CN112266925A - 一种亚细胞定位表达载体及构建方法 - Google Patents
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- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种亚细胞定位表达载体及构建方法，在TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB‑eGFP片段。用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。本发明的亚细胞定位载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株；获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种亚细胞定位表达载体及构建方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
近年来，随着植物全基因组测序的快速发展，一大批植物物种完成了参考序列的拼接、组装和注释。对基因进行解析并明确其功能已成为我们了解生命密码的必需步骤。目前植物科学研究中，功能基因研究离不开载体的构建。
目前常用的载体构建方法有Gateway系统的同源重组法、胡向阳研究组开发的TA克隆法以及pCambia系列载体。Gateway系列载体利用载体上面的attR和attL序列，通过同源重组酶，将片段插入到载体中，采用毒性蛋白ccdB和相应的抗生素进行筛选；胡向阳团队开发的TA克隆系列载体，利用非高保真酶扩增得到的PCR产物末端含有突出的碱基A的特点，利用限制性内切酶XcmI切割载体，产生突出的碱基T，然后利用碱基A∷T配对的方式将目的片段插入到载体中。
上述两种方法都极好的利用了毒性蛋白ccdB，以及相应抗生素筛选的方法，所产生的片段均为零背景的目的克隆。但目前同源重组酶的价格相对较高，TA克隆则存在连接效率较低的情况。pCambia系列载体采用的是限制性内切酶连接的方式将目的基因插入到载体中，连接效率高，该方法目前实验中采用的较多。但该系列的载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。
综上所述，现有技术存在的问题是：
（1）目前同源重组酶的价格相对较高，TA克隆则存在连接效率较低的情况。
（2）pCambia系列载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。
解决上述技术问题的意义：
本发明将ccdB毒性蛋白与限制性内切酶位点进行聚合，构建出既含有多个限制性内切酶位点，又含有ccdB毒性蛋白筛选的亚细胞定位载体。该载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株。获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。
本发明加快和简化了载体构建的速度，方便基因功能的研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚细胞定位表达载体的构建方法。
本发明是这样实现的，一种亚细胞定位表达载体的构建方法，所述亚细胞定位表达载体的构建包括以下步骤：
（1）从TA载体（参考文献Wang, C., et al. (2013). A series of TA-based andzero-background vectors for plant functional genomics）中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB-eGFP片段。
（2）用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
（3）利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，可以获得P35s∷eGFP载体，该载体产生的蛋白质可以进入细胞的任意结构，用于阳性对照。
进一步，所述ccdB包含306bp的碱基，eGFP为增强型绿色荧光蛋白，其中有7个限制性内切酶位点可以使用，分别为EcoRI、SacI、SmaI、BamHI、XbaI、PstI和HindIII。
进一步，所述P35s∷eGFP载体中，目的片段与eGFP基因之间插入了15个碱基的linker。
本发明另一目的在于提供所述亚细胞定位表达载体序列为SEQ ID NO.1。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明的亚细胞定位载体既可以用于稳定表达也可以瞬时表达，研究亚细胞定位。
本发明的载体含有eGFP，其荧光信号强。
本发明的载体引入了ccdB毒性蛋白和卡那霉素两个筛选标记，几乎能避免所有的假阳性克隆
本发明的多克隆位点的限制性内切酶位点数多达7个，几乎能满足所有基因的亚细胞定位载体的使用。
本发明创造性的引入了15个碱基的linker，能有效的避免eGFP影响目的蛋白正常折叠的现象的发生，有利于目的蛋白能够正常的亚细胞定位。
附图说明
图1是本发明实施例提供的亚细胞定位表达载体的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的P35s∷ccdB-eGFP片段结构图。
图3是本发明实施例提供的阳性对照的亚细胞定位结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
目前同源重组酶的价格相对较高，TA克隆则存在连接效率较低的情况。
pCambia系列载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚细胞定位表达载体及构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的亚细胞定位表达载体的构建方法包括以下步骤：
S101：TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB-eGFP片段。
S102：用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
S103：利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，可以获得P35s∷eGFP载体，该载体产生的蛋白质可以进入细胞的任意结构，用于阳性对照。
本发明在TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB-eGFP片段（如图2所示）。其中ccdB包含306bp的碱基，eGFP为增强型绿色荧光蛋白，其中有7个限制性内切酶位点可以使用，分别为EcoRI、SacI、SmaI、BamHI、XbaI、PstI和HindIII。用上述多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
利用上述任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，可以获得P35s∷eGFP载体，该载体产生的蛋白质可以进入细胞的任意结构，用于阳性对照。采用限制性内切酶切除ccdB毒性蛋白，然后载体自连，作为阳性对照的亚细胞定位结果如图3所示。
本载体中创造性的在目的片段与eGFP基因之间插入了15个碱基的linker。相关的研究表明，eGFP与目的基因的直接连接可能会影响部分蛋白质的折叠，从而目的蛋白不能够正常的亚细胞定位。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东省农业科学院玉米研究所
<120> 一种亚细胞定位表达载体及构建方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10043
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 60
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 120
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 180
accatgatta cgaattgaac atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca 240
aagatacagt ctcagaagac cagagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg 300
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa 360
aggaagatgg cttctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagaat 420
gcctctaccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggaacat cgtggaaaaa 480
gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta 540
agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaaattca 600
tttcatttgg agaggacctc gagaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagactgca 660
gaagcttatg cagtttaagg tttacaccta taaaagagag agccgttatc gtctgtttgt 720
ggatgtacag agtgatatta ttgacacgcc cgggcgacgg atggtgatcc ccctggccag 780
tgcacgtctg ctgtcagata aagtctcccg tgaactttac ccggtggtgc atatcgggga 840
tgaaagctgg cgcatgatga ccaccgatat ggccagtgtg ccggtctccg ttatcgggga 900
agaagtggct gatctcagcc accgcgaaaa tgacatcaaa aacgccatta acctgatgtt 960
ctggggaata taagaattcg agctcggtac ccggggatcc tctagactgc agaagcttta 1020
cccaccggtc gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat 1080
cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga 1140
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 1200
cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 1260
ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 1320
ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 1380
cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 1440
caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 1500
cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 1560
cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 1620
gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 1680
gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 1740
cgagctgtac aagtaaagcg gccgcccggc tgcaacccgt gtgaattaca ggtgaccagc 1800
tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 1860
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 1920
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 1980
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 2040
gcggtgtcat ctatgttact agatcggaat taaactatca gtgtttgaca ggatatattg 2100
gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac ggatatttaa aagggcgtga 2160
aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc ccctcgggat 2220
caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg acgttcagtg 2280
cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca ggctgccgcc 2340
ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta gaatacttgc 2400
gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct gctgggctat 2460
gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac gggccgaact gcacgcggcc 2520
ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg cccggagctg 2580
gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag gctagaccgc 2640
ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc gcatccagga ggccggcgcg 2700
ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg ccgcatggtg 2760
ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga ccgcacccgg 2820
agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc taccctcacc 2880
ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac cgtgaaagag 2940
gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga gcgcagcgag 3000
gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc attgaccgag 3060
gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg aaaccgcacc 3120
aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag atgatcgcgg 3180
ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg 3240
ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg 3300
agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg 3360
ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat 3420
cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg 3480
cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc 3540
ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc 3600
gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc 3660
gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc 3720
ggtgcagcca agcccttacg acatatgggc caccgccgac ctggtggagc tggttaagca 3780
gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa 3840
aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct 3900
tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt 3960
tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat 4020
taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg 4080
ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca 4140
gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg 4200
aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg 4260
cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg 4320
aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg 4380
aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac 4440
tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa 4500
tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc 4560
ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa 4620
tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca 4680
agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata 4740
gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg 4800
aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca 4860
tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca 4920
tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg 4980
cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag 5040
aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga 5100
acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa 5160
agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg 5220
agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg 5280
atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag 5340
ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt 5400
tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg 5460
aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg 5520
aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg 5580
aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt 5640
acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac 5700
acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa 5760
aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag 5820
ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt 5880
cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc 5940
taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca 6000
ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 6060
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 6120
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 6180
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 6240
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 6300
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 6360
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 6420
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 6480
