取豆荚长度，取平均数作为荚长表型；
4)作图标记基因型分析：根据豇豆荚长QTL粗定位结果，在国际豇豆整合遗传图谱上选择多个SNP标记对F2群体进行SNP基因型分析；
5)与荚长紧密连锁的SNP标记的获得：对多个SNP标记进行连锁作图，构建区域性饱和遗传图谱，根据F2基因型和表型数据扫描QTL，检测到LOD值最高的主效QTL，该QTL即为与豇豆荚长基因紧密连锁SNP标记之一；
6)SNP标记转化为CAPS标记：根据步骤5)所得SNP标记的侧翼序列来比对豇豆基因组，得到了一段236bp的序列，并找到能够引起酶切多态性的限制性内切酶HpaII识别位点，根据上述236bp序列，设计跨越HpaII识别位点的侧翼引物F引物和R引物，利用上述引物对豇豆长荚和短荚亲本DNA分别进行PCR扩增，再用HpaII酶对PCR产物进行酶切揭示多态性，所述的F引物和R引物分别为，F引物：TAGCCACCACCATCTTCCTC，R引物：CTCGCAGTTTGGAGCATCTT；
7)利用CAPS标记辅助筛选长荚后代：利用上述引物对待测豇豆杂交或回交后代进行PCR扩增，利用HpaII酶对扩增产物进行酶切后电泳，若待测样品出现与短荚亲本相同的带型则该材料具有和短荚亲本一致的荚长QTL基因型，可推断该材料为短荚材料；若待测样品出现与长荚亲本相同的带型则该材料具有和父本一致的荚长基因型，可推断该材料为长荚材料。
2.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法，其特征是，步骤1)中F2代群体获得方法是来自以ZN016为母本，以ZJ282为父本杂交获得F1后再自交，所述的F2代群体植株数量不少于2000个单株。
3.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选育长荚豇豆品种的方法，其特征是，步骤4)与步骤5)中所述的多个SNP标记数量为433个。
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