CN105087575A

CN105087575A - 影响栉孔扇贝肌肉生长的主效snp标记及其应用

Info

Publication number: CN105087575A
Application number: CN201510627751.0A
Authority: CN
Inventors: 宋斌; 王洪宝; 佟桂芝; 李红宇; 李伟; 许红喜; 杨伟光; 王秀利
Original assignee: Heilongjiang Institute of Animal Husbandrry
Current assignee: Heilongjiang Institute of Animal Husbandrry
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2015-11-25

Abstract

影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记及其应用，涉及基因工程及分子生物学领域，具体的说涉及影响扇贝肌肉生长的SNP标记及其应用。本发明提供一种影响扇贝肌肉生长的主效SNP标记及其应用。该SNP标记位于栉孔扇贝MSTN基因如SEQ？ID？NO：1所示序列的7528bp处，此处碱基为G的扇贝个体的总重、闭壳肌重和软体重显著高于此处为A的扇贝肌肉。本发明提供的分子遗传标记不受扇贝的年龄和雌雄等限制，检测方法准确。本发明的SNP标记可用于鉴定肉质肥硕的扇贝优势品种。

Description

影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体的说涉及影响扇贝肌肉生长的SNP标记及其应用。

背景技术

栉孔扇贝(Chlamysfarreri)属双壳纲(Bivalvia)珍珠贝目(Pterioida)扇贝科(Pectinidae)，贝壳较大，成圆扇形。两壳略等，左壳稍凸而右壳较平。壳顶位于背缘，略凸。两耳不等，前大后小，皆呈三角形；右壳前耳下方具有足丝孔和细栉齿。壳色有变化，多呈浅褐、橙黄、紫褐等色，也有灰白和浅驼色的。两壳放射肋不同：左侧有粗肋10条左右，主肋间还有小肋；右壳有20条粗肋，肋上皆有不规则的生长棘。贝壳内面颜色较浅，肌痕大而圆，较明显。韧带褐色，位于三角穴的韧带槽中。外套薄，外套缘厚，具有许多发达的触手，触手基部有许多外套眼。足丝极发达，细线状。

七十年代以来，栉孔扇贝人工育苗成功，以及随后人工采苗技术的成熟与完善，栉孔扇贝海水养殖己在我国山东、辽宁两省形成产业。但较为严重的是，近年来栉孔扇贝的海水养殖业出现了病害流行、大规模死亡等严重问题。目前，对于栉孔扇贝大规模死亡的原因尚不清楚，推测可能有以下原因导致：养殖密度过高，近海水域生态系统的不良变化如水质变坏等，栉孔扇贝种质一定程度衰退等。为了增强栉孔扇贝的抗逆能力，提高其品质和质量，保证栉孔扇贝养殖业的持续、健康和稳定发展，非常有必要研究和认识栉孔扇贝各自然群体的遗传结构和遗传变异水平，为人们更有效地管理、利用和保护栉孔扇贝种质资源和进行优良种质培育提供遗传学依据。

栉孔扇贝在我国主要分布在辽宁省、山东省、江苏省等沿海地区，是具有重要经济价值的海产资源。随着养殖规模的不断扩大，近年来，随着养殖的高密度、规模化、集约化和工厂化生产的发展，病害不断爆发流行，造成大规模死亡，经济损失十分惨重。许多研究表明遗传变异水平与生物的生长速度，抗病能力等生产性状密切相关，因此检测遗传变异水平对于选择育种和人工增殖是很有意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记及其应用。

本发明影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记位于栉孔扇贝MSTN基因如SEQIDNO：1所示序列的7528bp处，此处碱基为G的扇贝个体的总重、闭壳肌重和软体重显著高于此处为A的扇贝肌肉。

本发明还提供用于检测上述影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记的引物，包括正向引物5’-CCAACCAAACGAGAAATCGG-3’和反向引物5’-ACGTATCCGTCATTTACCCC-3’。

