CN102154268A

CN102154268A - 一种链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN102154268A
Application number: CN 201010610631
Authority: CN
Inventors: 丁晓明; 张欣城; 鲍芸; 张渤; 张霖; 赵国屏
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2030-12-29
Also published as: CN102154268B

Abstract

本发明属于生物技术和基因工程领域，具体为一种高效的链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用。本发明基于一种来源于诺卡氏菌Norcardia asteroids YP21的转座因子IS204，构建一系列含有IS204转座系统的转座子pDZY101~pDZY107，鉴定了天蓝色链霉菌中IS204转座酶作用位点的特征，并且证明了该转座系统具有良好的遗传稳定性和转座随机性。利用pDZY101及其衍生质粒对S.coelicolor M145进行转座突变，得到了大量的表型突变株，并且在变铅青链霉菌等其它链霉菌属成员中也发现了类似的特征,这些特点使得该转座系统在研究模式链霉菌功能基因上有着良好的应用前景。

Description

一种链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种转座突变系统及其构建方法，以及其在链霉菌中的应用。

背景技术

用传统的方法如物理或化学诱变，定点突变等发现和研究链霉菌的基因

繁琐，效率低下。转座子是目前遗传突变中一种行之有效的工具，研究人员陆续发现和分离出可以用于链霉菌中的转座子，但是现有的一些转座系统普遍存在多次转座、效率不高、操作复杂并且来自异源的转座子会受到链霉菌强烈的限制修饰系统的修饰而无法作用等问题，使得链霉菌中的转座系统得不到普遍应用，筛选突变和阐明基因功能的工作进展缓慢。

本发明中应用的转座酶的名称为IS204,来源于Nocardia asteroids(一种诺

卡式菌).根据文献报道,IS204的开放读码框的长度为1134个碱基,两端各有一个23个碱基的反向重复序列(IRL,IRR).在插入的靶位点处会产生一段8bp的正向重复序列，并且IS204在诺卡氏菌中转座效率很高。

为便于研究链霉菌功能基因,避免效率低,假阳性等问题,构建高效的转座突变系统具有很高的实用价值。由于诺卡氏菌和链霉菌都属于放线菌，所以推测IS204也可以在链霉菌中发生高效转座。本着这个思路，我们利用IS204构建了一个用于链霉菌的高效微型转座系统，并对其转座机理进行了研究。

发明内容

本发明的目的是提供一套简便高效的研究链霉菌功能基因的系统，此系统克服了常规方法的上述问题，应用此系统可在短时间内筛选到足够数量的随机突变，而且用简单的方法即可得到突变位点的核苷酸信息。

本发明首先提供一对IS204的转座酶识别序列，为IRL和IRR位点，其序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。

本发明提供一个用于转座的质粒，由基于上述的转座酶识别位点序列所构建，序列如SEQ ID No. 20所示，记为pDZY101。

所述转座质粒的相应元件，包括质粒复制起始位点、抗药性基因、转座酶基因、接合转移起始位点、红霉素启动子以及转座酶识别位点IRL、IRR^-1和IRR。

构建一套研究链霉菌功能基因的转座突变系统包括下述步骤:(1)抽提Nocardia asteroids的基因组DNA,然后以该基因组DNA作为模板,用引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6 从Nocardia asteroids的基因组中PCR扩增出长度为1354bp的转座酶片段,然后将该片段插入到pMD19-T中,并在该基因片段上游插入红霉素启动子。在转座酶下游的一段包含有大肠杆菌复制子和硫酸安普霉素的片段两旁分别插入IRL和IRR,使IRL和IRR的序列方向呈反向重复。构建完成后的质粒称为pDZY101 ,将该质粒转化大肠杆菌ET12567, 挑单菌落与天蓝色链霉菌M145进行接合转移, 抗性筛选。结果显示,转座效率稳定地达到10^-5 ,挑菌落扩大培养后抽提基因组,用合适的限制性内切酶酶切后,热失活,用T₄DNA连接酶进行片段自连,然后转化大肠杆菌,抗性筛选。挑单菌落提质粒后用引物SEQ ID No. 7测序,结果表明,由于在pDZY101中转座酶尾部18bp的序列恰好与其下游的IRR呈反向重复,因而转座酶特异性地作用于这两个位点,而对IRL则不发生作用,其结果是pDZY101整个作为一个的插入序列插入到链霉菌基因组中。另外通过比较插入靶位点的序列,确定为随机插入。

