CN111171124A - 一种植物抗逆性相关蛋白VvIAA18及编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白VvIAA18及编码基因与应用。本发明提供一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列SEQ ID NO 2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将所述蛋白的编码基因导入植物细胞，可以得到抗逆性增强的转基因植株。本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种植物抗逆性相关蛋白VvIAA18及编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物抗逆性相关蛋白VvIAA18及编码基因与应用。
背景技术
世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有8亿 hm2盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33%的次生盐渍化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐溃化土地，另外还有2000万 hm2盐碱荒地。一般来说，盐浓度在0.2%-0.5%会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6%-10%。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。随着世界人口的剧增及可耕地面积的逐年下降，粮食生产安全受到了严重威胁，对于人均耕地面积相对较小的中国更是日益严重的问题。通过对植物耐盐机理的深入研究，培育耐盐作物新品种是利用盐碱地资源最经济、有效的措施之一。
植物的耐盐机理相当复杂，它涉及到生长发育、形态结构、生理特征以及代谢调节等诸多方面。当植物受到盐胁迫时，植物的形态、生理生化等方面都会发生一系列的变化，才能维持其生存。盐害抑制植物组织、器官的生长和分化，影响植物细胞膜结构，使细胞膜透性增大，降低光合速率，导致大量电解质和非电解质外渗，膜脂组分发生改变，膜蛋白的组分和活性受到影响，进而影响植物的生理代谢。因此植物在长期的进化及适应过程中，逐步形成了一系列抵御外界不良环境变化的机制。
植物在长期的进化及适应过程中，逐步形成了一系列抵御外界不良环境变化的机制。例如，渗透物质的合成，脯氨酸、糖醇、甜菜碱等被认为是增强植物对逆境胁迫抗性的主要机制；保护酶和抗氧化物质的积累以清除逆境胁迫增加的活性氧的伤害；光合作用的调节；离子的选择性吸收/排斥、离子区隔化；激素调控；与胁迫相关的转录因子以及胁迫诱导蛋白表达等。生长素（IAA）在植物的生长发育过程中有重要作用，可以调控下游基因表达。Aux/IAA和ARF是两类重要的生长素响应转录因子，在植物发育、激素和胁迫响应过程中具有重要作用。
植物在盐胁迫条件下，会采用一定的策略去阻止或减轻盐的危害，在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的耐盐机制。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐相关基因成为可能。加强植物耐盐生理的研究，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，利用基因工程技术提高植物耐盐性，培育具有抵抗不良环境性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供蛋白OsC3HC4及编码基因在提高植物抗逆性中的应用，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明所提供的蛋白，名称为VvIAA18，来源于葡萄（Vitis vinifera），如下的（a）或（b）蛋白质：
（a）由序列表中序列SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由（a）衍生的蛋白质。
所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因为如下（1）-（3）中任一所述的基因：
（1）序列表中序列SEQ ID NO 1中1191个碱基核苷酸所示的DNA分子；
（2）在严格条件下与（1）所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
（3）与（1）或（2）的基因至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子。
以上（2）中所述严格条件可为用6×SSC，0.5% SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。
序列表中的序列SEQ ID NO 1由1191个碱基组成，编码氨基酸序列是序列表中序列SEQ ID NO 2所示的蛋白。
含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；
所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：
（1）将pCAMBIA1301载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收载体大片段；
（2）将pBI121载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的片段；
（3）将步骤（1）中回收的载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。
所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。
扩增所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对为如下所示：
VvIAA18-GC-F：5’-ATGGAGGGGTGTTCAAGGAAG-3’
VvIAA18-GC-R：5’-TCATTTCAATGCAGAGTCAAGTGG-3’
