CN110218801A - 一种与马氏珠母贝生长性状相关的egfr基因snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与马氏珠母贝生长性状相关的egfr基因snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域；该位点对应于马氏珠母贝微管蛋白EGFR基因位点，此处碱基为C或T。本发明SNP标记与马氏珠母贝生长性状(壳高、壳宽与壳重)显著关联，是一个新的分子标记，通过确定待测马氏珠母贝SNP位点基因型，从而对马氏珠母贝生长性状进行早期选育，缩短育种周期，提高遗传进展，节省生产成本，具有明显的经济效益与社会效益。

Description

一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记及 其应用
技术领域
本发明公开了一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域。
背景技术
表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor，EGFR)是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜表面受体，对细胞的生长、增殖、分化、移行、粘附以及机体的发育等起着重要的调节作用。EGFR与配体(表皮生长因子、转化生长因子a、双调蛋白等)结合后将细胞外刺激信号传入细胞内，并启动一系列的级联反应，最终调节细胞的行为。马氏贝EGFR基因的cDNA全长4934bp，开放阅读框(ORF)4269bp，编码1422个氨基酸。预测的EGFR蛋白由N端的细胞外区(1-803aa)、跨膜区(804-826aa)和C端的细胞内区(927-1422aa)三部分组成。
马氏珠母贝主要生产有核珍珠，于上世纪90年代达到产业高峰，养殖面积近30万亩，年产珍珠20万吨左右，未加工的初级产品产值超过2亿元。南珠因为珍珠品质优良而闻名世界。然而，近几年马氏珠母贝的养殖规模不断缩小，马氏珠母贝珍珠质量与产量明显下降，马氏珠母贝珍珠产业陷入了低迷。影响南珠产业衰退的因素中，马氏珠贝种质退化是一个不可忽视的原因。随着人类活动对海洋环境影响的加剧，马氏珠母贝的的野生群体变得越来越小，同时由于生产一线人员在苗种培育方面缺乏基本的育种理论，造成长期近交衰退，另外，科研人员引种进行杂交育种或从杂交后代中进行选择育种时，造成品种混杂。直接造成马氏珠母贝生长速度慢，抗逆性差，珍珠质分泌能力差，进而造成养殖周期长和珍珠品质差的严重后果。因此，培育适合海区养殖新品种，能促进珍珠产业健康可持续发展。
分子标记辅助育种是借助与性状紧密相关的分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种,是分子生物学和基因组学的研究结果应用到水产养殖品种选育的技术。由于基因/标记代表性状的遗传基础,因此这项技术被誉为从传统表型选择亲本提升到根据基因型选择亲本的革命性的技术进步。马氏珠母贝生长性状由多基因控制，筛选决定生长性状关键基因，进行候选基因的关联分析，获得与性状直接关联的标记或基因型，提高选择准确性，降低育种成本。
发明内容
本发明提供了一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记及其应用，可通过确定待测马氏珠母贝SNP位点的基因型，从而对马氏珠母贝生长性状(壳高、壳长、壳宽与壳重)进行早期选育，不会受到马氏珠母贝贝龄限制，可有效用于马氏珠母贝的早期选育，缩短选育进程。
本发明所采取的技术方案是：
一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记，所述的SNP标记位于马氏珠母贝EGFR基因C21636T位点，此处碱基为C或T；
所述SNP分子标记在马氏珠母贝早期选育中的应用；
一种马氏珠母贝壳型性状早期选育的方法，根据马氏珠母贝EGFR基因C21636T位点基因型对马氏珠母贝生长性状进行早期选育，包括如下步骤：
(1)提取待测马氏珠母贝的基因组DNA；
(2)设计特异性扩增含有马氏珠母贝EGFR基因C21636T位点的基因片段的引物对；
(3)以步骤(2)设计的引物对马氏珠母贝基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增所得基因片段的SNP位点的基因型；
(4)基于SNP位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育；
所述的PCR扩增引物序列为：
一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记的应用，步骤(1)所述的提取待测马氏珠母贝的基因组DNA的步骤如下：使用试剂盒提取基因组DNA，具体步骤包括：
(1)取0.05g闭壳肌，放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管；
(2)剪碎肌肉组织，加入4μL 100mg/mL核糖核酸酶A溶液，振荡15sec，室温放置5min；
(3)加入20μL20mg/mL蛋白酶K溶液，涡旋混匀，简短离心，56℃放置3h，每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15sec；
(4)加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心；
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)重复操作步骤7；
(10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置10分钟；
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
本发明的优点：本发明提供了一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记位于马氏珠母贝EGFR基因C21636T位点，此处碱基为C或T。所述的马氏珠母贝EGFR基因核苷酸序列自启动子21636位碱基CT与马氏珠母贝的生长性状显著相关，即马氏珠母贝EGFR基因C21636T位点的SNP标记与马氏珠母贝生长性状(壳长、壳高、壳宽与体重)相关，通过确定待测个体SNP位点基因型，筛选目标基因型，从而可以对马氏珠母贝生长性状进行早期选育。这样可以增加选择的准确性，缩短育种周期，减少生产成本。
附图说明
图1马氏珠母贝EGFR基因部分片段的PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制发明的保护范围。试验用的马氏珠母贝来源于利用涠洲岛野生繁育的基础群体。
实施例1
一、基因组DNA提取
使用TIANGEN的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤包括：
(1)取0.05g闭壳肌，放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管；
(2)剪碎肌肉组织，加入4μL核糖核酸酶A(100mg/mL)溶液，振荡15sec，室温放置5min。
(3)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，涡旋混匀，简短离心，56℃放置3h，每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15sec；
(4)加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心；
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)重复操作步骤7；
(10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温放置10分钟；
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
二、SNP分子标记的检测
1.引物设计
设计特异性扩增含有马氏珠母贝EGFR基因C21636T位点的基因片段的引物对。基于EGFR基因序列，利用软件Primer5.0设计特异性扩增引物，所扩增引物序列为：
2.扩增与检测
以设计的引物序列对样品的DNA进行扩增，检测扩增所得到的基因片段的SNP位点的基因型；
反应扩增体系15μL：包括0.2μLDNA聚合酶(5U/μL)、1.5μL10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液、1.2μL脱氧核糖核苷三磷酸dNTP混合液(各2.5mM)、0.4μL氯化镁MgCl2(25mM)、上下游外引物各0.3μL、上下游内引物各1.5μL、双蒸水6.6μL。程序设定为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1：10min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃恒温保存。
三、SNP位点基因型与性状关联分析
利用t检验比较各基因型生长性状平均值差异，显著性水平设为P<0.05。
其SNP位点的基因频率及生长性状的关联分析如下表1所示；
表1SNP位点基因频率及生长性状的关联分析
由表1可知，该SNP位点为TT基因型的个体的性状均值(壳高、壳宽与体重)显著大于CC、TC基因型。该核苷酸序列自启动子21636碱基C或T与马氏珠母贝生长性状显著相关。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagtgaa aagaggcggt tgt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataaccgtgg tcacatttct acg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaccatggt tatttcagga tca 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaagtccaa ggtctggctg aat 23