本发明将1354bp的转座酶片段做成地高辛标记探针,对筛选到的链霉菌的基因组DNA进行Southern blot,结果表明pDZY101作为一个转座序列在靶基因组中均只插入一次。

本发明通过PCR,将转座酶3’端18bp的碱基缺失突变后发现转座不能发生。

本发明将IRR和转座酶3’端300bp一起转移至原来IRL的位置,并保持原来位置处的转座酶3’端为缺失突变,结果表明转座特异性地发生在转移之后的转座酶和IRR处。

根据以上结果,本发明证明该转座酶只能特异性地作用于紧靠着的两端反向重复序列。

在上述结果的基础上,本发明还构建了一系列可用于转座的质粒,即pDZY101的衍生质粒，分别记为pDZY102~ pDZY107。

附图说明

图1：转座质粒pDZY101结构图。

图2：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY102结构图。

图3：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY103结构图。

图4：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY104结构图。

图5：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY105结构图。

图6：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY106结构图。

图7：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY107结构图。

图8：质粒pBY102结构图。

图9：IS204转座酶在转座链霉菌时的作用位点鉴定图。其中：

(A)：pDZY101~pDZY107的质粒图谱线形示意图。“α”和“β”分别代表两处可能的转座酶作用区域。“+”和“-”分别代表能或者不能被转座酶识别。(B): 突变部分序列对比图。IRR-1为转座酶尾部及其下游区域23个碱基，其中18个碱基与IRR呈反向重复。IRR-2是在保持转座酶尾部氨基酸序列不变的基础上缺失掉16bp之后序列。

图10：转座突变株总基因组Southern杂交结果。其中：

（A）随机挑选的16株不同转座突变株。1-16分别为转座突变株基因组，17为M145野生型基因组，18为质粒pDZY101XbaI和NheI双酶切后所得3.6kbDNA片段。(B)一株突变株经连续传代后随机挑取16个子代菌株。1-16分别为转座突变株基因组，17为M145野生型基因组，18为质粒pDZY101XbaI和NheI双酶切后所得3.6kbDNA片段。

图11：转座在随机插入示意图。其中：圈外的代表转座子插入后转座酶转录方向与基因组一致，圈内的代表转座酶转录方向与基因组相反。黑色为无表型突变株；紫色是和次级代谢相关的突变株；绿色是和发育相关的突变株；红色是既和发育相关也和次级代谢相关的突变株。

具体实施方式

下面对本发明内容作进一步描述：

1．转座酶DNA片段的获得

培养Nocardia asteroids的孢子，提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6 进行PCR扩增，得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，所产生的条带位于对照DNA Marker的1400bp下方，与预期的1365bp目的基因片段大小接近(含酶切位点和保护碱基)。

2．pDZY101转座质粒的构建

以红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea为模板，引物两端分别设计有XbaI和BamHI的限制性内切酶识别位点，把PCR产物片段与pMD19-T载体做T-A克隆后转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pT-ermE ；以诺卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana) YP21基因组为模板，以引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6扩增转座酶基因片段，引物两端分别设计有BamHI和EcoRI的限制性内切酶识别位点，用BamHI和EcoRI酶切该PCR产物片段和质粒pT-ermE，然后连接所得的两条线性片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pT-ermE-tnp。用XbaI和EcoRI分别酶切质粒pBY102和pT-ermE-tnp，再把所得线性片段用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY101。其结构如图1所示。

3. pDZY101衍生质粒pDZY102~pDZY107的构建

为研究转座酶作用位点的特征，我们在pDZY101基础上设计了一系列衍生质粒pDZY102~pDZY107。

质粒构建过程如下：

以pDZY101为模板，用引物SEQ ID No. 8和引物SEQ ID No. 9PCR扩增质粒pDZY101上的部分片段，用XhoI和XbaI酶切扩增片段，用XhoI和NheI酶切质粒pDZY101，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY102。其结构如图2所示。

以pDZY101为模板，用引物SEQ ID No. 10和引物SEQ ID No. 11PCR扩增质粒pDZY101上的部分片段，用XhoI和XbaI酶切扩增片段，用XhoI和NheI酶切质粒pDZY101，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY103。其结构如图3所示。