上述蛋白、上述基因或上述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。
所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为烟草；所述单子叶植物为水稻。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，将编码上述蛋白VvIAA18的编码基因导入目的植物，获得转基因植物。
优选地，所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。
优选地，所述植物组织为叶片。
进一步地，所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提供的VvIAA18基因所编码的蛋白可以提高植物的抗逆性，从实验结果来看，转基因植株鲜重比野生型植株提高很多，存活率也提高很多，转基因植物的抗逆性也大大提高；同时本技术方案是将葡萄的优势蛋白基因编码到烟草和水稻中，这种植物之间优势基因交叉编码对提高产量的意义很大，使得植物品种之间的优势基因得到更好的利用，为植物品种之间的优势基因的交互起到很好的指导作用；因此该VvIAA18蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性上以及对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，为提高植物抗逆性的研究提供重要的依据，对提高农作物产量具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1 本发明VvIAA18基因植物表达载体简图。
图2 本发明VvIAA18基因转基因烟草植株的PCR检测结果图。
图3 本发明VvIAA18基因在过表达烟草株系和野生型烟草植株中的表达。
图4 本发明VvIAA18基因转基因水稻植株的PCR检测结果图。
图5 本发明VvIAA18基因在过表达水稻株系和野生型水稻植株中的表达。
图6 本发明VvIAA18基因转基因烟草植株在200 mM NaCl的MS培养基上的生长和生根情况，WT为野生型烟草植株，L2、L4和L5为转基因烟草植株。
图7 本发明VvIAA18基因转基因烟草植株的耐盐性盆栽鉴定，WT为野生型烟草植株，L2、L4和L5为转基因烟草植株。
图8 本发明VvIAA18基因转基因水稻植株的耐盐性盆栽鉴定，NT为野生型水稻植株，OE2、OE5和OE6为转基因水稻植株。
图9 本发明VvIAA18基因转基因烟草植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型烟草植株，L2、L4和L5为转基因烟草植株。
图10 本发明VvIAA18基因转基因水稻植株抗逆生理生化指标测定，NT为野生型水稻植株，OE2、OE5和OE6为转基因水稻植株。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
葡萄（Vitis vinifera）品种PN40024，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
烟草（Nicotiana tabacum）品种Wisconsin 38，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
水稻（Oryza sativa）品种中花11号，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989】。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J, Frets EF,Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989】。
1/2霍格兰营养液记载于如下文献中【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong,Lifeng Fu, Rihe Peng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoidsaccumulation and abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】。
实施例1 葡萄抗逆性相关的蛋白及其编码基因的获得
1. 实验材料
将葡萄品种PN40024无菌苗展开叶叶片取下，液氮速冻，-80℃保存。
叶片总RNA提取和纯化
取PN40024无菌苗展开叶叶片约2.0 g，在液氮中研磨成粉状，加入10 mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒（Applygen Technologies Inc，Beijing）提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit （QIAGEN，GmbH，Germany）从总RNA中纯化mRNA。最后，取1 μL于1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2 μL稀释至500 μL，用紫外分光光度计检测其质量（OD260）和纯度（OD260/OD280），提取的PN40024无菌苗叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于葡萄VvIAA18蛋白cDNA全长的克隆。
蛋白cDNA的全长克隆
以VvIAA18基因cDNA序列设计引物进行VvIAA18蛋白cDNA的全长克隆。
引物序列如下：
VvIAA18-GC-F：5’-ATGGAGGGGTGTTCAAGGAAG-3’
VvIAA18-GC-R：5’-TCATTTCAATGCAGAGTCAAGTGG-3’
以PN40024无菌苗叶片总RNA经Oligo（dT）反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃ 1 min，随后95℃ 20 s，53℃ 20 s和72℃ 1 min，进行36个循环，最后72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1191 bp长度的扩增片段。