Claims (6)

1.一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记，其特征在于：所述的SNP分子标记位于马氏珠母贝微管蛋白EGFR基因的C21636T位点，此处碱基为C或T。
2.一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记的应用，其特征在于：权利要求1所述的SNP分子标记应用于马氏珠母贝早期选育。
3.根据权利要求2所述的一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记的应用，其特征在于：SNP分子标记位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
4.根据权利要求3所述一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记的应用，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取待测马氏珠母贝的基因组DNA；
(2)设计特异性扩增含有马氏珠母贝EGFR基因21636位点的基因片段的引物对；
(3)以步骤(2)设计的引物对马氏珠母贝基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增所得基因片段的SNP位点的基因型；
(4)基于SNP位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
5.根据权利要求4所述一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记的应用，其特征在于：所述PCR扩增的引物对的序列如SEQ ID。
6.根据权利要求4所述一种与马氏珠母贝生长性状相关的EGFR基因SNP分子标记的应用，其特征在于：步骤(1)所述的提取待测马氏珠母贝的基因组DNA的步骤如下：使用试剂盒提取基因组DNA，具体步骤包括：
(1)取0.05g闭壳肌，放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管；
(2)剪碎肌肉组织，加入4μL 100mg/mL核糖核酸酶A溶液，振荡15sec，室温放置5min；
(3)加入20μL20mg/mL蛋白酶K溶液，涡旋混匀，简短离心，56℃放置3h，每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15sec；
(4)加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心；
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)重复操作步骤7；
(10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置10分钟；
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
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