本发明还提供上述影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质肥硕的扇贝优势品种中的应用，其包括以下步骤：

一、提取扇贝闭壳肌组织基因组DNA；

二、以扇贝闭壳肌组织基因组DNA为模板，以引物F和R，PCR反应扩增出扇贝MSTN基因片段；所述引物F为5’-CCAACCAAACGAGAAATCGG-3’，引物R为5’-ACGTATCCGTCATTTACCCC-3’

三、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中7528bp处的碱基为G，则待测扇贝属于肉质肥硕的扇贝优势品种。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的分子遗传标记不受扇贝的年龄和雌雄等限制，可大大加快扇贝的育种进程。

2、本发明的检测方法准确。

附图说明

图1为栉孔扇贝的基因组DNA1％琼脂糖凝胶电泳图谱；

图2为引物M-5聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图3为引物M-7聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图4为引物M-5扩增产物AA和BB基因型7528bp处突变的测序峰图；

图5为引物M-7扩增产物CC和DD基因型9397bp处突变的测序峰图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记位于栉孔扇贝MSTN基因如SEQIDNO：1所示序列的7528bp处，此处碱基为G的扇贝个体的总重、闭壳肌重和软体重显著高于此处为A的扇贝肌肉。

具体实施方式二：本实施方式用于检测影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记的引物，包括正向引物5’-CCAACCAAACGAGAAATCGG-3’和反向引物5’-ACGTATCCGTCATTTACCCC-3’。

具体实施方式三：本实施方式影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质肥硕的扇贝优势品种中的应用，其包括以下步骤：

一、提取扇贝闭壳肌组织基因组DNA；

为验证本发明的有益效果，进行以下实验：

实验样本：103个栉孔扇贝(一龄)，采自大连市旅顺养殖场。

1、扇贝闭壳肌组织基因组DNA的提取

取一块扇贝闭壳肌组织(约0.1g)置入1.5ml离心管内，用小剪刀将其剪碎，加入500μl组织DNA提取液，再加入蛋白酶K至终浓度20μg/ml，55℃水浴消化2-3小时。苯酚、苯酚:氯仿(1:1)和氯仿各抽提一次，每次12000r/min离心10min，最后将上清移到另一个离心管中。加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，可见有絮状物析出为DNA。用体积分数70％的乙醇溶液洗涤两次，凉干后，加入TE缓冲溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度20μg/ml，37℃温育1h，至4℃冰箱保存备用。将提取的基因组DNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度。

所述组织DNA提取液由100mmol/LEDTA(pH8.0)、2％十二烷基肌氨酸钠和10mmol/LTris-Cl(pH8.0)组成。

2、引物序列与PCR扩增

(1)MSTN基因引物设计

根据GenBank上栉孔扇贝MSTN(DQ_988329)基因的序列，在其DNA序列上共设计了7对引物。采用引物设计软件Primer5.0设计引物。引物设计的标准是：引物长度为(20±2)bp，GC含量在50％～75％之间，Tm值为51℃，引物内不出现发夹结构。引物委托上海生工公司合成。其引物序列、PCR产物大小及退火温度见表3-1。

表3-1如MSTN基因引物DNA序列信息

(2)PCR反应体系

反应总体积为25μL，具体如下：

10×buffer	2.5μl
		dNTPs	0.5μl
Mg²⁺	1.5μl
		引物	0.7μl
TaqDNAase	0.3μl
		模板DNA	50ng
超纯水	补至25μl

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环，再72℃延伸7min，4℃保存。得到的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶下电泳。

(3)聚丙烯胶电泳

10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的配制

配制10％非变性聚丙烯酰胺凝胶30ml，其成分如下：

药品与试剂	浓度10％
		30％丙烯酰胺溶液(29:1)	10ml
5×TBE	6ml
		双蒸水	14ml
10％过硫酸胺溶液	200μl
		TEMED	15μl
总体积	30ml