综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO 1所示。序列表中序列SEQ ID NO 1由1191个碱基组成，自5’端第1位-第1191位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO 2由396个氨基酸残基组成。将该基因命名为VvIAA18，将其编码的蛋白命名为VvIAA18。
实施例2 VvIAA18基因过表达载体的构建
将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO 1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4 DNA连接酶将回收的VvIAA18基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有普通VvIAA18基因的重组质粒AH128。该表达载体还包含gusA 报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。
实施例3 VvIAA18基因转化烟草
将实施例2构建的葡萄VvIAA18基因的植物表达载体pCAMBIA1301-VvIAA18用根癌农杆菌介导法转化烟草，具体方法如下：
1. 农杆菌的准备
（1）将pCAMBIA1301-VvIAA18用电击法转化根癌农杆菌LBA4404菌株（Biovector Co.,LTD），得到含有pCAMBIA1301-VvIAA18的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。
（2）挑取农杆菌单菌接种于5 mL LB液体培养基（利福平50 μg/mL，氯霉素100 μg/mL）中，28 ℃，250 rpm培养20 h。
（3）取1 mL菌液转接入20-30 mL LB液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100 μg/mL）中，28 ℃，250 rpm培养约12 h，测OD 600 ≈ 1.5。
（4）8000 rpm，4 ℃，10 min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5%蔗糖，0.05% Silwet L-77）并稀释至OD 600 ≈ 0.8。
农杆菌转化烟草
（1）取经过继代培养4-6 w的烟草无菌苗叶片，在超净台中，切下5×5 mm的烟草叶盘（去掉主叶脉），切5×5 mm的烟草叶盘，不含主脉。
（2）放置在再生培养基上预培养2 d，背面贴培养基（黑暗，28℃）。
（3）悬浮于上述步骤制备好的农杆菌菌液中，10 min后将菌液吸出，将侵染过的烟草叶盘接种培养在固体培养基（1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS）上。28℃、黑暗，共培养3 d。
（4）将共培养3 d后的烟草叶盘用含有500 mg/L Carb、1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/LNAA的MS液体培养基洗涤2次后，将烟草叶盘转至含有1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、25mg/L潮霉的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1℃、每日13 h、3000 lx的光照。
（5）培养2-4 w后，将不定芽转移至含有1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、25 mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上进行不定根诱导，培养条件为27±1℃、每日13 h、3000 Lux的光照。4-8 w后，形成完整的再生植株，即分别得到转化VvIAA18基因的烟草拟转基因植株和转空载体对照烟草植株。设未转化的烟草品种Wisconsin 38为野生型对照烟草植株。
实施例4 VvIAA18基因转化水稻
将实施例2构建的水稻VvIAA18基因的植物表达载体pCAMBIA1301-VvIAA18转化水稻，具体方法如下：
1. 农杆菌的准备
（1）将pCAMBIA1301-VvIAA18用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株（Biovector Co.,LTD），得到含有pCAMBIA1301-VvIAA18的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。
（2）挑取农杆菌单菌接种于5 mL LB 液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100 μg/mL）中，28 ℃，250 rpm培养20 h。
（3）取1 mL菌液转接入20-30 mL LB液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100 μg/mL）中，28 ℃，250 rpm培养约12 h，测OD 600 ≈ 1.5。
（4）8000 rpm，4 ℃，10 min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5% 蔗糖，0.05% Silwet L-77）并稀释至OD 600 ≈ 0.8。
水稻成熟胚愈伤的获取
（1）将成熟的水稻品种中花11号种子去掉颖壳，用70%酒精消毒1-2 min；
（2）然后用20%的次氯酸钠浸泡30-40 min，用无菌蒸馏水冲洗4遍，将种子转移到灭过菌的滤纸上吸干表面水分，然后接种在NB诱导培养基上；
（3）暗培养7-10 d后，当盾片膨大，胚乳变软时，去掉胚和芽，把剥下的胚性愈伤转移到NB继代培养基上，大约3 w继代一次，继代2-3次后就可以作为受体进行转化。
农秆菌介导转化水稻愈伤组织
（1）选取良好的胚性愈伤组织放于上述侵染液中，浸泡30 min；
（2）将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后置于NB共培养培养基上培养至刚有菌落出现（大约2-3 d）；
（3）用无菌水振荡清洗3-4 次，直至上清液完全清洁为止，用500 mg/L头孢霉素溶液振荡清洗40 min；