以pDZY101为模板，用引物SEQ ID No. 12和引物SEQ ID No. 13、引物SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR扩增质粒pDZY101上的部分片段，再以所得的两条片段为模板，进行overlap PCR得到所要片段，用XhoI和XbaI酶切overlap PCR的产物，用XhoI和NheI酶切质粒pDZY103，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY104。其结构如图4所示。

以pDZY101为模板，用引物SEQ ID No. 16和引物SEQ ID No. 17、引物SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR扩增质粒pDZY101上的部分片段，再以所得的两条片段为模板，进行overlap PCR得到所要片段，用XhoI和XbaI酶切overlap PCR的产物，用XhoI和NheI酶切质粒pDZY103，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY105。其结构如图5所示。

以pDZY101为模板，用引物SEQ ID No. 16和引物SEQ ID No. 17、引物SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR扩增质粒pDZY101上的部分片段，再以所得的两条片段为模板，进行overlap PCR得到所要片段，用XhoI和XbaI酶切overlap PCR的产物，用XhoI和NheI酶切质粒pDZY101，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY106。其结构如图6所示。

以pDZY101为模板，用引物SEQ ID No. 18和引物SEQ ID No. 19、引物SEQ ID No. 14和引物SEQ ID No. 15PCR扩增质粒pDZY101上的部分片段，再以所得的两条片段为模板，进行overlap PCR得到所要片段，用XhoI和XbaI酶切overlap PCR的产物，用XhoI和NheI酶切质粒pDZY103，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY107。其结构如图7所示。

4．质粒pBY102的构建

具体步骤如下：

以质粒pSET152为模板，用引物SEQ ID No.21 和引物SEQ ID No.22 扩增质粒复制起始位点和阿泊拉抗性基因片段，引物两端分别设计有NheI和EcoRI的限制性内切酶识别位点，用EcoRI酶切上述PCR片段，用EcoRI和SmaI酶切质粒pRT802，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。用T₄DNA连接酶连接回收后的两条目的片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pBY102，序列如SEQ ID No. 23所示。其结构如图8所示。

5. 转座系统的应用与插入位点的鉴定

将pDZY101转化至大肠杆菌ET12567, 挑取阳性转化子与天蓝色链霉菌M145接合转移,在28℃培养箱内培养16到20小时后在培养皿上加入一定浓度的硫酸安普霉素，卡那霉素和萘啶酮酸。继续培养4到6天后可观察到单菌落。将得到的单菌落扩大培养后提取总基因组DNA,用限制性内切酶ApaI酶切4 h后,65℃热失活20min ,用T₄DNA连接酶使酶切片段自身环化.连接产物转化大肠杆菌DH5α,用硫酸安普霉素和卡那霉素筛选阳性克隆.培养阳性克隆,提取质粒后用引物测序即可知道转座系统pDZY101插入到天蓝色链霉菌M145基因组中的具体位置。

6.转座系统遗传稳定性研究

随机选取16株转座突变株连同S.coelicolorM145野生株一起扩大培养并抽提基因组，并将总DNA用ApaI完全酶解，以pDZY101上的aac(3)IV基因为探针，进行Southern杂交实验。用XbaI和NheI双酶切质粒pDZY101后得到的3.6kbDNA片段作为阳性对照，以S.coelicolorM145野生型基因组作为阴性对照。

随机选取一株转座突变株，在含有阿伯拉霉素和卡那霉素抗性的SFM平板上进行划线传代，生长4～5天后继续划线转接至新鲜抗性平板上。再生长4～5天。连续在抗性平板上转接3代后，再以同样的方法在无抗性的SFM平板上继续传代4次后，挑取平板上的115个单菌落，转接到含有抗性的MS平板上，全部115个但菌落均能正常生长。初步表明转座子序列在链霉菌基因组中是相对稳定的，不会轻易丢失。从115个菌落中随机挑取16株进行Southern杂交实验。探针，阴性对照和阳性对照同前。

7．转座随机性的研究

将133株S.coelicolorM145转座突变株测序，将它们的表型特征以及在基因组上的插入位点汇总，本发明构建的转座系统能随机地插入到天蓝色链霉菌基因组中。

本发明涉及载体pMD19-T购于宝生物工程有限公司；转座子pDZY101~ pDZY107和质粒pBY102为本发明设计中构建。其结构图如图1-图8所示。其中：

图1转座质粒pDZY101结构图中：

图谱标注	对应基因或功能	位置
			IRL	IS204转座酶的识别位点	1359-1389
aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	2394-3214
			IRR	IS204转座酶的识别位点	3510-3480
aphII	卡那霉素抗性基因	4365-3711
			oriT	接合转移起始点	5092-5203
ermE	红霉素启动子	5532-5658
			trans	IS204转座酶基因	5658-1354

