CN104099415B - 一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的snp标记的检测引物及其应用 - Google Patents

一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的snp标记的检测引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用。检测引物包括：ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；AS SN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。利用本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出肌肉生长抑制素基因的SNP位点，该位点显著与肌肉重量相关联，再根据PCR扩增电泳图可直观地比较个体间闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早期筛选目标性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。

Description

一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用
技术领域：
本发明属于水产动物遗传及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物及其应用。
背景技术：
马氏珠母贝是我国及世界上海水珍珠养殖的主要物种。我国自1965年成功地开展了马氏珠母贝人工育苗以来，海水珍珠产业发展迅速，已成为广东、广西及海南部分沿海地区海水养殖支柱产业之一。近10多年，我国海水珍珠的质量和产量明显下降，国际竞争力减弱，养殖经济效益下滑。就其原因，除了养殖环境恶化、养殖技术落后外，还有一个重要原因是：多年来不注重种贝的选育和保留，缺乏优良品种；种苗质量参差不齐，育珠母贝性状退化，如生长慢、个体小型、育珠能力减弱等。为了我国海水珍珠养殖业的健康稳定发展，培育适合我国海区养殖的马氏珠母贝优良品种已迫在眉睫。
育种技术有杂交、选择育种，生物技术育种及分子育种等多种方法。分子育种是目前国内外研究的热点，是育种技术发展的主要方向，它具有高效、快捷的特点。分子育种离不开分子标记的开发，用在海洋贝类遗传育种研究的分子标记主要有限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、锚定简单重复序列(ISSR)、简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、表达序列标签(EST)、线粒体DNA(mtDNA)、核糖体DNA内转录间隔区标记(ITS)分子标记等。Qiu等对合浦珠母贝不同群体进行EST-SSR标记与生长及珍珠层性状的关联分析，结果表明在野生群体中基因PmartE05、PmartE35与壳高、总重显著相关，基因PmartE64与珍珠层厚度显著相关，在养殖群体中发现基因PmartE05与壳高显著的相关。Cong等利用SNP标记研究太平洋牡蛎的胰岛素相关多肽基因(oIRP)的多态性与生长性状的关联分析，发现在oIRP基因1.5kb处发现31个SNPs，其中6个与生长性状显著相关，特别是标记T1358G和标记G1437A与壳高、壳长、壳宽、总重、软体部重5个生长性状显著相关。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物。
本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括：
ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；
ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；
ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；
ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
本发明的第二个目的是提供一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记，其特征在于，其特异性检测引物为：
ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；
ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；
ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；
ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
本发明的第三个目的是提供与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在鉴定马氏珠母贝闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a、提取马氏珠母贝样品基因组DNA；
b、采用上述引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO对马氏珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增；
c、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有207bp和180bp大小2条带的为AG型，个体为闭壳肌重小的样品；当只出现180bp大小1条带的为GG型，个体为闭壳肌重大的个体。
优选，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：12.5μL PCR反应体系如下：包含马氏珠母贝样品基因组DNA40ng，1×PCR Mixture，引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO各0.5μM，0.125U Taq DNA酶，余量为水；反应条件为：94℃，5min；94℃35s，62℃40s；72℃40s，5个循环；94℃35s，60℃40s，72℃40s，15个循环；94℃35s，58℃40s，72℃40s，15个循环：72℃延伸10min。
本发明的第四个目的是提供与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。
利用本发明的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，能够扩增出肌肉生长抑制素基因的SNP位点，该位点显著与肌肉重量相关联，再根据PCR扩增电泳图可直观地比较个体间闭壳肌重的大小，可直接用于后续的分子标记辅助育种，如可在生长早期筛选目标性状，进而筛选特定的个体进行品种培育。
附图说明：
图1是与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的扩增电泳图，其中泳道1-12为马氏珠母贝样品，M为marker。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
随机取来至于同一群体的50个马氏珠母贝个体，清洗干净后，取其闭壳肌组织用电子天平称重并一一对应记录，然后取一小块闭壳肌组织置于95％乙醇中，于-20℃保存。使用HiPureUniversal DNA Kit(广州美基生物公司)对闭壳肌的基因组DNA进行提取，相关操作参见试剂盒说明书进行。DNA提取后，于1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度，于-20℃保存。
与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物为：
ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；
ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；
ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；
ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC
用上述引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO对马氏珠母贝样品基因组DNA在PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应体系如下：扩增体系12.5ul，包含马氏珠母贝样品基因组DNA0.4μL，6.25μL2×PCR Mixture,10μM引物(ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO)各0.5μL,0.125U Taq DNA酶(广州东盛生物科技有限公司)，双蒸水补足至12.5μL。反应条件为：94℃，5min；94℃35s，62℃40s；72℃40s，5个循环；94℃35s，60℃40s，72℃40s，15个循环；94℃35s，58℃40s，72℃40s，15个循环：72℃延伸10min。PCR产物用3％琼脂糖(广州康龙科技生物公司)凝胶电泳，用凝胶成像系统观察电泳图谱。分型电泳图如图1所示，出现具有207和180bp大小2条带的AG型(泳道6和8)，只出现180bp大小1条带的为GG型(泳道2-4、7、9-12)。在这50个个体中，AG型个体29个，肌肉重0.68±0.34g，GG型个体有21个，闭壳肌重1.07±0.37g。采用SPSS17.0软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)对SNP位点与肌肉重进行关联分析，GG型个体的闭壳肌重显著大于AG型个体(p<0.01)，即认为它们之间具有极其显著的统计学差异。

Claims (5)

1.一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的检测引物，其特征在于，包括：
ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；
ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；
ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；
ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
2.一种与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记，其特征在于，其特异性检测引物为：
ASSN815FI：TCCATCGTGGACAAACGTGTAA；
ASSN815RI：GTGTCAAAGTAAACTGTATCTCGTGCC；
ASSN815FO：TAGAATTGGCAAAGGAACAAGCAT；
ASSN815RO：AATAATTCCTAACAGGTGCCCGTC。
3.检测与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记的引物在鉴定马氏珠母贝闭壳肌重大小中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a、提取马氏珠母贝样品基因组DNA；
b、采用权利要求1所述的检测引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO对马氏珠母贝样品基因组DNA进行PCR扩增；
c、根据PCR扩增产物对马氏珠母贝样品进行鉴定，当出现具有207bp和180bp大小2条带的为AG型，个体为闭壳肌重小的样品；当只出现180bp大小1条带的为GG型，个体为闭壳肌重大的个体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：12.5μL PCR反应体系如下：包含马氏珠母贝样品基因组DNA 40ng，1×PCR Mixture，检测引物ASSN815FI、ASSN815RI、ASSN815FO、ASSN815RO各0.5μM，0.125U Taq DNA酶，余量为水；反应条件为：94℃，5min；94℃35s，62℃40s，72℃40s，5个循环；94℃35s，60℃40s，72℃40s，15个循环；94℃35s，58℃40s，72℃40s，15个循环；72℃延伸10min。
5.权利要求2所述的与马氏珠母贝闭壳肌重相关联的SNP标记在马氏珠母贝分子标记辅助育种中的应用。
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