（4）取出愈伤组织，放入只带滤纸的无菌培养皿中0.4 m/s风干4 h，转入NB筛选培养基筛选两轮（每轮3-4 w）；
（5）将抗性愈伤进行预分化2-3 w，然后转移到分化培养基中光照培养2-3 w；
（6）待幼芽长至约1 cm时转入壮苗培养基培养30 d左右；
（7）揭去封口膜炼苗培养1 w左右，然后移栽到土中。
实施例5 VvIAA18基因转基因烟草植株分子检测
1. 转基因烟草植株PCR检测
（1）试验方法
用CTAB 法提取转基因烟草植株和野生型植株（WT）的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的hpt II基因引物为：Primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA -3’和Primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2 mL Eppendorf 离心管中加入10×PCRbuffer 2 μL、4dNTP（10 mol/L）1 μL、引物（10 μmol/L）均为1 μL、模板DNA（50 ng/uL） 2 μL、 Taq DNA聚合酶 0.25 μL，加ddH2O至总体积20 μL。反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环。
（2）试验结果
电泳检测扩增结果见图2（图2中，泳道M为Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照（重组质粒pCAMBIA1301-VvIAA18）；泳道WT：野生型烟草植株；泳道L1、L2、L3、L4、L5和L6：为转化pCAMBIA1301-VvIAA18的烟草转基因植株）。从图中可见，转化pCAMBIA1301-VvIAA18的烟草拟转基因植株和阳性对照扩增出591 bp的目标条带，表明VvIAA18基因已经整合到烟草的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型烟草植株没有扩增出591 bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。
转基因烟草植株qRT-PCR检测
（1）试验方法
提取阳性转VvIAA18烟草株系RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR分析，以未转化的烟草野生型为对照。NtActin基因为内参：NtActin-F：5’-CACTGGTGTTATGGTTGGTATG-3’和NtActin-R：5’-TCGTCCCAGTTGCTTACTATTC-3’；VvIAA18引物序列为：VvIAA18-F：5’-CGAGTCCCAAGATGTGGTCC-3’和VvIAA18-R：5’-GCGTATATTCGCCACTCCCA-3’。
（2）试验结果
结果如图3所示，WT为野生型烟草植株，L1、L2、L3、L4、L5和L6均为阳性转VvIAA18烟草植株，表明VvIAA18在转基因烟草植株中有不同程度的表达。
实施例6 VvIAA18基因转基因水稻植株分子检测
1. 转基因水稻植株PCR检测
（1）试验方法
用CTAB 法提取T2水稻转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR 检测，所使用的hpt II基因引物为：Primer 1：5’- ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA -3’和Primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2 mL Eppendorf 离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP（10 mol/L）1 μL、引物（10 μmol/L）均为1 μL、模板DNA（50 ng/uL） 2 μL、 TaqDNA聚合酶 0.25 μL，加ddH2O至总体积20 μL。反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30s，55℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环。
（2）试验结果
电泳检测扩增结果见图4【图4中，泳道M：Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照（重组质粒pCAMBIA1301-VvIAA18）；泳道NT：野生型水稻植株；泳道OE1-OE8：为转化pCAMBIA1301-VvIAA18的水稻转基因植株】。从图中可见，转化pCAMBIA1301-VvIAA18的水稻拟转基因植株和阳性对照扩增出591 bp的目标条带，表明VvIAA18基因已经整合到水稻的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型水稻植株没有扩增出591 bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。
转基因水稻植株qRT-PCR检测
（1）试验方法
提取阳性转VvIAA18水稻株系RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR分析，以未转化的烟草野生型为对照。OsActin基因为内参：OsActin-F：5’-TTATGGTTGGGATGGGACA-3’和OsActin-R：5’-AGCACGGCTTGAATAGCG-3’；VvIAA18引物序列为：VvIAA18-F：5’-CGAGTCCCAAGATGTGGTCC-3’和VvIAA18-R：5’-GCGTATATTCGCCACTCCCA-3’。
（2）试验结果
结果如图5所示，WT为野生型烟草植株，OE1-OE8均为阳性转VvIAA18水稻植株，表明VvIAA18在转基因水稻植株中有不同程度的表达。
实施例7 VvIAA18基因转基因烟草植株抗逆性鉴定
1. 转基因烟草植株抗逆性离体鉴定
（1）试验方法
将目的基因表达量较高的3个烟草转基因株系和非转基因对照植株在含有200 mMNaCl的1/2 MS培养基上进行培养，4 w后观察烟草植株的生长状态和生根情况，照相并测定烟草植株鲜重。
（2）试验结果