图2转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY102结构图中：

图谱标注	对应基因或功能	位置
			IRR	IS204转座酶的识别位点	249-227
aphII	卡那霉素抗性基因	1375-451
			oriT	接合转移起始点	1832-1943
ermE	红霉素启动子	2272-2398
			trans	IS204转座酶基因	2398-3752
IRR	IS204转座酶的识别位点	3757-3787
			aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	4815-226

图3转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY103结构图中：

图谱标注	对应基因或功能	位置
			IRR	IS204转座酶的识别位点	1347-1373
aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	2378-3198
			IRL	IS204转座酶的识别位点	3494-3464
aphII	卡那霉素抗性基因	4619-3695
			oriT	接合转移起始点	5076-5187
ermE	红霉素启动子	5516-5642
			trans	IS204转座酶基因	5642-1346

图4转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY104结构图中：

图谱标注	对应基因或功能	位置
			IRR	IS204转座酶的识别位点	1347-1373
aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	2378-3205
			trans’	IS204转座酶基因末端约300bp	3205-3513
aphII	卡那霉素抗性基因	4639-3715
			oriT	接合转移起始点	5096-5207
ermE	红霉素启动子	5536-5662
			trans	IS204转座酶基因	5662-1346

图5转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY105结构图中：

	对应基因或功能	位置
			IRL	IS204转座酶的识别位点	1347-1373
aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	2378-3205
			trans’	IS204转座酶基因末端约300bp	3205-3513
IRL	IS204转座酶的识别位点	3514-3543
			aphII	卡那霉素抗性基因	4669-3745
oriT	接合转移起始点	5126-5237
			ermE	红霉素启动子	5566-5692
trans	IS204转座酶基因	5692-1346

图6转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY106结构图中：

	对应基因或功能	位置
			aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	595-5487
IRR	IS204转座酶的识别位点	1630-1600
			trans	IS204转座酶基因	2989-1635
ermE	红霉素启动子	3115-2989
			oriT	接合转移起始点	3555-3444
aphII	卡那霉素抗性基因	4012-4936
			IRL	IS204转座酶的识别位点	5178-5149
trans’	IS204转座酶基因末端约300bp	5486-5182

图7转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY107结构图中：

	对应基因或功能	位置
			aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	595-5248
IRR	IS204转座酶的识别位点	1630-1600
			trans	IS204转座酶基因	2989-1635
ermE	红霉素启动子	3115-2989
			oriT	接合转移起始点	3555-3444
aphII	卡那霉素抗性基因	4012-4936
			IRR	IS204转座酶的识别位点	5227-5207
trans’	IS204转座酶基因末端约16bp	5247-5232

图8质粒pBY102结构图中：

	对应基因或功能	位置
			aphII	卡那霉素抗性基因	1098-174
oriT	接合转移起始点	1555-1666
			int’	整合酶基因部分片段	1957-3163
IRR	IS204转座酶的识别位点	3168-3198
			aac(3)IV	阿泊拉霉素抗性基因	4248-5024
IRL	IS204转座酶的识别位点	5319-5289

<110> 复旦大学

<120> 一种链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用

<130> 001

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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caacggcacc cgaatgggtc gggatgtgcc cgcagtgcgg gcagaaatca tcgcgctcga 180

