CN110218800A - 一种与马氏珠母贝生长性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与马氏珠母贝生长性状相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB‑4BSNP分子标记及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域；该位点对应于马氏珠母贝微管蛋白TubB‑4B基因位点，此处碱基为G或C。本发明SNP标记与马氏珠母贝生长性状(壳高、壳宽与壳重)显著关联，是一个新的分子标记，通过确定待测马氏珠母贝SNP位点基因型，从而对马氏珠母贝生长性状进行早期选育，缩短育种周期，提高遗传进展，节省生产成本，具有明显的经济效益与社会效益。

Description

一种与马氏珠母贝生长性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明公开了一种与马氏珠母贝生长性状相关的SNP分子标记及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域。
背景技术
选择育种是一种常见的育种技术，现有文献报道了利用群体(或家系)选择改良了栉孔扇贝Chlamys farreri、华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis、海湾扇贝Argopectenirradias、长牡蛎Crassostrea gigas与马氏珠母贝P.fuctada martensii等贝类养殖群体的经济性状。马氏珠母贝基础群体或养殖群体存在较高的遗传变异，适宜采用选择育种技术改良目标性状。结合群体与家系选择育种技术，已经培育了“海选1号”、“南科1号”与“南珍1号”养殖新品种，明显改良了养殖群体性状。马氏珠母贝1.5龄达到性成熟，利用传统育种技术培育一个养殖新品种至少需要10年时间。利用分子标记辅助育种技术可进行早期(未达到性成熟)，缩短育种周期。
微管蛋白是构成真核细胞骨架的主要成分之一，有关微管蛋白分为α-，β-，γ-，δ-，ε-，ζ-六种，均参与微管的形成，参与多种修饰过程，包括乙酰化，磷酸化，泛素化等，且对生长发育，变态等生命过程有影响，β-微管蛋白可与多种药物结合，且过表达会使微管不稳定，抑制细胞生长。研究发现TubB-4B基因参与小鼠牙齿发育，全组织荧光定量结果显示TubB-4B在所有组织中均有表达，表明其可在多种组织中起调节作用。利用EGF和IGF两种生长因子分别处理UMR106细胞12h，在促进细胞DNA合成的同时，β-微管蛋白mRNA的表达量明显提高，这表明微管蛋白的合成与细胞增殖间存在相互联系(刘彬等，1995)。
发明内容
本发明提供了一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记及其应用，可通过确定待测马氏珠母贝SNP位点的基因型，从而对马氏珠母贝生长性状(壳高、壳长、壳宽与壳重)进行早期选育，不会受到马氏珠母贝贝龄限制，可有效用于马氏珠母贝的早期选育，缩短选育进程。
本发明所采取的技术方案是：
一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记，所述的SNP分子标记位于马氏珠母贝微管蛋白TubB-4B基因的G10009C位点，此处碱基为G或C。
一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，所述的SNP分子标记应用于马氏珠母贝早期选育。
SNP分子标记位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，包括如下步骤：
(1)提取待测马氏珠母贝的基因组DNA；
(2)设计特异性扩增含有马氏珠母贝TubB-4B基因10009位点的基因片段的引物对；
(3)以步骤(2)设计的引物对马氏珠母贝基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增所得基因片段的SNP位点的基因型；
(4)基于SNP位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
所述的PCR扩增引物序列为：
步骤(1)所述的提取待测马氏珠母贝的基因组DNA的步骤如下：使用试剂盒提取基因组DNA，具体步骤包括：
(1)取0.05g闭壳肌，放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管；
(2)剪碎肌肉组织，加入4μL浓度为100mg/mL的核糖核酸酶A溶液，振荡15sec，室温放置5min；
(3)加入20μL浓度为20mg/mL蛋白酶K溶液，涡旋混匀，简短离心；56℃放置3h，每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15sec；
(4)加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，离心；
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)重复操作步骤7；
(10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温放置10分钟；
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
本发明的优点：本发明提供了一种与马氏珠母贝生长性状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记位于马氏珠母贝TubB-4B基因G10009C位点，此处碱基为G或C。所述的马氏珠母贝TubB-4B基因核苷酸序列自启动子10009位碱基GC与马氏珠母贝的生长性状显著相关，即马氏珠母贝TubB-4B基因G10009C位点的SNP标记与马氏珠母贝生长性状(壳长、壳高、壳宽与体重)相关，通过确定待测个体SNP位点基因型，筛选目标基因型，从而可以对马氏珠母贝生长性状进行早期选育。这样可以增加选择的准确性，缩短育种周期，减少生产成本。
附图说明
图1马氏珠母贝TubB-4B基因部分片段的PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制发明的保护范围。试验用的马氏珠母贝来源于利用涠洲岛野生繁育的基础群体。
实施例1
一、基因组DNA提取
使用TIANGEN的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤包括：
(1)取0.05g闭壳肌，放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管；
(2)剪碎肌肉组织，加入4μL核糖核酸酶A(100mg/mL)溶液，振荡15sec，室温放置5min；
(3)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，涡旋混匀，简短离心；56℃放置3h，每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15sec；
(4)加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心；
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)重复操作步骤(7)；
(10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置10分钟；
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
二、SNP分子标记的检测
1.引物设计
设计特异性扩增含有马氏珠母贝TubB-4B基因G10009C位点的基因片段的引物对。基于TubB-4B基因序列，利用软件Primer5.0设计特异性扩增引物，所扩增引物序列为：
2.扩增与检测
以设计的引物序列对样品的DNA进行扩增，检测扩增所得到的基因片段的SNP位点的基因型；
反应扩增体系15μL：包括0.2μLDNA聚合酶(5U/μL)、1.5μL10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液、1.2μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合液(各2.5mM)、0.4μL氯化镁MgCl2(25mM)、上下游外引物各0.3μL、上下游内引物各1.5μL、双蒸水6.6μL；程序设定为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1：10min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃恒温保存。
三、SNP位点基因型与性状关联分析
利用t检验比较各基因型生长性状平均值差异，显著性水平设为P<0.05。
其SNP位点的基因频率及生长性状的关联分析如下表1所示。
表1SNP位点基因频率及生长性状的关联分析
由表1可知，该SNP位点为GC基因型的个体的性状均值(壳高、壳宽与体重)显著大于CC基因型。该核苷酸序列自启动子10009碱基G或C与马氏珠母贝生长性状显著相关。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种与马氏珠母贝生长性状相关的SNP分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgagggta tggatgagat gg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttcttctt ccccttcctc atc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagaggaag gcgaagaaga tgc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagagttgg cgaaaggatg tg 22