结果显示，转基因烟草植株的生长状态和生根情况显著优于野生型植株，转基因植株鲜重比野生型植株相比提高了205～248%（图6），表明转基因植株的抗逆性较野生性有显著提高。
转基因烟草植株抗逆性盆栽鉴定
（1）试验方法
将转基因烟草和野生型烟草植株移栽到盆中培养2周后，进行盐胁迫处理。用含有200mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2天灌溉1次，每次200 mL，处理4 w，观察植株生长情况，进行照相并测定其鲜重和干重。
（2）试验结果
结果显示，通过耐盐性盆栽鉴定，结果见图7，盐处理4 w，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的鲜重和干重分别比野生型植株提高了237～398%和35～72%。表明过表达VvIAA18基因显著提高转基因烟草植株的抗逆性。
实施例8 VvIAA18基因转基因水稻植株抗逆性鉴定
1. 转基因水稻植株抗逆性盆栽鉴定
（1）试验方法
为了验证转基因水稻材料的耐盐性，将纯合的T2转基因水稻和野生型水稻种子表面消毒，用纯净水催芽，接种在MS培养基上，生长大约3-4 d。挑选长势一致的幼苗，种植在以营养土：蛭石=1:2的营养土中，注意每天浇水，等到植株长到4 w后开始进行盐胁迫处理。用含有200 mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2 d灌溉1次，每次200 mL，处理4 w，观察其表型，进行照相并调查其存活率。以下涉及存活率提高的计算方式是：（转基因植株存活率-野生型植株存活率）*100%/野生型植株存活率。
（2）试验结果
结果显示，在盐胁迫处理条件4 w后，结果见图8，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生性植株，较野生性植株相比提高了797～877%。表明过表达VvIAA18基因显著提高转基因水稻植株的抗逆性。
实施例9 VvIAA18基因转基因烟草和水稻植株抗逆生理生化指标的测定
1. 脯氨酸含量测定
（1）试验方法
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草和水稻植株的脯氨酸含量。烟草植株为空白对照处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株；水稻植株为空白对照中处理2 w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
烟草植株脯氨酸含量测定实验结果见图9中A（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因烟草L2植株、L4植株和L5植株的脯氨酸含量显著高于野生型烟草植株。
水稻植株脯氨酸含量测定实验结果见图10中A（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE5植株和OE6植株的脯氨酸含量显著高于野生型水稻植株。
22含量测定
（1）试验方法
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草和水稻植株的H2O2含量。烟草植株为空白对照处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株；水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
烟草植株H2O2含量测定实验结果见图9中B（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因烟草L2植株、L4植株和L5植株的H2O2含量显著低于野生型烟草植株。
水稻植株H2O2含量测定实验结果见图10中B（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE5植株和OE6植株的H2O2含量显著低于野生型水稻植株。
含量测定
（1）试验方法
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草和水稻植株的MDA含量。烟草植株为空白对照处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株；水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
烟草植株MDA含量测定实验结果见图9中C（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因烟草L2植株、L4植株和L5植株的MDA含量显著低于野生型烟草植株。
水稻植株MDA含量测定实验结果见图10中C（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE5植株和OE6植株的MDA含量显著低于野生型水稻植株。
活性测定
（1）试验方法
超氧化物歧化酶（SOD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草和水稻植株的SOD活性。烟草植株为空白对照处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株；水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
烟草植株SOD活性测定实验结果见图9中D（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因烟草L2植株、L4植株和L5植株的SOD活性显著高于野生型烟草植株。
水稻植株SOD活性测定实验结果见图10中D（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE5植株和OE6植株的SOD活性显著高于野生型水稻植株。
活性测定
（1）试验方法
过氧化物酶（POD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草和水稻植株的POD活性。烟草植株为空白对照处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株；水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