制胶步骤：

①玻璃板的清洗：用试管刷沾上洗涤剂把玻璃板擦洗干净后，用清水冲洗干净，晾干备用。

②凝胶的灌制：玻璃板清洗干净后，用胶条将两块板子底部封住，然后用夹子固定好。将配制好的胶液沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的空隙中，然后立即插入梳子。如果出现气泡，可以轻轻敲玻璃板，使气泡溢出。一般聚合30min便可聚合完全。如室温较底时，聚合时间相应延长。

③凝胶预电泳：划开玻璃板下端胶带，固定在电泳槽上，电泳槽上端加满1×TBE。用注射器冲洗点样孔，110V恒电压，预电泳10min，同时准备点样。

PCR产物的上样电泳：取2％琼脂糖凝胶电泳检测过的PCR产物1μl，再加入5μl溴酚蓝载样缓冲液(98％甲酰胺，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯FF，10mmol/LEDTA(pH8.0)，2％甘油)，混匀。于94℃变性10分钟后，迅速放在冰上，冰浴5分钟，以保持变性状态。加入已预电泳的加样孔中，电泳缓冲液为1×TBE，用垂直板电泳槽电泳(同预电泳)。电泳约12至14小时。

银染：银染按照许绍斌[100]的方法并略作改进，具体步骤如下：

1)凝胶的固定：电泳结束后，关闭电泳仪，拿出玻璃板并用小刀小心撬开，移走上层玻璃板，轻轻用药匙柄把胶剥开一角，放入加有固定液的瓷盘中(固定液为10％乙醇溶液，每板用量为200ml)在摇床上缓缓摇动10min；

2)洗胶：倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗2次，共计1min；

3)凝胶的染色：倒掉瓷盘中的水，加入染色液(0.1％AgNO3溶液，每板200ml),在摇床上缓缓摇动染色15min；

4)洗胶：倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗3次，共计1min；

5)显色：加入显色液(2gNaOH，0.1gNa₂CO₃，加双蒸水到250ml，在加入800μl甲醛)，振荡显色，一般5～15min内，带型显现；

6)终止：待带型清晰时，将胶用清水冲洗干净，放置在扫描仪上扫描。

PCR产物测序：

对SSCP分析后不同基因型的个体，各取3个个体的PCR扩增产物，将PCR扩增产物送交上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定。测定的基因序列采用DNAMAN软件进行序列分析，之后根据SSCP得到的SNPs划分基因型。将GenBank上的栉孔扇贝MSTN基因序列定为野生型基因型，突变个体的基因型为突变型基因型。

(4)群体等位基因频率、群体杂合度及多态信息含量计算

将所得数据建立一个数据矩阵，运用Popgene1.32软件分析计算平均等位基因数(Na)、平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)以及平均期望杂合度(He)[Nei]，并计算多态信息含量(PIC)。各公式如下：

平均等位基因数：

N a = (1 / n) \underset{i = 1}{Σ} x_{i}^{2}

平均有效等位基因数：

平均观测杂合度：Ho＝杂合子个体观测数/观察个体总数

平均期望杂合度：

多态信息含量：

P I C = 1 - Σ_{i = 1}^{n} q_{i}^{2} - Σ_{i = 1}^{n - 1} Σ_{j = i + 1}^{n} 2 q_{i}^{2} q_{j}^{2}

式中：为第i个位点的等位基因数，n为某基因座所具有的等位基因数，q_i为某群体第i个等位基因的基因频率。其中：i，j为某个基因座的第i，j个等位基因，q_i，q_j为其等位基因频率，n为等位基因数。