agggttgggt caccaccaga ccgcgggatg tgcaggtcgg acccgaccgt ccgctgttgg 240

tgtggcggaa acggaaatgg ttgtgcacca atacctcctg tgaccgtaag gtgttcaccg 300

agtcgacgcc gggggtgccg tcccgggcac gggtcacgcc acgagcgaag gcgctgctgg 360

tcgaggcggt cctcgacggg gaccggtcgg tgtccgcggt cgccggcgac tacgggtgcg 420

cctggcacac cgtccacggc cacctcgtcg tggtcgccga cgccgccctg gccggcgagc 480

ctgagccggt gatggtgctc gggatcgatg agacccgacg cgggaaggcg aaatgggaaa 540

cttgccccga gaccggggaa cggagatggg tggaccggtg ggacaccgga ctggtcgacc 600

tgaccggcga tcaagggttg ctggcgcagg tcaacggacg cacctccgcg gtggtgatcg 660

actggttcga cgcccgcgac gagacgtgga aggcacagat cacccatgtc gcgatcgaca 720

tgtcgtcggt gtatgcgaag gcggtgcgcg aggcactgcc gcacgcacaa ctggtggtgg 780

accggttcca cctggtcaag aaggccaacg agatggtcga taccgtccgg cgcagggtca 840

cccaggccga gcggggtcgg cgcggccgca agagcgatgt cgaatggatc aatcgacgac 900

ggttgttgcg ggcctccgaa cgcctgacca acgaacaacg atcggccctg ttcgagaagc 960

tgaccgccgc cgacccgcac ggggacatcg ctgcggcatg gatcgccaaa gaactactgc 1020

gcgatgtgtt gcgctgcacc gatcgtggtg gccttcgcca tgagatccgg gacagactgt 1080

atcggttcta cacgttctgc gcggcatgcc gtgtcccgga gatcggcaag ctggcgacga 1140

ccgtctcggc gtggcaggaa ccgatgatcc tggcgatcac caccggcctg tcgaatgcgc 1200

gcagtgaagg ctacaaccgc atcgtcaagc acgtcggccg tatcgcgttc gggttccgta 1260

ccccggagaa ccaacgccgc cgggtacggt gggcctgcac tcgtcgatca cgtcgggtcg 1320

cacccagccg gcgccaatgc cactgctaac tgcgaattca tttgagggct cttcgcagtt 1380

agcagtggct aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 1440

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 1500

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 1560

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 1620

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 1680

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 1740

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 1800

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 1860

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 1920

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 1980

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 2040

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 2100

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 2160

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 2220

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 2280

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgg ttcatgtgca gctccatcag 2340

caaaagggga tgataagttt atcaccaccg actatttgca acagcgccgg tgatcgtgct 2400

atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt gcaatgtcgt gcaatacgaa tggcgaaaag 2460

ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg gggttacccc cggcggtgtg ctgctggtcc 2520

acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg aagatgggcc acttggactg atcgaggccc 2580

tgcgtgctgc gctgggtccg ggagggacgc tcgtcatgcc ctcgtggtca ggtctggacg 2640

acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg ttacaccgga ccttggagtt gtctctgaca 2700

cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca gcgcccatcc atttgccttt gcggcagcgg 2760

ggccacaggc agagcagatc atctctgatc cattgcccct gccacctcac tcgcctgcaa 2820

gcccggtcgc ccgtgtccat gaactcgatg ggcaggtact tctcctcggc gtgggacacg 2880

atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt tgatggcaaa ggttccctat ggggtgccga 2940

gacactgcac cattcttcag gatggcaagt tggtacgcgt cgattatctc gagaatgacc 3000

actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca ggtggctcaa ggagaagagc cttcagaagg 3060

aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt tgatccgctc ccgcgacatt gtggcgacag 3120

ccctgggtca actgggccga gatccgttga tcttcctgca tccgccagag gcgggatgcg 3180

aagaatgcga tgccgctcgc cagtcgattg gctgagctca tgagcggaga acgagatgac 3240

gttggagggg caaggtcgcg ctgattgctg gggcaacacg tggagcggat cggggattgt 3300

ctttcttcag ctcgctgatg atatgctgac gctcaatgcc gtttggcctc cgactaacga 3360

aaatcccgca tttggacggc tgatccgatt ggcacggcgg acggcgaatg gcggagcaga 3420

cgctcgtccg ggggcaatga gatatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tatcgggccg 3480

cccctaccaa gtgcgaagag cccatttgag ctagctagag tcgacctgca ggtccccggg 3540

gtgggcgaag aactccagca tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg 3600

gaaaacgatt ccgaagccca acctttcata gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga 3660

tggcaggttg ggcgtcgctt ggtcggtcat ttcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac 3720

tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc 3780

acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac 3840

gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag 3900

cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc 3960

tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga 4020

tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc 4080

tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc 4140

cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg 4200

agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg 4260

tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg 4320

tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc 4380

tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca 4440

tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca 4500

atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag 4560

atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag 4620

ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat 4680

cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc 4740

cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc 4800

tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtcgccat 4860

tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac gcccgtgatt ttgtagccct 4920

ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc cgccgccgcc ttttcctcaa 4980

tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg tgggctgccc ttcctggttg 5040

gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac gccggcggta gccggccagc 5100

ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga ataagggaca gtgaagaagg 5160

aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc cggctgacgc cgttggatac 5220

accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt atatcgtgcg aaaaaggatg 5280

gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg ttatgcagcg gaaaagatcc 5340

gtcgacctgc aggcatgctg gcgccggacg gggcttcaga cgtttcgggt gctgggttgt 5400

tgtctctgga cagtgatcca tgggaaacta ctcagcacca ccaatgttcc caaaagaaag 5460

cgcaggtcag cgcccatgag ccaagatcta ggcatgtcgc ccttcatcgc tcccgacgtc 5520

cctgagcacc ttctagatcg cagggtgcac gcggtcgatc ttgacggctg gcgagaggtg 5580

cggggaggat ctgaccgacg cggtccacac gtggcaccgc gatgctgttg tgggctggac 5640

aatcgtgccg gttggtag 5658

<210> 21

<211> 58

<212> DNA

<213>

<400> 21

tagctagctc aaatgggctc ttcgcacttg gtaggggcgg cccgatacgt cgcggtga 58

<210> 22

<211> 58

<212> DNA

<213>

<400> 22

gcgaattcat ttgagggctc ttcgcagtta gcagtggcta atgaatcggc caacgcgc 58

<210> 23

<211> 5326

<212> DNA

<213>

<400> 23

ggggtgggcg aagaactcca gcatgagatc cccgcgctgg aggatcatcc agccggcgtc 60

ccggaaaacg attccgaagc ccaacctttc atagaaggcg gcggtggaat cgaaatctcg 120

tgatggcagg ttgggcgtcg cttggtcggt catttcgaac cccagagtcc cgctcagaag 180

aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa 240

agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc 300

aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa 360

aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga 420

tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc 480

tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct 540

cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc 600

agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac 660

aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca 720

acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc 780

tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc 840

ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag 900

tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt 960

tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc cctgcgccat 1020

cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc aaccttacca 1080

gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc ataaaaccgc ccagtctagc 1140

tatcgccatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct ttgcgcttgc gttttccctt 1200