烟草植株POD活性测定实验结果见图9中E（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因烟草L2植株、L4植株和L5植株的POD活性显著高于野生型烟草植株。
水稻植株POD活性测定实验结果见图10中E（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE5植株和OE6植株的POD活性显著高于野生型水稻植株。
生理生化指标的测定结果表明，过表达VvIAA18基因显著提高转基因烟草和水稻植株的抗逆性。
附：本发明所涉及到的核苷酸序列表：
<110> 淮阴工学院
<120> 蛋白VvIAA18、编码基因及其在提高植物抗逆性中的应用
<160> 1
<210> SEQ ID NO 1
<211> 1191
<212> DNA
<213> 葡萄（Vitis vinifera）
<400> 1
atggaggggt gttcaaggaa ggatgaggta tgtccacagc tgctagattt gatctccaaa 60
gacagagaat gggttctgaa gagtggtgaa gggagaagcc atggctctcc agaggagaaa 120
aagcttgagc tgaggcttgg tcctccaggt gaggactgga ccatcaaaga taacaccaac 180
aataataact acagagaaag ggacgaatcc cttcggtatc tcaggtactt atcttccatg 240
gcctccatga cccacaactg cagcaacaac aacaacaaca gtaatatcat caacaatacc 300
accacttctt gtggaaagag aggtttccta gagacagttg agaggaacac aggagaggaa 360
ggttggatca tgaatagcaa tggaaaccaa aaccagaaac aagctgctaa taataccaat 420
aataatggtg tgttgccctc tccctggtct tcttcaggtt accaggttaa gacccaacag 480
cagcaacagc agacaaaagc ttcatttctt cagttccaat caagccctcc tgttattaca 540
aaggaatcct cacagccctg ttgcactaaa gtagtagact tgcagaatac agaaaagaag 600
gcattttcac cagcttctgc aaatacagct gtgcccaaca gctctcagaa aagatctgcg 660
cctactgcag ttgtggggtg gcctccaatt cgatcattta ggaagaatct tgcaagtagt 720
agctcttcga aaccggctaa cgagtcccaa gatgtggtcc caaacaagat tgcgagtgaa 780
aaaccggtcg aagttggcaa aaagggtctt tttgtgaaga tcaatatgga tggagttcca 840
attgggagga aggtggacct tacagcatat gacagctatg aaaaactttc atctgctgtt 900
gatgagctat tcaggggcct tctagcagct caaagagatt cctctgctgg tggaatccag 960
accaagcatg aggaagagaa aactattact ggtttgctcg atgggagtgg cgaatatacg 1020
cttgtttacg aggataacga aggagacaga gtccttgttg gggatgtccc atggcacatg 1080
ttcgtgaaca cggtgaagag gttgcgcgtg ttgaagagct ctgaactttc tgctctatgc 1140
cttggtagca gcaagcaaga aaaggcacca cttgactctg cattgaaatg a 1191
<210> SEQ ID NO 2
<211> 396
<212> PRT
<213> 葡萄（Vitis vinifera）
<400> 1
Met Glu Gly Cys Ser Arg Lys Asp Glu Val Cys Pro Gln Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Ser Lys Asp Arg Glu Trp Val Leu Lys Ser Gly Glu Gly Arg
20 25 30
Ser His Gly Ser Pro Glu Glu Lys Lys Leu Glu Leu Arg Leu Gly Pro
35 40 45
Pro Gly Glu Asp Trp Thr Ile Lys Asp Asn Thr Asn Asn Asn Asn Tyr
50 55 60
Arg Glu Arg Asp Glu Ser Leu Arg Tyr Leu Arg Tyr Leu Ser Ser Met
65 70 75 80
Ala Ser Met Thr His Asn Cys Ser Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Ile
85 90 95
Ile Asn Asn Thr Thr Thr Ser Cys Gly Lys Arg Gly Phe Leu Glu Thr
100 105 110
Val Glu Arg Asn Thr Gly Glu Glu Gly Trp Ile Met Asn Ser Asn Gly
115 120 125
Asn Gln Asn Gln Lys Gln Ala Ala Asn Asn Thr Asn Asn Asn Gly Val
130 135 140
Leu Pro Ser Pro Trp Ser Ser Ser Gly Tyr Gln Val Lys Thr Gln Gln
145 150 155 160
Gln Gln Gln Gln Thr Lys Ala Ser Phe Leu Gln Phe Gln Ser Ser Pro
165 170 175