Claims (6)

1.一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记，其特征在于：所述的SNP分子标记位于马氏珠母贝微管蛋白TubB-4B基因的G10009C位点，此处碱基为G或C。
2.一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，其特征在于：权利要求1所述的SNP分子标记应用于马氏珠母贝早期选育。
3.根据权利要求2所述的一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，其特征在于：SNP分子标记位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
4.根据权利要求3所述一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取待测马氏珠母贝的基因组DNA；
(2)设计特异性扩增含有马氏珠母贝TubB-4B基因10009位点的基因片段的引物对；
(3)以步骤(2)设计的引物对马氏珠母贝基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增所得基因片段的SNP位点的基因型；
(4)基于SNP位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
5.根据权利要求4所述一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，其特征在于：所述PCR扩增的引物对的序列如SEQ ID。
6.根据权利要求4所述一种与马氏珠母贝生长性状相关的TubB-4BSNP分子标记的应用，其特征在于：步骤(1)所述的提取待测马氏珠母贝的基因组DNA的步骤如下：使用试剂盒提取基因组DNA，具体步骤包括：
(1)取0.05g闭壳肌，放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管；
(2)剪碎肌肉组织，加入4μL浓度为100mg/mL的核糖核酸酶A溶液，振荡15sec，室温放置5min；
(3)加入20μL浓度为20mg/mL蛋白酶K溶液，涡旋混匀，简短离心；56℃放置3h，每小时振荡混合样品2-3次，每次振荡混匀15sec；
(4)加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；
(5)加人200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
(9)重复操作步骤(7)；
(10)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱置于室温放置10分钟；
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
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