gtccagatag cccagtagct gacattcatc cggggtcagc accgtttctg cggactggct 1260

ttctacgtgt tccgcttcct ttagcagccc ttgcgccctg agtgcttgcg gcagcgtcgc 1320

cattgatgcg ggccagctcg cggacgtgct catagtccac gacgcccgtg attttgtagc 1380

cctggccgac ggccagcagg taggccgaca ggctcatgcc ggccgccgcc gccttttcct 1440

caatcgctct tcgttcgtct ggaaggcagt acaccttgat aggtgggctg cccttcctgg 1500

ttggcttggt ttcatcagcc atccgcttgc cctcatctgt tacgccggcg gtagccggcc 1560

agcctcgcag agcaggattc ccgttgagca ccgccaggtg cgaataaggg acagtgaaga 1620

aggaacaccc gctcgcgggt gggcctactt cacctatcct gcccggctga cgccgttgga 1680

tacaccaagg aaagtctaca cgaacccttt ggcaaaatcc tgtatatcgt gcgaaaaagg 1740

atggatatac cgaaaaaatc gctataatga ccccgaagca gggttatgca gcggaaaaga 1800

tccgtcgacc tgcaggcatg ctggcgccgg acggggcttc agacgtttcg ggtgctgggt 1860

tgttgtctct ggacagtgat ccatgggaaa ctactcagca ccaccaatgt tcccaaaaga 1920

aagcgcaggt cagcgcccat gagccaagat ctaggcatgt cgcccttcat cgctcccgac 1980

gtccctgagc accttctaga cactgttcgc gtcttcctgt acgcgcgtca gtctaagggc 2040

cggtccgacg gctcagacgt gtcgaccgaa gcacagctag cggccggtcg tgcgttggtc 2100

gcgtctcgca acgcccaggg gggtgcgcgc tgggtcgtgg caggtgagtt cgtggacgtc 2160

gggcgctccg gctgggaccc gaacgtgacc cgtgccgact tcgagcgcat gatgggcgaa 2220

gtccgcgccg gcgaaggtga cgttgtcgtt gtgaatgagc tttcccggct cactcgcaag 2280

ggcgcccatg acgcgctcga aatcgacaac gaattgaaga agcacggcgt gcgcttcatg 2340

tcggttcttg agccgttcct tgacacgtct acccctatcg gcgtcgccat tttcgcgctg 2400

atcgctgccc ttgcgaaaca ggacagtgac ctgaaggcgg agcgcctgaa gggtgcgaaa 2460

gacgagattg ccgcgctggg tggcgttcac tcgtcttccg ccccgttcgg aatgcgcgcc 2520

gtgcgcaaga aggtcgataa tctcgtgatc tccgttcttg agccggacga agacaacccg 2580

gatcacgtcg agctagttga gcgcatggcg aaaatgtcgt tcgaaggcgt gtccgacaac 2640

gccattgcaa cgaccttcga gaaggaaaag atcccgtcgc ccggaatggc tgagagacgc 2700

gccacggaaa agcgtcttgc gtccatcaag gcacgtcgcc tgaacggcgc tgaaaagccg 2760

atcatgtggc gcgctcaaac ggtccgatgg attctcaacc atcccgcaat cggcggtttc 2820

gcattcgagc gtgtgaagca cggtaaggcg cacatcaacg tcatacggcg cgaccccggc 2880

ggcaagccgc taacgcccca cacgggcatt ctcagcggct cgaagtggct tgagcttcaa 2940

gagaagcgtt ccgggaagaa tctcagcgac cggaagcctg gggccgaagt cgaaccgacg 3000

cttctgagcg ggtggcgttt cctggggtgc cgaatctgcg gcggctcaat gggtcagtcc 3060

cagggtggcc gtaagcgcaa cggcgacctt gccgaaggca attacatgtg cgccaacccg 3120

aaggggcacg gcggcttgtc ggtcaagcgc agcgaactgg acgaattcat ttgagggctc 3180

ttcgcagtta gcagtggcta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 3240

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 3300

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 3360

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 3420

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 3480

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 3540

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 3600

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 3660

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 3720

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 3780

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 3840

tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 3900

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 3960

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 4020

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 4080

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttggt tcatgtgcag 4140

ctccatcagc aaaaggggat gataagttta tcaccaccga ctatttgcaa cagtgccgtt 4200

gatcgtgcta tgatcgactg atgtcatcag cggtggagtg caatgtcgtg caatacgaat 4260

ggcgaaaagc cgagctcatc ggtcagcttc tcaaccttgg ggttaccccc ggcggtgtgc 4320

tgctggtcca cagctccttc cgtagcgtcc ggcccctcga agatgggcca cttggactga 4380

tcgaggccct gcgtgctgcg ctgggtccgg gagggacgct cgtcatgccc tcgtggtcag 4440

gtctggacga cgagccgttc gatcctgcca cgtcgcccgt tacaccggac cttggagttg 4500

tctctgacac attctggcgc ctgccaaatg taaagcgcag cgcccatcca tttgcctttg 4560

cggcagcggg gccacaggca gagcagatca tctctgatcc attgcccctg ccacctcact 4620

cgcctgcaag cccggtcgcc cgtgtccatg aactcgatgg gcaggtactt ctcctcggcg 4680

tgggacacga tgccaacacg acgctgcatc ttgccgagtt gatggcaaag gttccctatg 4740

gggtgccgag acactgcacc attcttcagg atggcaagtt ggtacgcgtc gattatctcg 4800

agaatgacca ctgctgtgag cgctttgcct tggcggacag gtggctcaag gagaagagcc 4860

ttcagaagga aggtccagtc ggtcatgcct ttgctcggtt gatccgctcc cgcgacattg 4920

tggcgacagc cctgggtcaa ctgggccgag atccgttgat cttcctgcat ccgccagagg 4980

cgggatgcga agaatgcgat gccgctcgcc agtcgattgg ctgagctcat gagcggagaa 5040

cgagatgacg ttggaggggc aaggtcgcgc tgattgctgg ggcaacacgt ggagcggatc 5100

ggggattgtc tttcttcagc tcgctgatga tatgctgacg ctcaatgccg tttggcctcc 5160

gactaacgaa aatcccgcat ttggacggct gatccgattg gcacggcgga cggcgaatgg 5220

cggagcagac gctcgtccgg gggcaatgag atatgaaaaa gcctgaactc accgcgacgt 5280

atcgggccgc ccctaccaag tgcgaagagc ccatttgagc tagcta 5326

Claims

1.一对IS204的转座酶识别序列，其特征在于为IRL和IRR位点，其序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。