实验结果如下：

(1)栉孔扇贝的基因组DNA1％琼脂糖凝胶电泳图谱

由图1可以看出栉孔扇贝基因组DNA条带清晰，整齐，完整，不拖尾，说明提取的基因DNA分子较完整，没有降解，没有RNA条带，纯度符合SSCP要求。

(2)PCR-SSCP结果

本发明设计了7对引物，对栉孔扇贝的MSTN基因的外显子序列进行了PCR扩增。通过对相应的7对引物的PCR产物进行SSCP分析，发现有2对引物的PCR产物存在多态。这2对引物分别是M-5和M-7，其PCR-SSCP结果见图2和3，其他5对引物没有发现多态性。

对引物M-5的PCR产物进行SSCP，发现存在多态性(图2)，AA与GenBank中的序列一致，为野生型基因型，BB为突变型基因型，AB为杂合基因型。引物M-7的PCR-SSCP结果见图3，CC基因型与GenBank中的序列一致，为野生型基因型，DD为突变基因型。

(3)多态性片段的克隆和测序结果

对上述存在SNP的2对引物每一种基因型个体的PCR产物至少进行3次测序，然后将栉孔扇贝个体中测得的含突变位点的序列与GenBank的MSTN基因已知序列(登录号:DQ_988329)进行同源性比较，发现共存在2个点突变。规定MSTN基因编码区的第1个碱基为+1，沿编码区方向顺流而下均用正值表示。这2个点突变分别是：引物M-5扩增的PCR产物中存在多态，即7528bp位发生了A→G的转换突变，导致此处蛋白质的氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸。引物M-7扩增的PCR产物中存在多态，分别是9397bp位发生了T→C，导致此处蛋白质的氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸。不同基因型的部分比对结果和部分测序峰图见图4和图5。不同基因型的序列比对结果如表1所示。

表1不同基因型的序列比对结果

(4)MSTN基因的不同基因型与栉孔扇贝各生长性状的最小二乘分析

本发明采用最小二乘分析方法对MSTN基因外显子编码区上的2个多态的不同基因型与栉孔扇贝各生长性状进行了统计分析。

扇贝个体的MSTN引物M-5的不同基因型与栉孔扇贝各生长性状的最小二乘分析结果见表2。BB基因型个体的总重、闭壳肌重和软体重显著高于AA和AB基因型个体的总重、闭壳肌重和软体重(P<0.05)，并且标准误较大。BB基因型个体的壳长和壳高显著高于AA和AB基因型个体的壳长和壳高(P<0.05)。而在壳宽性状上，3种基因型个体间的差异不显著(P>0.05)。

表2基因引物M-5的SSCP多态性与栉孔扇贝各生长性状最小二乘分析(x±SD)

a)字母相同示性状均数差异不显著(P>0.05),字母相异示性状均数差异显著(P<0.05)。

Claims

1.影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记，其特征在于该SNP标记位于栉孔扇贝MSTN基因如SEQIDNO：1所示序列的7528bp处，此处碱基为G的扇贝个体的总重、闭壳肌重和软体重显著高于此处为A的扇贝肌肉。

2.用于检测权利要求1所述的影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记的引物，其特征在于包括正向引物F5’-CCAACCAAACGAGAAATCGG-3’和反向引物R5’-ACGTATCCGTCATTTACCCC-3’。

3.权利要求1所述影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质肥硕的扇贝优势品种中的应用，其特征在于该包括以下步骤：

一、提取栉孔扇贝闭壳肌组织基因组DNA；

二、以栉孔扇贝闭壳肌组织基因组DNA为模板，以引物F和R，PCR反应扩增出栉孔扇贝MSTN基因片段；所述引物F为5’-CCAACCAAACGAGAAATCGG-3’，引物R为5’-ACGTATCCGTCATTTACCCC-3’。

4.根据权利要求3所述的影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质肥硕的扇贝优势品种中的应用，其特征在于步骤二中PCR反应体系总体积为25μL，具体如下：

。

5.根据权利要求4所述的影响栉孔扇贝肌肉生长的主效SNP标记在鉴定肉质肥硕的扇贝优势品种中的应用，其特征在于步骤二中PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环，再72℃延伸7min，4℃保存。