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 6540
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 6600
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 6660
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 6720
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 6780
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 6840
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 6900
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 6960
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 7020
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 7080
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcattcta 7140
ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat aatattttat tttctcccaa tcaggcttga 7200
tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat actgttcttc cccgatatcc tccctgatcg 7260
accggacgca gaaggcaatg tcataccact tgtccgccct gccgcttctc ccaagatcaa 7320
taaagccact tactttgcca tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg 7380
aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat 7440
ctttaaatgg agtgtcttct tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca 7500
gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata 7560
tgtcgatgga gtgaaagagc ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc 7620
tttgttcatc ttcatactct tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat 7680
tgctccagcc atcatgccgt tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca 7740
gccatagcat catgtccttt tcccgttcca catcataggt ggtcccttta taccggctgt 7800
ccgtcatttt taaatatagg ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag 7860
acattccttc cgtatctttt acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg 7920
atattctcat tttagccatt tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc 7980
ccaagaagct aattataaca agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct 8040
taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc 8100
gacggagccg attttgaaac cgcggtgatc acaggcagca acgctctgtc atcgttacaa 8160
tcaacatgct accctccgcg agatcatccg tgtttcaaac ccggcagctt agttgccgtt 8220
cttccgaata gcatcggtaa catgagcaaa gtctgccgcc ttacaacggc tctcccgctg 8280
acgccgtccc ggactgatgg gctgcctgta tcgagtggtg attttgtgcc gagctgccgg 8340
tcggggagct gttggctggc tggtggcagg atatattgtg gtgtaaacaa attgacgctt 8400
agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc cgaattaatt 8460
cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatag 8520
aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga 8580
aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa 8640
ctcgagtcaa atctcggtga cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc 8700
cagctgccag aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat 8760
gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc 8820
gatgacagcg accacgctct tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta 8880
gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc 8940
cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc 9000
gccgtccacc tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt 9060
ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg 9120
gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg 9180
gcgtcgttct gggctcatgg tagactcgag agagatagat ttgtagagag agactggtga 9240
tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag 9300
gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct 9360
ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat 9420
ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat 9480
ggcatttgta ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg 9540
ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc 9600
tttggtcttc tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca 9660
ccatgttatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca 9720
cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa 9780
cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg 9840
tccttttgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta 9900
ccctttgttg aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct 9960
tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttggcaag ctgctctagc caatacgcaa 10020
accgcctctc cccgcgcgtt ggc 10043
Claims (4)
1.一种亚细胞定位表达载体的构建方法，其特征在于，所述亚细胞定位表达载体的构建方法包括以下步骤：
（1）TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB-eGFP片段；
（2）用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中；
（3）利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，获得P35s∷eGFP载体，该载体产生的蛋白质进入细胞的任意结构，用于阳性对照。
2.如权利要求1所述的亚细胞定位表达载体的构建方法，其特征在于，所述ccdB包含306bp的碱基，eGFP为增强型绿色荧光蛋白，ccdB的限制性内切酶位点为7个，分别为EcoRI、SacI、SmaI、BamHI、XbaI、PstI和HindIII。
3.如权利要求1所述的亚细胞定位表达载体的构建方法，其特征在于，所述P35s∷eGFP载体中，目的片段与eGFP基因之间插入15个碱基的linker。
4.一种利用权利要求1所述亚细胞定位表达载体的构建方法构建的亚细胞定位表达载体，其特征在于，所述亚细胞定位表达载体序列为SEQ ID NO.1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011135875.4A CN112266925A (zh) | 2020-10-22 | 2020-10-22 | 一种亚细胞定位表达载体及构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110904137A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-03-24 | 西北农林科技大学 | Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用 |
-
2020
- 2020-10-22 CN CN202011135875.4A patent/CN112266925A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 范凯荣 等: "毒素蛋白CcdB在载体构建中的研究及应用", 《生物技术通讯》 * |
| 陈锡 等: "高羊茅FaGST1基因克隆、亚细胞定位及表达分析", 《南方农业学报》 * |
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