2.一个用于转座的质粒，其特征在于由基于权利要求1所述的转座酶识别位点序列所构建，序列如SEQ ID No. 20所示，记为pDZY101。

3.如权利要求2所述转座质粒的相应元件，其特征在于包括质粒复制起始位点、抗药性基因、转座酶基因、接合转移起始位点、红霉素启动子以及转座酶识别位点IRL、IRR^-1和IRR。

4.如权利要求2所述转座质粒的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

以红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea为模板，用引物SEQ ID No. 3和引物SEQ ID No. 4扩增红霉素启动子片段，引物两端分别设计有XbaI和BamHI的限制性内切酶识别位点，把PCR产物片段与pMD19-T载体做T-A克隆后转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pT-ermE ；以诺卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana) YP21基因组为模板，以引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6扩增转座酶基因片段，引物两端分别设计有BamHI和EcoRI的限制性内切酶识别位点，用BamHI和EcoRI酶切该PCR产物片段和质粒pT-ermE，然后连接所得的两条线性片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pT-ermE-tnp；用XbaI和EcoRI分别酶切质粒pBY102和pT-ermE-tnp，再把所得线性片段用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZY101。

5.如权利要求2所述转座质粒的衍生质粒，记为pDZY102~ pDZY107，其特征在于：

在衍生质粒pDZY102结构图中：

图谱标注对应基因或功能位置 IRR IS204转座酶的识别位点 249-227 aphII 卡那霉素抗性基因 1375-451 oriT 接合转移起始点 1832-1943 ermE 红霉素启动子 2272-2398 trans IS204转座酶基因 2398-3752 IRR IS204转座酶的识别位点 3757-3787 aac(3)IV 阿泊拉霉素抗性基因 4815-226

在衍生质粒pDZY103结构图中：

图谱标注对应基因或功能位置 IRR IS204转座酶的识别位点 1347-1373 aac(3)IV 阿泊拉霉素抗性基因 2378-3198 IRL IS204转座酶的识别位点 3494-3464 aphII 卡那霉素抗性基因 4619-3695 oriT 接合转移起始点 5076-5187 ermE 红霉素启动子 5516-5642 trans IS204转座酶基因 5642-1346

在衍生质粒pDZY104结构图中：

图谱标注对应基因或功能位置 IRR IS204转座酶的识别位点 1347-1373 aac(3)IV 阿泊拉霉素抗性基因 2378-3205 trans’ IS204转座酶基因末端约300bp 3205-3513 aphII 卡那霉素抗性基因 4639-3715 oriT 接合转移起始点 5096-5207

ermE 红霉素启动子 5536-5662 trans IS204转座酶基因 5662-1346

在衍生质粒pDZY105结构图中：

对应基因或功能位置 IRL IS204转座酶的识别位点 1347-1373 aac(3)IV 阿泊拉霉素抗性基因 2378-3205 trans’ IS204转座酶基因末端约300bp 3205-3513 IRL IS204转座酶的识别位点 3514-3543 aphII 卡那霉素抗性基因 4669-3745 oriT 接合转移起始点 5126-5237 ermE 红霉素启动子 5566-5692 trans IS204转座酶基因 5692-1346

在衍生质粒pDZY106结构图中：

对应基因或功能位置 aac(3)IV 阿泊拉霉素抗性基因 595-5487 IRR IS204转座酶的识别位点 1630-1600 trans IS204转座酶基因 2989-1635 ermE 红霉素启动子 3115-2989 oriT 接合转移起始点 3555-3444 aphII 卡那霉素抗性基因 4012-4936 IRL IS204转座酶的识别位点 5178-5149 trans’ IS204转座酶基因末端约300bp 5486-5182

在衍生质粒pDZY107结构图中：

对应基因或功能位置 aac(3)IV 阿泊拉霉素抗性基因 595-5248 IRR IS204转座酶的识别位点 1630-1600 trans IS204转座酶基因 2989-1635 ermE 红霉素启动子 3115-2989 oriT 接合转移起始点 3555-3444 aphII 卡那霉素抗性基因 4012-4936 IRR IS204转座酶的识别位点 5227-5207 trans’ IS204转座酶基因末端约16bp 5247-5232

。