Pro Val Ile Thr Lys Glu Ser Ser Gln Pro Cys Cys Thr Lys Val Val
180 185 190
Asp Leu Gln Asn Thr Glu Lys Lys Ala Phe Ser Pro Ala Ser Ala Asn
195 200 205
Thr Ala Val Pro Asn Ser Ser Gln Lys Arg Ser Ala Pro Thr Ala Val
210 215 220
Val Gly Trp Pro Pro Ile Arg Ser Phe Arg Lys Asn Leu Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ser Lys Pro Ala Asn Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Asn Lys
245 250 255
Ile Ala Ser Glu Lys Pro Val Glu Val Gly Lys Lys Gly Leu Phe Val
260 265 270
Lys Ile Asn Met Asp Gly Val Pro Ile Gly Arg Lys Val Asp Leu Thr
275 280 285
Ala Tyr Asp Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ser Ala Val Asp Glu Leu Phe
290 295 300
Arg Gly Leu Leu Ala Ala Gln Arg Asp Ser Ser Ala Gly Gly Ile Gln
305 310 315 320
Thr Lys His Glu Glu Glu Lys Thr Ile Thr Gly Leu Leu Asp Gly Ser
325 330 335
Gly Glu Tyr Thr Leu Val Tyr Glu Asp Asn Glu Gly Asp Arg Val Leu
340 345 350
Val Gly Asp Val Pro Trp His Met Phe Val Asn Thr Val Lys Arg Leu
355 360 365
Arg Val Leu Lys Ser Ser Glu Leu Ser Ala Leu Cys Leu Gly Ser Ser
370 375 380
Lys Gln Glu Lys Ala Pro Leu Asp Ser Ala Leu Lys
385 390 395
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种蛋白VvIAA18，其特征在于，是如下（a）或（b）蛋白质：
（a）由序列表中序列SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由SEQ ID NO 2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）-（3）中任一所述的基因：
（1）.序列表中序列SEQ ID NO 1中1191个碱基核苷酸所示的DNA分子；
（2）.与（1）限定的DNA序列杂交且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子；
（3）.与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%以上同源性且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求1所述蛋白质的编码基因插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组表述载体。
6. 扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对，所述引物对为如下所示：
VvIAA18-GC-F：5’-ATGGAGGGGTGTTCAAGGAAG-3’
VvIAA18-GC-R：5’-TCATTTCAATGCAGAGTCAAGTGG-3’。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物抗逆性中的应用；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.一种培育转基因植物的方法，包括如下（a1）和（a2）的步骤：
（a1）向目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
（a2）从步骤（a1）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗逆性提高的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤（a1）中，所述编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入所述目的植物的。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
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Denomination of invention: A Plant Stress Resistance Related Protein VvIAA18 and Its Coding Gene and Application

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TR01 Transfer of patent right

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Patentee after: Dongdai (Jinan) Intelligent Technology Co.,Ltd.

Address before: 223005 No.1, Meicheng East Road, Huaian Economic Development Zone, Jiangsu Province

Patentee before: HUAIYIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY